全 文 ：作者简介 姜显光（1979-），男，辽宁朝阳人，讲师，硕士，从事天然产
物分析研究工作。
收稿日期 2013-12-17
马蔺叶中黄酮的超声提取工艺优化及抗氧化性能的测定
姜显光 侯冬岩 翁 霞 王翠艳
（鞍山师范学院化学与生命科学学院，辽宁鞍山 114005）
摘要 在 30℃条件下，采用 L9（34）正交试验优化马蔺叶中黄酮的最佳提取工艺，最佳提取条件如下：乙醇浓度 60%，料液比 1∶30，提取
次数 3 次，提取时间 30 min。在此条件下，测得马蔺叶中黄酮的含量为 9.25 mg/g，回收率为 93.15%~103.92%，变异系数小于 2.32%。用流动
注射化学发光法试验发现，马蔺叶的抗氧化性能较强。
关键词 马蔺；黄酮；超声波法；抗氧化性；流动注射化学发光
中图分类号 S567.23+9 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2014）02-0301-03
Process Optimization for Ultrasonic Extraction of Lavonoids and Determination of Antioxidation Effect in Iris lactea Pall.
Var. chinensis Koidz
JIANG Xian-guang HOU Dong-yan WENG Xia WANG Cui-yan
（School of Chemistry and Life Science，Anshan Normal University，Anshan Liaoning 114005）
Abstract Under the condition of 30 ℃，the orthogonal test of L9（34）was used to optimize the extracting process for flavonoids in Iris lactea Pall.
Var. chinensis Koidz，the most optimizational condition was as follows：ethanol concentration was 60%，the ratio of raw material and solvent was 1 ∶30，
extraction times was 3，extraction time was 30 minutes.Under this condition，concent of flavonoids in Iris lactea Pall. Var. chinensis Koidz was 9.25 mg/g，
the recoveries were 93.15%~103.92%，the coefficient of variation was no more than 2.32%. The antioxidation effect of Iris lactea Pall. Var. chinensis
Koidz was determinated by the flow -injection chemiluminescence. The results showed that Iris lactea Pall. Var. chinensis Koidz had a strong
antioxidation effect.
Key words Semen Iris Pall. Var. chinensis Koidz；flavonoids；ultrasonic method；antioxidation effect；flow-injection chemiluminescence
马蔺 （Iris lactea Pall. Var. chinensis Koidz）系鸢尾科植
物，分布于东北、华北、西北及山东、安徽、浙江、江苏、江西、
福建、河南、湖北等省区 [1]。马蔺根系发达，适应性广，具有耐
涝、耐践踏、耐盐碱、抗病虫害、耐贫瘠等特点，是荒漠化治
理、盐碱地改良、水土保持护坡、公园和路旁绿化的地被植
物和花卉 [2]。黄酮类化合物具有抗氧化、抗衰老、清除人体中
的超氧离子自由基、增强机体免疫力、降血糖、降血脂、抗肿
瘤等多种生理活性 [3-4]。该文对马蔺中黄酮类化合物进行提
取和定量分析[5]，测定其抗氧化能力，以促进其开发利用。
1 材料与方法
1.1 试验材料
供试材料为马蔺叶，产地为辽宁省鞍山市。主要试剂有
NaNO2、Al（NO3）3、NaOH、无水乙醇，以上均为分析纯；纯净
水；芦丁（中国药品生物制品检定所，含量 92.5%）；邻苯三
