全 文 ：药 物 生 物 技 术
Pharmaceutical Biotechnology 2014，21(5) :449 ～ 452
山绿茶中黄酮类成分提取纯化工艺研究
尹睿卓，王嘉仡2* ，孟宪生1
* ，包永睿1，王 帅1
(1. 辽宁中医药大学 药学院，辽宁 大连 116600;2. 辽宁省食品药品检验所，辽宁 沈阳 110023)
摘 要 采用正交试验设计，以总黄酮、芦丁提取率和出膏率为指标，优选山绿茶中黄酮类成分的提取工艺;
以总黄酮、芦丁的静态吸附与解吸试验优选大孔吸附树脂型号，动态吸附与解吸试验优选黄酮类成分的纯化工
艺。确定最佳提取工艺为 15 倍量 50%乙醇回流提取 2 次，每次 1 h;最佳纯化工艺为用 D101 树脂，药材树脂用量
比 1∶ 2(1 g药材∶ 2 mL湿树脂) ，以 2 BV /h的体积流量上样，上样液 pH 3，用 7 BV 50%以 2 BV /h乙醇洗脱，得到
精制品中总黄酮含量 50. 22%，芦丁含量 0. 52%。该工艺准确客观，重复性好，可为工业生产提供参考。
关键词 山绿茶;黄酮;正交试验;提取;大孔吸附树脂;纯化;工艺优选
中图分类号 S571. 1 文献标志码 A 文章编号 1005-8915(2014)05-0449-04
山绿茶为冬青科植物海南冬青(Ilex hainanensis Merr. )
的干燥叶，具有清热解毒、消肿止痛、活血通脉之功效。可
用于降血压、降血脂、降胆固醇、冠心病、脑血管意外所致的
偏瘫以及风热感冒、肺热咳嗽、咽喉水肿、扁桃体炎、痢
疾［1］。山绿茶中主要成分为黄酮类、三萜酸类、三萜皂苷
类，香豆素类、绿原酸类［2-5］;黄酮类物质作为其主要活性成
分具有降血脂、抑制前列腺增生、抗非酒精性脂肪肝的作
用［6-8］，然而关于山绿茶中黄酮类成分的提取纯化研究鲜
有报道。本文以高效液相色谱法和紫外分光光度法分别以
总黄酮和芦丁为指标，采用正交实验设计对山绿茶中黄酮
类物质的提取条件进行考察，通过静态与动态吸附-解吸试
验优选其纯化工艺，为确定山绿茶中黄酮类成分的提取纯
化工艺提供依据。
1 实验材料
1. 1 药材与试剂
山绿茶药材(自采于广西南宁，经辽宁中医药大学翟延
君教授鉴定为 Ilex hainanensis Merr. ) ;芦丁对照品(批号:
100080-200707 中国食品药品检定研究院) ;乙醇(天津市科
密欧化学试剂有限公司) ;亚硝酸钠(沈阳化学试剂厂) ;硝
酸铝(天津天河化学试剂厂) ;氢氧化钠(天津福晨化学试
剂厂)。
1. 2 仪器与设备
LC-10Avp高效液相色谱仪(日本岛津) ;UV-1750 型紫
外分光光度计(北京瑞利分析仪器公司) ;ACCULAB ALC-
11C. 4 型电子天平(德国赛多利斯集团) ;HSS 型电子恒温
水浴锅(上海博讯实业有限公司医疗设备厂) ;ＲE-52AA 型
旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂) ;SHZ-DⅢ型循环水式
真空泵(巩义市予华仪器有限责任公司)。
2 实验方法
2. 1 紫外分光光度法测定山绿茶中总黄酮含量
2. 1. 1 对照品制备 精密称取芦丁对照品 8. 06 mg，置于
50 mL的容量瓶中，加入 50%的乙醇溶液溶解，超声，并定
容至刻度，摇匀，得浓度为 0. 161 2 mg /mL 的芦丁对照品
溶液。
2. 1. 2 检测波长的测定 精密吸取对照品溶液 2 mL 于
25 mL量瓶中。加水至 10 mL，分别加 5%亚硝酸钠溶液
1 mL，摇匀，静置 6 min，加 10%硝酸铝溶液 1 mL，摇匀，静
置 6 min，加 4%氢氧化钠试液 10 mL，再加水至刻度，摇匀，
放置 15 min。以相应试剂作空白，照分光光度法，于 400 ～
800 nm测定吸光度。
2. 1. 3 标准曲线的绘制 精密吸取对照品溶液 2. 0，3. 0，
4. 0，5. 0，6. 0，8. 0 mL，分别置于 25 mL 量瓶中，各加水至
