全 文 ：第 3卷 第 1期 生 物 物 理 学 报
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Vol
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7 1 9 8年 3月 Ma r. 1 9 87
竹红菌甲素对( CHO ) 细胞的光动
力敏化致死效应的研究
郭绳武 唐德江 叶忠全 刘正梅
( 中国科学院生物物理研究所)
提 要
我们首次观察分析了竹红菌甲素对H Co细胞的可见光( 碘钨灯: 全光 、 32 于4 6如 m、 3 50 一4 。。
nm) 动力敏化致死作用 , 并与紫外线照射的作用作了比较 。 竹红菌甲素光动 力 敏化作用所造成
的细胞亚致死和潜在致死损伤较不易被修复 (或累积效应较不明显 ) 。 我们认为该药物的光敏作
用的 “靶” 主要是细胞膜 .
引 言
生物系统的光敏作用的研究始于 os c a r R a a b ( 1 9 0 0 ) 的工作 , 他发现了叮吮敏化可见光
杀死草履虫的事实 。 随后许多人做了大量的工作 , 对海棠素 、 叶绿素 、 叶琳及香豆素这四大
类天然光敏色素以及人工合成的光敏剂共四百余种开展了广泛深入的研究 ’ ` , 2 , , 使得光敏化
作用这一课题已成为新兴学科一光生物学的一个重要领域 。 光敏治疗无论在光生物中还是在
现代医学中都是一个很重要的部分 。 国内外对血叶琳衍生物光疗治癌的研究都很活跃 “` , , 其
光敏作用是需氧并通过单线态氧机制的光动力反应过程 。 8 一 甲氧基吠喃香豆素也已应 用 放
某些皮肤病的光疗临床 , 它的光敏作用是不需氧的自由基反应过程 , 但香豆素的生物毒性付
作用越来越令人担心 ’ ` ’ 。
竹红菌甲素 ( H y p o c r e il n A ; 以下简称 H A ) 为我国首创的一种光敏治疗药物 , 临床试验证
明 , 它对妇女外阴 白色病变和瘫痕疙瘩等一些顽难症状有显著的光疗效果 ` 4 , ” , 。 H A是 从 寄
生放箭竹上的竹红菌〔 H v P o e r e l l a b a m b u s a e ( B . e t B r . ) s a e e ;主要产放我国 。 斯里兰卡略
有生长〕中提取得到的一种非酿衍生物 。 初步的实验研究发现 , H A可使细胞膜受到光动力损
伤 `. , , 对细胞造成光敏致死 , 光化学的研究发现 , H A的光疗作用不涉及单线态氧 , 自敏光
氧化也不涉及单线态氧 。 这表明 H A 的光敏作用有它自身的特色 , 确实是一种优良的光 敏化
药物 〔` , 7 : 。
本文就 H A对 C H o 细胞光动力敏化致死的波长响应范围进行了研究 , 取得了关朴 H A对 细
胞的光动力敏化致死能力的定量 的了解。 同时与紫外线照射的致死效应作了比较 , 并就两者
的细胞致死的不同机制进行了初步讨论 。
7 0些 物 物 理 学 报 18 7 9年
材料与方法
细胞培养 :整个实验所用细胞为离体培养的O H C (Clli ne s e ha ms ter 。r a vy ) 细胞 , 采用
本实验室通常的方法培养【8 ’ 。
克隆生长 : 实验用处于坪生长期的细胞。 取一定量 (2 。 s m l) 体积的经过计数的细 胞 悬
液 , 接种于60 m m 直径的玻璃培养皿中。 而后放入玻璃真空千燥器 , 通 5 % 的二氧化碳气 1 0~ 1 5
分钟 。 封好干燥器并将其整个放入 37 ℃的培养箱 , 经过 8 一 9天即可形成贴壁生长的细胞 克 隆
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。 经甲醇固定 、 iG e m , a 产。染色处理 , 计数肉眼可见 (约含 50 个以上的细胞 ) 的克
隆。 接种效率 ( P )E 稳定于 5 0 一 7 0% 的水平 。
药物 ( H A ) : 红色结晶的 H A纯 品系由中国科学院感光化学研究所光生物室惠赠 。 其 化
