全 文 ：微 生 物 学 报 38 (5): 38 1 一 3 8 5, 199 8
A c 匆 几五` or b io ols ic a 及抽ic a
樱桃根癌土壤杆菌及其对土壤杆菌素 84
敏感性的研究 `
王 慧敏 隋新华 李健强
(中国农业大学植物病理学系 北京 10 0 0 9 4)
戴秀玉 马德钦
(中国科学院微生物研究所 北京 or O0 8 0)
摘 要 从山东 、 河北 、 辽宁等地樱桃园的樱桃冠痪瘤和土壤样品中分离到 46 株根癌土壤杆
菌 。 经鉴定有 4 株是 七 r 口bac te r iu o tu 阴咤of c ie ns (原生物型 1 ) , 其余 42 株是 注 kr l(z 〕g e ne s( 原
生物型 2) . 这些菌株所诱导的冠痪瘤中均合成胭脂碱 ( n o阅 i ne ) , 属胭脂碱型 iT 质粒的根癌
土壤杆菌 ,并对放射土壤杆菌 8K 4 菌株所产生的土壤杆菌素 84 敏感 。 由于 8K 4 菌株对含胭脂
碱 iT 质粒的根癌土壤杆菌有很好的抑制效果 , 因此 , 用 8K 4 菌株防治樱桃根癌病是有应用前
景的 .
关键词 土壤杆菌 , 樱桃 , iT 质粒 , 土壤杆菌素 84
分类号 9Q 39 [. 9 6 ]
根癌病是一种世界性植物细菌病害 , 由土壤病菌根癌土壤杆菌通过植物根或茎 的伤
口侵人后所形成 的 , 寄主相 当广泛 。 由于其致病机制特殊 , 即病菌含有致病基因的 D N A
片段与植物细胞染色体 D N A 结合 , 并随细胞的分裂而不断复制 , 致使被侵染 的植物组织
无控制地增生成为肿瘤 , 因此 目前还没有很好的化学治疗办法 。 利用不致病的放射 土壤
杆菌 8K 4 菌株防治根癌病是 70 年代发展起来的有效方法 , 它是通过使用 8K 4 菌株 , 保护
植物的伤 口 ,并在伤 口上定殖 , 产生土壤杆菌素 , 阻止和杀死人侵的根癌病菌 。 但是 8K 4
有一定的局限性 , 它只对含有胭脂碱型 iT 质粒的根癌土壤杆菌才有抑制作用 , 对章鱼碱或
农杆碱型菌株无效 。 因此在使用时 , 必须先查 明根癌中根癌病原细菌的类型 , 才能制订针
对性措施 .
大樱桃在我国的栽培面积不断扩大 , 然而根癌病十分严重 , 有的果园发病率达 90 % 以
上 , 严重影响大樱桃植株生长 , 使樱桃产量和品质下降 。 为了对此病害开展生物防治 , 本
研究在病害调查基础上 , 从不同地区采集代表性肿瘤和土壤 , 进行了病原细菌的分离 、 鉴
定 , 并测定分离菌株对土壤杆菌素 84 的敏感性 , 以期对大樱桃根癌病的生物防治提供理
* 北京市自然科学基金资助项 目。
本文作者还有王建辉 、 刘继世 .