酚溶液：用 0.01 mol/L HC1 配成 0.01 mol/L 储备液，使用前
用水稀释浓度为 5×10-5 mol/L[5]；0.01 mol/L Na2CO3·NaHCO3
缓冲溶液 ：用前新鲜配制 ，pH 值为 9.95；Luminol 溶液：用
0.05 mol/L NaOH 溶液配成 0.05 mol/L，于避光处保存 [3-6]。主
要仪器有 KQ-250B 型超声波（昆山市超声仪器有限公司）、
TU-1201 紫外分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公
司）、IFFM—D 型流动注射化学发光仪（西安瑞迈电子科技
有限公司）、RE-52A 旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）。
1.2 提取方法
将马蔺叶晒干，粉碎，过 80 目筛，称取 5.00 g，置于索氏
提取器中，用石油醚脱色、脱脂，过滤 [5-7]。滤渣置于锥形瓶
中，按料液比 1∶30加入 60%乙醇，超声 3 次，每次 30 min，合
并滤液，蒸干溶剂，用 60%乙醇 200 mL溶解，待测。
1.3 芦丁标准溶液的配制及标准曲线的绘制
称取芦丁标准品 0.020 0 g，加 60%乙醇溶解，置于 100
mL 容量瓶中，用 60%乙醇定容，摇匀，备用 [4-5]。准确吸取芦
丁标准品溶液 0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 于 10 mL 容量瓶
中，分别加 2 mL 60%乙醇，加 0.4 mL 5%亚硝酸钠溶液，摇匀，
静置 6 min，加 0.4 mL 10%硝酸铝溶液，摇匀，静置 6 min，再
加 4 mL 1 mol/L 氢氧化钠溶液，用 60%乙醇定容，摇匀，静置
10 min[5，7-11]。于 510 nm 测其吸光度。
1.4 吸收波长的测定
移取一定量的标准品溶液、样品溶液，分别置于 10 mL
容量瓶中，各加 2 mL 60%乙醇，加 0.3 mL 5%亚硝酸钠溶液，
摇匀，静置 6 min，加 0.3 mL 10%硝酸铝溶液，摇匀，静置 6
min，再加 4 mL 1 mol/L 氢氧化钠溶液，用 60%乙醇定容，摇
匀，静置 10 min[5-10]。以 0.3 mL 5%亚硝酸钠溶液、0.3 mL 10%
硝酸铝溶液、4 mL 1 mol/L 氢氧化钠溶液，用 60%乙醇定容，
得到的溶液作为参比溶液，在 400～800 nm 扫描，得到其吸
收光谱，最大吸收波长为 510 nm[11-13]。
1.5 样品分析
按 1.2 中方法，提取马蔺中的黄酮，按 1.4 方法显色，在
510 nm 测定吸光度。
1.6 抗氧化性能的测定
1.6.1 邻苯三酚-碳酸盐缓冲溶液-鲁米诺发光体系及其测
定。在比色管中加入 5×10-5 mol/L 邻苯三酚溶液、pH 值为
9.95 的碳酸盐缓冲溶液（含 0.2 mmol/L 鲁米诺），启动流动
注射发光仪，流速 2.5 mL/min，测邻苯三酚-碳酸盐缓冲溶液-
鲁米诺发光体系的发光，测 3次，取平均值进行定量 [4，6-10]。
1.6.2 抗氧化性能测定及抑制率计算 [4，10-17]。按1.5.1 所采用
的发光体系，测定不同浓度的马蔺样品抑制后的发光，分别
测 3 次，取平均值，定量，以邻苯三酚-碳酸盐缓冲溶液-鲁
米诺发光体系的发光强度为空白发光值，可算出马蔺样品
食品科学现代农业科技 2014年第 2 期
301
食品科学 现代农业科技 2014年第 2期
抑制后抑制发光的程度 [5，14-16]。
抑制率（%）=空白发光值-加马蔺样品后的发光值
空白发光值
×100
1.6.3 马蔺样品抗氧化性能的测定。在 1.5.1 的条件下，对
0.12、0.20、0.40、0.80、1.00、1.60、2.00、2.80、4.00 mg/mL 样 品
溶液进行试验[5，8-9]。
1.6.4 马蔺样品抗氧化性能的阳性试验。在 1.5.3 条件下，
在样品中加入芦丁标准品，将其分别稀释为 0.22、0.30、0.50、
0.90、1.10、1.70、2.10、2.90、4.10 mg/mL 溶液进行试验。
1.7 正交试验
1.7.1 乙醇浓度考查。称取 5.00 g 的马蔺样品 3 份，分别以
纯水、60%乙醇、80%乙醇按 1.2 的方法进行提取 2 次。
1.7.2 料液比的考查。称取 5.00 g 马蔺样品 3 份 ，分别用
60%乙醇按料液比 1∶10、1∶20、1∶30，按 1.2 的方法提取 2 次。