10 mL，分别加 5%亚酸钠溶液 1 mL，摇匀，静置 6 min，加
10%硝酸铝溶液 1 mL，摇匀，静置 6 min，加 4%氢氧化钠试
液 10 mL，再加水至刻度，摇匀，放置 15 min。以相应试剂作
空白，照分光光度法，在 505 nm处测定吸光度，最终测定结
果。以浓度(C)为横坐标(X) ，吸光度(A)为纵坐标(Y) ，
做线性回归方程。
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* 收稿日期:2014-02-09 修回日期:2014-03-29
作者简介:尹睿卓(1990-) ，男，辽宁中医药大学研究生，研究方向为中药学。
* 通讯作者:王嘉仡(1968-) ，男，辽宁省食品药品检验所主任药师，研究方向药品、保健食品、化妆品检验检测，E-mail:zdzx024@
163. com;孟宪生(1964-) ，男，辽宁中医药大学教授，研究方向中药组分配伍、代谢组学及药品质量分析，E-mail:mxsvvv@
126. com。
药 物 生 物 技 术 第 21 卷第 5 期
2. 2 高效液相色谱法测定山绿茶中芦丁含量
2. 2. 1 色谱条件 色谱柱:Aglient C18(4. 6 mm × 150 mm，
5 μm)流动相:乙腈-2. 5% 冰醋酸(16 ∶ 84) ;检测波长:
254 nm;柱温:30 ℃;体积流量:1 mL /min。
2. 2. 2 对照品制备 精密称取芦丁对照品 1. 50 mg，置于
100 mL的容量瓶中，加入 70%乙醇溶液溶解，超声，并定容
至刻度，摇匀，得浓度为 15 μg /mL的芦丁对照品溶液。
2. 2. 3 标准曲线的绘制 精密量取芦丁对照品溶液 2，6，
10，12，14，18 μL按上述色谱条件进样测定，以峰面积为纵
坐标(Y) ，芦丁的进样量(μg)为横坐标(X) ，做线性回归
方程。
2. 3 山绿茶黄酮类成分提取工艺优选
取山绿茶药材粗粉 5 g(过 60 目筛)9 份分别置 250 mL
圆底烧瓶中。采用 L9(3
4)正交设计表对山绿茶中黄酮类
成分进行考察;考察提取时间、提取次数、料液比、提取浓度
4 个因素，对每个因素各取 3 个水平。用加权综合评分法，
按“2. 1，2. 2”项方法测定，以总黄酮含量(权重系数为
0. 4)、芦丁含量(权重系数为 0. 4)、出膏率(权重系数为
0. 2)为指标，综合评分确定山绿茶中黄酮类成分最佳提取
条件［9-10］。水平因素见表 1。
Tab 1 The levels and factors in orthogonal experiment
Level
Factors
A
Extraction
time
/h
B
Extraction
times
/ times
C
The ratio
of material
to liquid
D
The concentration
of ethanol
/%
1 1 1 1∶ 10 50
2 2 2 1∶ 15 60
3 3 3 1∶ 20 70
2. 4 山绿茶黄酮类成分纯化工艺优选
2. 4. 1 静态吸附与解吸试验 准确称取处理好并抽滤至
干的各类树脂 1 g，置 100 mL 锥形瓶中，精密加入按上述最
佳提取工艺制备的上样溶液(0. 2 g /mL)25 mL，每隔 10 min
振摇 20 s，持续 2 h，静置 24 h后吸取上清液，按“2. 1，2. 2”项
测定方法测定含量，树脂抽滤至干，边抽滤，边用 100 mL 去
离子水洗涤树脂，50 mL 90%乙醇解吸，测定解吸液浓度。按
下式计算树脂饱和吸附量和解吸率［11-12］。结果见表 2。
Tab 2 Different types of macroporous resin static adsorption quantity and desorption rate
Types of
macroporous resin
Polarity
Flavonoids
absorbance