收稿日期 : 19 9 6一 12一 1 3
DOI : 10. 13343 /j . cnki . wsxb. 1998. 05. 009
微 生 物 学 报 38卷
论依据 。
1材料和方法
Ll 根癌样品的采集
19 9 3 一 19 9 5 年从山东 、 河北和辽宁等地樱桃病株根部采集冠痪瘤和根围土 , 置塑料袋
内并放冰箱保存 。
L Z 根癌病菌的分离
参照过去使用的方法 川 , 用水将冠痪瘤表面泥土冲洗干净 , 刮去四周腐烂表皮 , 露出
白嫩组织 , 置 75 % 酒精浸 1而 n , 再用 8% 次抓酸钠溶液表面消毒 10而 n , 无菌水漂洗干净
后 , 取一小块置于小 塑料离心管 内 , 用不锈钢棒将其捣碎 , 再加少量无菌水混合 , 冰箱过
夜 。 根 围土的分离是取 10 9 土加 9 0而 灭菌水 , 振荡棍匀 , 备用 。 吸取上清原液及其 1 0 一 ’ 、
10
一 2稀释液 .0 05 耐 , 置 M W川培养基平板上 , 用刮棒涂匀 , 28 ℃培养 5一 d6 , 挑取具有土壤
杆菌特征的单菌落 , 再在 M W 平板上划线纯化三次 , 挑取单菌落移人 Y M A[ 〔l]斜面培养 , 冰
箱保存 。
L 3 致病性试验
采用 向日葵幼苗接种法测定 , 即将盆栽生长的健壮向日葵幼苗 , 待茎长 20 一 3 0 111111 时
用针刺法涂沫接种新鲜培养的测定菌菌苔 , 每株菌接种 3一 5株苗 , 接种后保持一定温湿
度 , 10一 2 0 d 观察记录致病结果 。
1.4 质粒类型测定
根据根癌土壤杆菌诱导形成的冠瘦瘤中所合成的冠痪碱 ( ioP en )类型确定不同根癌土
壤杆菌 iT 质粒的类型 , 本研究采用 o et n 电泳法 2[] , 取向日葵茎上生长约 20 d 的冠痪瘤 1一
g2
, 置小塑料离心管内 , 压出液汁 , 离心 。 上清液用毛细管点在新华 3号滤纸上 , 吹干 , 同时
以胭脂碱 、 章鱼碱和精氨酸标准品作对照 。 在 甲酸 : 乙酸 : 水 (:5 1 5 :8 0) 溶剂 中电泳 1一
Zh
, 电压 4 0 0V , 晾干滤纸 , 再用菲酿一乙醇液染色 , 在紫外光检测仪下观察出现的荧光班
点 , 照相 。
L S 生理生化试验
按过去报道的方法进行菌系的鉴别 , 包括下列几项 : 在选择性培养基上生长 ; 3一酮
葡糖昔产生 ; 生长温度的反应 ; 石蕊牛奶反应 ; 2% 卜厄C l 生长 ; 从赤鲜糖醇 、 乙醇 、 松三
糖产酸 ; 从丙二酸等盐产碱等 l1, ’ 一 ’ }。
1
.
6 根癌土城杆菌对土峨杆菌素 84 敏感性的测定
参照 S ot in e : 法 6[] ,将活化的 8K 4 菌株点种在含产素培养基的平皿上 (产素培养基 : 葡
萄糖 5 9 , 谷氨酸钠 3 9 , M g s o 4 · 7巩 0 0 . 3 9 , 硫胺素 ( B , ) s m g , 生物素 10 0“ g 长H p 0 4 3 9 ,
Na 巩阳闷 19 , (N H {) ZS q 19 , 柠檬酸钠 2 9 , 硫酸亚铁 sm g , 琼脂 10 9 , 水 10 0 0 m l 。 1 12 oC
灭菌 30 而 n 。 每皿接种 3个点 , 28 ℃培养 3一 4 d , 用氯仿蒸气杀死生长的 8K 4 菌株 。 另外 ,
在小试管中加人 0 . 2 m l无菌水 , 加人一小环在 Y M A 斜面上培养 48 h 的致瘤土壤杆菌 , 混合
均匀 , 再倒人 3ml 溶化后冷到 50 ℃ 的软 Y E B 琼脂 l] , 迅速混合 , 立即倒人上述培养皿内 ,
使覆盖成均匀的薄层 , 28 ℃培养 16 一 24 h , 观察抑制圈的出现 。


5期 王慧敏等 : 樱桃根癌土壤杆菌及其对土壤杆菌素84敏感性的研究 85 3
分属于 -A r kizo e gne s, 全部为胭脂碱型 iT 质粒菌株 , 对放射 土壤杆菌 8K 4 产生的土壤杆
菌素敏感 , 这与国外报道的结果相符 。 由此看来 , 大樱桃根癌病用 8K 4 菌株进行防治应该
是有效的 。
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