学结构式如图 l所示 `弓’ 。 它具有三个峰值 ( 4 7 5 n m , 5 4 5 n m和 s s s n m ) 的吸收谱 (图 2 ) 和峰位在
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6 O5 n m 的 荧 光 发 射 谱。 因 为 H A 很 难 溶于
水 , 所以采用对细胞无害的二甲基亚矾 ( l o m l)
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先行将H A ( 1 0 o m g ) 溶解 , 经微孔过沪灭菌 , 保存于 4 ℃的黑暗条件下 , 以此作为实验用的
原药 。
给药方式 : 给药时间是在把定量的细胞接种于培养皿并使其在 37 ℃贴壁 ( 2 小时 ) 之后 。
给药浓度为 5 0 9 / m l (约相当于 1 0 “ “ M ) , 在这一浓度下由于药物的化学毒性造成的细 胞 死
亡率不超过 10 % 。 药物接触时间 2 小时 , 接着进行照射 , 照射时先把培养液 (含有 H A ) 弃
去 , 以使细胞充分曝露于光照之下 。 照射结束立 即用生理盐水把药物洗去 , 换以新鲜培养液 ,
作克隆生长培养 。 紫外线 ( U v ) 照射组和可见光照射的对照组不给药。
照射条件 : 紫外线光源采用 s H z 69 型 30 w 灭菌灯 (北京灯泡二厂 ) , 照射样品距灯35 o m ,
可见光光源为 2 5 o w 碘钨灯 , 加沪光片可获得 3 2 0 一 4 6 0 n m (峰值波长 3 8 0 n m ) 和 3 5 0 一 4 9 0 n m (
峰值波长 4 2 0 n m ) 波长的光 , 样品距灯 35 o m 。 用光化剂量计分别测得各个所用光的光剂量 (
注量 ) (。 ’ 。 每个不同的光注量点同时有三个平行样品受照射。
数据处理 ,采用 S h o r P P C 一 1 5 0 0计算机对所得细胞存活率一光注量响应的袜验数据作 “ 多
第1 期 竹红菌甲素对 (r l o C) 细胞的光动力敏化致死效应的研 究
靶单次击中模型 ” 的拟合计算分析 ` , , , 得出细胞存活曲线参数 , 并绘制出与实验点拟合 的理
论存活曲线。
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实验结果
实验结果列于表 1。 从此表可以看到 ,紫外线的照射对 C H O细胞是敏感的 , 随光注t 的增
加细胞存活率很快下降。 可见光 的照射 , 在无任何附加条件而只是光照 (全光 ) 时 , 看不到
C H o 细胞存活率水平的一「降 , 而在有光敏药物 H A ( 5 0 9 / m l) 存在时 , 细胞存活率降低对于
不同波长的光照有着不 同的注量响应 。 在用碘钨灯的 32 0 一 4 6 0n m波长的光照射时 , 细胞存活
率随光注量的增加慢慢有所下降 , 但并不显著 。 而当用全光和 3 5 0 、 4 9 0n m波长的光照射时 ,
随着光注量的增加 , 细胞存活率很快降低 , 而且在这两种光照条件下的降低速率极为接近 。
这一结果表明 , 碘钨灯的可见光对 C H o 细胞没有致死损伤作用 , 3 2 0一 4 6 0波长的光可使 H A对
c H O细胞有一定的光动力敏化作用 , 但不显著 ;使 H A对 C H O细胞产生强烈光动力敏化 作用 的
是 4 6 0 n m波长以上的光 ,而且 46 。一 4 9 0n m 波长的光的作用强度就已与全光的作用强度 相 当 ;在
本文的实验条件下 , H A对 c H O细胞的光动力敏化致死作用与 U v 照射的作用程度也是很接近的
把表 1的结果作 “ 多靶单次击中模型 ” 的存活曲线拟合计算分析 , 得到 U v 照射和在有 H A
存在时全光和 3 5 0 一 4 90n m波长的光照射下的细胞存活曲线参数 , 结果列于表 2 。 因为 3 2 0~ 4 6 0
n m波长的光照射时 , 细胞存活率的降低并不显著 , 所以不宜作此模型的计算分析。 由 表 2 可
对实验结果作定量分析 , 表中 n是外推数 , D 。值代表了细胞的敏感性 , 其意义为细胞存活率