1.7.3 正交因素的考查。根据以前的文献和单因素试验结
果，确定正交试验条件：在 30 ℃条件下，对乙醇浓度（A）、料
液比（B）、提取次数（C）、提取时间（D）等因素进行考查，如表
3 所示。称取 9 份马蔺样品，每份 7.00 g，按表 1 正交设计方
法进行试验，按 1.4方法显色。
2 结果与分析
2.1 标准曲线的绘制
以浓度（X）为横坐标、吸光度（Y）为纵坐标，绘制标准曲
线，得其线性回归方程为：Y=0.011 4X+0.033 7，相关系数 r=
0.999 5，对照品在 10～100 μg/mL范围内呈良好线性关系[15-16]。
可按标准曲线法进行定量分析。
2.2 方法精密度试验
按照 1.2 方法制备 5 个浓度的马蔺叶样品溶液，在 510
nm 波长下测定吸光度 9 次，计算出浓度和平均值，求得其
标准偏差及变异系数，结果见表 2。马蔺叶样品溶液浓度测
定平均值分别为 34.69、38.32、53.35、66.18、70.54 μg/mL，相
对标准偏差分别为 1.01%、2.32%、1.42%、1.41%、1.19%。
2.3 加标回收率试验
称取 3 个不同质量的马蔺叶样品，按 1.2 提取方法，计
算其黄酮的含量，分别在马蔺样品中加入芦丁标准品 ，按
1.2 提取方法进行提取，结果见表 3。3 个不同质量的马蔺
叶样品中黄酮含量分别为 40.37、46.25、52.38 mg，加入芦丁
后，黄酮含量分别为 42.26、53.26、53.49 mg，回收率分别为
93.15%、103.92%、93.22%。
2.4 稳定性试验
用于绘制吸收曲线相同的方法配制样品进行稳定性试
验，结果表明：样品放置 24 h，其吸光度值不变 [10-11]。
2.5 样品分析
通过线性回归方程计算，得马蔺中黄酮类化合物的含
量为 9.25 mg/g。
2.6 马蔺样品抗氧化性能测定及抑制率计算
如图 1所示，随着浓度的增加，抑制率不断增加，相对发
光值不断降低[17-19]。抑制率为 50%的马蔺浓度为 0.80 mg/mL。
2.7 马蔺样品抗氧化性能的阳性试验
结果表明，抑制率为 50%的样品浓度为 0.95 mg/mL，抑
制率有所提高，因此起到抗氧化性能的为黄酮。
2.8 正交试验确定提取条件
2.8.1 乙醇浓度考查。根据 1.7.1 方法，测定提取率分别为
4.37、8.84、7.25 mg/mL，据试验结果可知，随着乙醇浓度的增
加，提取率先升高后下降，因此确定的乙醇浓度的范围为
60%、70%、80%。
2.8.2 料液比考查。根据 1.7.2方法，测定提取率分别为 6.73、
7.32、8.03 mg/mL，据试验结果可知，随着料液比增加，提取率
逐渐升高，因此确定料液比的考察范围为 1∶10、1∶20、1∶30。
2.9 正交试验结果
提取时间的 F 比最小，以此为标准，确定其他因素显著
性。如表 4、5 所示，根据极差与方差分析，得出利用超声波
法提取马蔺中黄酮最佳提取条件为：A1B3C3D3，即乙醇浓度：
60%，料液比：1∶30，提取次数：3 次，每次提取时间：30 min。
3 结论与讨论
通过正交试验优化超声波法提取马蔺中的黄酮类化合
物，最佳提取条件为：乙醇浓度：60%，料液比：1∶30，提取次
数：3 次，每次提取时间：30 min。根据此条件测得马蔺中黄
酮类化合物的含量为 9.25 mg/g。回收率为 93.15%~103.92%，
方法精密度的变异系数小于 2.32%。对马蔺的抗氧化性进行
测定的结果表明：随着样品浓度的增加，化学发光强度逐渐
降低，而抑制率逐渐增强，抑制率为 50%的马蔺浓度为 0.80
mg/mL。
水平
因素
乙醇浓度（A）
%
料液比
（B）
提取次数（C）
次
提取时间（D）
min
1 60 1∶10 1 10
2 70 1∶20 2 20
3 80 1∶30 3 30
表 1 正交因素和水平
马蔺叶样品溶液
浓度∥μg/mL
测定值（n=9）
μg/mL
测定平均值
μg/mL
相对标准偏差
（RSD）∥%
35.62 33.57~36.62 34.69 1.01
40.56 39.96~41.38 38.32 2.32
55.24 53.54~56.83 53.35 1.42
65.86 65.15~67.32 66.18 1.41
70.42 68.18~74.98 70.54 1.19
表 2 方法精密度
马蔺叶
样品编号
黄酮质量
mg
芦丁质量
mg
理论值
mg
实测值
mg
回收率
%
1 40.37 5 45.37 42.26 93.15
2 46.25 5 51.25 53.26 103.92
3 52.38 5 57.38 53.49 93.22