/(mg /g)
Ｒutin
absorbance
/(mg /g)
Flavonoids
desorption
efficiency /%
Ｒutin
desorption
efficiency /%
NKA-9 Polar 43. 25 0. 42 65. 23 75. 41
Polyamide Polar 62. 10 0. 46 55. 55 70. 87
HPD100 No polar 60. 52 0. 48 75. 47 75. 43
D-101 No polar 76. 89 0. 56 85. 24 80. 23
AB-8 Low polar 75. 25 0. 52 78. 42 82. 56
饱和吸附量(mg /g 干树脂)=〔吸附前溶液浓度
(mg /mL)－吸附后溶液浓度(mg /mL)〕/干树脂量(g)×吸
附液体积(mL)
解吸率% =〔解析液浓度 ×解析液体积〕/〔树脂饱和
吸附量〕× 100%
2. 4. 2 动态吸附与解吸试验
2. 4. 2. 1 最佳上样量考察 取 10 mL D101 树脂湿法上
柱，将 0. 1 g /mL山绿茶提取溶液以 2 BV /h的流速上样，每
10 mL收集一次流出液。测定流出液中总黄酮和芦丁含量。
2. 4. 2. 2 洗脱溶剂浓度考察 分别取 5 份 10 mL D101 树
脂湿法上柱，将 50 mL 0. 1 g /mL 山绿茶提取液，以 2 BV /h
的流速上样，分别用 10%，30%，50%，70%，90 %乙醇各
5 BV以 2 BV /h流速进行洗脱，收集洗脱液，测定含量。
2. 4. 2. 3 上样液 pH值考察 用 HCl、NaOH溶液将 50 mL
0. 1 g /mL山绿茶提取溶液 pH值调成为 2. 0，3. 0，4. 0，5. 0。
取 4 份 10 mL D101 树脂湿法上柱，以流速 2 BV /h 的流速
上样，饱和吸附后用 50%乙醇各 5 BV以 2 BV /h 流速进行
洗脱，收集洗脱液，测定含量。
2. 4. 2. 4 洗脱溶剂用量考察 取 10 mL D101 树脂湿法上
柱，将 50 mL 0. 1 g /mL山绿茶提取液，调节 pH 3，以 2 BV /h
的流速上样，加入 50%乙醇以 2 BV /h 洗脱，每 10 mL 收集
一次洗脱液，测定含量。
3 结果
3. 1 方法学研究结果
3. 1. 1 检测波长测定结果 芦丁对照品在 505 nm处有最
大吸收，故选择紫外检测波长 505 nm。
3. 1. 2 线性试验结果 紫外分光光度法测总黄酮含量:
Y =0. 015 9X －0. 044 7(r =0. 999 6，n = 6) ;芦丁在 12. 896 ～
51. 584 μg /mL范围内线性关系良好。高效液相色谱法测芦
丁含量:Y = 834 612X + 3 761. 9，(r = 0. 999 6，n = 6)。芦丁
在 0. 03 ～0. 27 μg范围内线性关系良好。
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尹睿卓，等:山绿茶中黄酮类成分提取纯化工艺研究
3. 2 正交试验结果
经直观分析和方差分析，影响山绿茶黄酮类成分提取
因素大小顺序为 B ＞ A ＞ C ＞ D，提取次数具有显著性差异，
确定以 A1B2C3D3，为最佳工艺，即 20 倍量 70%乙醇，回流
提取 2 次，每次 1 h;料液比(C)和乙醇浓度(D)的水平之间
差异不大，根据生产实际为节省乙醇，选定 15 倍量为最佳
料液比，以 50%乙醇为最佳提取浓度。因此筛选确定山绿
茶黄酮类成分最佳提取条件为 A1B2C2D1，即 15 倍量 50%
乙醇回流提取 2 次，每次 1 h。
3. 3 静态吸附实验结果
通过静态吸附与解吸试验表明，D101 型树脂的总黄酮
和芦丁的饱和吸附量以及总黄酮解吸率均优于其他型号的
树脂，芦丁解吸率略低于 AB-8 型树脂，最终确定 D101 为
最佳型号树脂。