生 物 物 理 学 报8 7 1 9年
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每降低 i e/ 所需的光注量 , D q为准闭值光注量 , 在此注量照射下细胞存活率无显著下降 , 超
过此注量的光照细胞存活率则迅速降低。 在 u v 照射时 D 。 = 8 3 e gr s/ m m Z也就是说 , U v 注量每
增加 83 e r gs /m m “ C H O细胞的存活率就会降低37 % 。 在有 H A存在时全光和 3 5 0 一 4 90n m 波长的
光照时 , C H O细胞表现出相同的敏感性 , 都得到 D 。 二 1 1 6 e r gs / m m “ , 即在这两种光照情况下 ,
光注量每增加 1 1 6e r gs /。 m “时 , c H O细胞的存活率就降低 37 % 。 但是这两种情况下 的外推数 n
值不同 , D q值不同 (两条存活曲线的肩宽不同 ) 。 由此我们还可以得到 , U v 照射和 H A的光
动力敏化对 C H O细胞的致死作用强度之比 , 即两者 D 。值之比 : 83 l/ 16 = o 。 72 这就是 说 , H A 对
C H O细胞的光 (碘钨灯的全光和 3 5 0 一 4 9 0n m波长的光 ) 动力敏化致死的能力相当于 U v 照射时
的 7 2% 。
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图 3 和图 4 分别为 u v 照射和 H A对 C HO细胞的光动力敏化的存活曲线。 由存活曲线图 和
表 2 还可看出 , U v 照射时存活曲线的外推数 n (8 . 38 ) 和准闭值注量 D q l( 7 e r g s/ m m “ ) 都
远比在有 H A且用碘钨灯的全光照射的情况 (n = 2 . 54 , D q = 1 0 9 e r gs m/ m Z) 为大 (前者的 肩
区较宽 ) 。 这表明在低光注量范围内 , H A的光动力敏化作用比 u v 照射对 C H o细胞的致死 作
用还要强 。 _
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第1 期 竹红菌甲素对 ( C HO)细胞的光动力敏化致死效应的研究
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讨 论
实验结果表明 , 只是可见光照射对 C H o 细胞没有致死损伤作用 , 这是合乎情理的 , 因为
组成细胞的所有重要生物大分子都不吸收可见光 , 所以可见光不会对其结构和功能有任何损
伤 。 而当有 H A存在时 , C H O细胞却遭受到相当强烈的可见光动力致死作用 , 其作用 程 度 接
近于紫外线照射的致死损伤作用 (在与 c H O细胞接触的 H A的浓度为 5 0 9 /ml 时 , 相当于 U v
照射作用的72 % ) 。 但是 , H A的光动力敏化作用与可见光的波长密切相关 , 在 4 6 0n m 以下 波
长的可见光不能明显激发 H A的增敏效力。 这是因为 H A在可见光范围的吸收光谱恰好在此波
长 以 _ L ( 见图 2 ) 。 而 4 6 0 一 4 9 0n m (恰好处于 H A最大吸收 4 7 5n m 的范围 ) 波长的光就已能使
H A显示出几乎与全光照射同样的光敏效力 (只是肩区略有差别 ) 。 这说明 , 与大多数 光 敏
化反应 中的情况一样 , H A的光动力敏化作用所涉及的光的波长正是它本身所吸收的波 长 范
围 。 即 , 光能是被 H A本身所吸收 , 而不是被其所敏化的细胞内的生物物质所吸收。
H A吸收光能之后 , 也和一般敏化剂 普 遍 存 在的反应一样 , 会产生 自敏光氧化反应 ,
同时可产生单线态氧 l( 0 2 ) , 而且具有相当高的量子产额 ( > 0 . 2 4) `” 。 但是 , 在 H A对细
胞膜的光动力损伤 的实验研究中发 现 , 使用了 ’ o : 的碎灭剂叠氮钠 ( N a N 3 ) 时 , 并未抑制 细