表 3 方法回收率
120.00
20.00
40.00
60.00
80.00
100.00
0
0 1.00 4.003.002.00 5.00
抑制率∥%
图 1 马蔺的抗氧化性测定
浓度∥mg/mL
相对发光值
302
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
（上接第 300页）
加 2.0×10-2 mg/kg 和 4.0×10-2 mg/kg 2 个浓度水平的 3 种农
药标准品，涡旋 1 min，放置过夜，再依照 1.3 试验方法进行
前处理上机测定，以较低浓度点的响应值与空白样品中噪
声响应值比值的 3 倍计算仪器检出限，仪器检出限乘以方
法稀释倍数得到方法检出限，每个添加水平平行测定 6 次，
计算其回收率和相对标准偏差 RSD 值。
2 结果与分析
2.1 方法的线性关系
涕灭威、涕灭威砜、涕灭威亚砜的标准曲线，呈良好的
线性关系，相关系数分别为 0.999 8、0.999 7、0.999 8（表 2）。
2.2 回收率和精密度
涕灭威、涕灭威砜 、涕灭威亚砜的回收率为 80.25%~
102.85%，相对标准偏差为 3.64%~8.67%，方法检出限均低
于 2.5×10-3 mg/kg（表 3）。该方法具有回收率高、精密度好等
特点，能很好地满足实际样本残留分析需要。
2.3 实际样品分析
利用上述试验方法，对 4类不同产地生姜中涕灭威及其
代谢产物残留进行测定，结果见表 4。涕灭威砜和涕灭威亚
砜具有很高的毒性，依据日本肯定列表对两者在生姜中的
限定值均为 0.01 mg/kg，产地 1 生姜涕灭威及其代谢产物明
显超标，不适合食用，建议市场将此产地生姜就地销毁。
3 结论与讨论
研究结果表明，前处理方法快捷、简便、净化效果好。方
法准确性好、精密度高，完全能够满足我国进出口蔬菜中氨
基甲酸酯类农药残留的测定要求。所建立的涕灭威及其代
谢产物残留测定方法对生姜的安全监督意义重大。
4 参考文献
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组分 回归方程 相关系数
涕灭威 Y=225.44X-2.325 0 0.999 8
涕灭威砜 Y=181.22X-1.020 3 0.999 7
涕灭威亚砜 Y=77.98X+3.780 5 0.999 8
表 2 线性回归方程和相关系数
组分
添加量
mg/kg
平均回收率
%
RSD
%
方法检出限
mg/kg
涕灭威 2.0×10-2 96.54 5.62 2.12×10-3
4.0×10-2 80.25 6.13
涕灭威砜 2.0×10-2 102.85 3.64 1.57×10-3
4.0×10-2 98.25 7.21
涕灭威亚砜 2.0×10-2 97.83 8.67 1.68×10-3
4.0×10-2 87.76 4.05
表 3 涕灭威及其代谢产物的检出限、回收率（n=6）
及相对标准偏差
组分 产地 1 产地 2 产地 3 产地 4
涕灭威 0.025 未检出 0.012 未检出
涕灭威砜 0.016 未检出 0.009 未检出
涕灭威亚砜 0.013 未检出 0.008 未检出
（mg/kg）
表 4 生姜中涕灭威及其代谢产物残留的测定结果
处理
乙醇浓度
（A）
料液比
（B）
提取次数
（C）
提取时间
（D）
黄酮含量
mg/g
1 1 1 1 1 4.80
2 1 2 2 2 6.13
3 1 3 3 3 7.24
4 2 1 2 3 5.65
5 2 2 3 1 6.36
6 2 3 1 2 5.86
7 3 1 3 2 5.76
8 3 2 1 3 5.24
9 3 3 2 1 6.51
K1 18.17 16.21 15.90 17.67
K2 17.87 17.73 18.29 17.75
K3 17.51 19.61 19.36 18.13
k1 6.06 5.40 5.30 5.89
k2 5.96 5.91 6.10 5.92
k3 5.84 6.54 6.45 6.04
r 0.22 0.14 1.15 0.15
表 4 正交设计及结果
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考察因素 偏差平方和 自由度 均方 F 比 显著性
乙醇浓度 0.07 2 0.04 1
料液比 1.93 2 0.97 1.40 <0.05
提取次数 2.09 2 1.05 9.50 <0.05
提取时间 0.04 2 0.02 1.70 <0.05
表 5 正交试验的方差分析
姜显光等：马蔺叶中黄酮的超声提取工艺研究及抗氧化性能的测定
303