胞膜的光损伤 `“ , , 说明 H A的光敏化作用不涉及 `仇 。 另外 , 我们在研究 H A对细胞的化 学 毒
性和细胞对 H A的吸收动力学的实验中发现 , 当细胞接触了 H A并有一定量的吸收之后 , 细胞
膜在形态学上的改变是很明显的 , 而且在 2 小时的接触时间内 , H A主要浓集于细胞膜和细胞
质 , 进入细胞核的量很小 (这一实验结果将另文发表 ) 。 由此可以推断 , H A对细胞光动力敏
化致死作用 的 “ 靶” 主要是在细胞膜。
了 4生 物 物 理 学 报 1, 8了年
紫外线照射对细胞的致死效应就完全不同于 H A的光动力敏化作用了 。我们知道 , 细胞遗
传物质脱氧核糖核酸 ( D N A ) 的吸收谱恰好是在紫外线波段 (峰值在 2 6 0n m波长 ) , 所以 , 紫
外线照射的细胞致死效应主要是由于细胞内的 D N A直接吸收了光能而造成其分子损伤 , 诸如
形成胸腺喀吮二聚体 〔` “ ’ 、 D N A一蛋白质交联川 ’ 、 D N A的链断裂 “ 幻 、 以及突变 “ “ ,等损伤 , 从
而造成细胞死亡 。 近年来 , 在紫外光生物学领域研究的重点主要是关于细胞通过什么样的机
制修复其 D N A , 以及在产生突变时错误的修复所可能起的作用 。
我们知道 , 细胞存活曲线的肩宽大小取决于 (或说是反映了 ) 细胞对亚致死和潜在致死
损伤的修复能力 , 它所包含的基本意义是损伤的累积 汇“ , 。 在前面的结果分析中已经指出 , 紫
外线照射和在H A的光动力敏化作用下 , 细胞存活曲线的肩宽有明显的差别 ,前者为后者的 1 . 62
倍 。 这正是因为 , 紫外线照射受损伤的主要是 D N A , 而细胞内有着非常完备的 D N A的修复系
统 , 以确保细胞的正常生存和遗传 。 而由 H A的光动力敏化所造成的损伤主要不是 D N A ,而且
细胞对这种损伤的修复能力也较差 。不难想像 , H A的光动力敏化对细胞造成的损伤大 量 的 是
不可修复的致死损伤 。 显然 , H A的这一特点在其临床的应用上是具有重要意义的 。
今考文献
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本文 19 86年 5月 10 日收到
第 1期 竹红菌甲素对 (H c O) 细胞的光动力敏化致死效应的研究
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计算和神经系统
— 典国加州理工学院 ( C al t ce 拍 的博士生研究计划一九八六年八月 , 美国加州理工学院提出了一项新的令人兴奋的博士生研究计划— 计算和神经系统 ( C o m P u t a t i o n a n d N e u r a l s y s t e m s ) , 简称 C N s 计划 。 这是一项 跨 学科的
研究计划 , 其中心是神经科学 , 也包括物理学 、 计算机科学及工程技术 , 由加州理工学院生
物系 、 工程技术和应用科学系 、 物理系 、 数学系及天文系共同参与的 。 该计划主要从事由类
似于神经系统的元件所构成的分布网络集体计算性质的研究 。 该计划认为 , 神经模拟和计算
研究已开始成为神经科学研究中的主要领域 。 并且 , 在微硬件 ( m i o r o h : r d w o r e) 和大规模
平行算法 ( m 。 。 。 i v e P: r o n e ils m ) 设计中 , 采用集体处理信号和数据分布网络是计算机科学
中正在迅速发展的新技术。
提出计算机和神经系统计划的指导思想是这些看来很不相同的研究领域 , 在事实上都是
高度联系的 。 在一切场合 , 计算总是可 以由一些具有物理学或者网络描述的动态装置来实现
的 。 而这些装置的排列所具有的结构和解剖学都直接地与计算网络的动态性质及要计算的问
题相联系 。 而且 , 在这些研究领域中的大系统一般都具有重复的空间结构 , 而它的功能又与
十分大量的各部分的相互作用所产生的集体性质有关 。 这些性质如何产生 , 正是 C N S计划的
主焦点 。
郭爱克供稿