3. 4 动态吸附与解吸试验结果
3. 4. 1 最佳上样量考察结果 当上柱液体积达到 50 mL
时总黄酮和芦丁明显发生泄漏，最终确定药材树脂用量比
1∶ 2(1 g药材∶ 2 mL湿树脂)。
3. 4. 2 洗脱溶剂浓度考察结果 各洗脱液总黄酮总量分
别为 8. 65，78. 52，90. 12，75. 55，72. 36 mg;芦丁总含量为
0. 15，0. 58，0. 78，0. 73，0. 55 mg。最终确定洗脱乙醇浓度
为 50%。
3. 4. 3 上样液 pH值考察结果 各洗脱液总黄酮含量分别
为 109. 50，120. 21，95. 32，88. 53 mg;芦丁总含量为 0. 88，
0. 96，0. 81，0. 75 mg。最终确定上样 pH值为 3。
3. 4. 4 洗脱溶剂用量考察结果 当收集至第 7 管即 7 BV
时，总黄酮含量和芦丁含量明显降低。最终确定洗脱体积
为 7 BV。
3. 5 山绿茶黄酮类物质纯化工艺验证
按照上述优选的最佳纯化工艺进行优化;按“2. 1，2. 2”
项方法测定总黄酮和芦丁含量。3 次实验得到的精制品中
总黄酮含量为 51. 52%，49. 28%，49. 86%，芦丁含量为
0. 54%，0. 52%，0. 50%，证明该工艺稳定可行。
4 讨论
笔者在正交试验设计之前对山绿茶的提取方法进行了
单因素考察。结果回流、浸渍、超声 3 种提取方式的总黄酮
提取率分别为 1. 812%，1. 254%，1. 598%;芦丁提取率为
0. 025 11%，0. 011 39%，0. 021 46%，故最终选取回流法为
最佳提取方式。
本文采用静态吸附与解吸试验对不同极性大孔吸附树
脂进行考察，最终采用非极性的 D101 大孔吸附树脂。这可
能与芦丁和山绿茶总黄酮的极性有关。黄酮类物质含有邻
苯二羟基酚羟基结构，在酸性条件下会以分子形式存在，而
影响其与树脂的吸附能力，故在动态吸附与解吸试验中考
察上样液的 pH值，最终确定上样液 pH值为 3。
最终确定山绿茶黄酮类物质的最佳纯化工艺:采用
D101大孔吸附树脂，药材树脂用量比 1∶ 2(1 g药材∶ 2 mL湿
树脂)以2 BV/h上样，上样液调节 pH 3，用7 BV 50%乙醇以
2 BV/h洗脱。测定总黄酮为含量 50. 22%，比纯化前提高了
23. 9倍;芦丁含量 0. 52%，比纯化前提高了 20. 3 倍，该方法
准确可行，具有较好的推广前景。
参 考 文 献
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药 物 生 物 技 术 第 21 卷第 5 期
Optimization of Extraction and Purification Technique for Flavonoids
Ingredients from Ilex Hainanensis Merr.
YIN Ｒui-zhuo1，WANG Jia-yi2* ，MENG Xian-sheng1* ，BAO Yong-rui1，WANG Shuai1
(1． School of Pharmacy，Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Dalian 116600，China;2． Liaoning
Institute for Food and Drug Control，Shenyang 110023，China)
Abstract Flavonoids ingredients are the main active ingredients in Ilex hainanensis Merr． In order to make the Ilex hainanensis
Merr． resources better applied，for Ilex hainanensis Merr，the extraction and purification of flavonoids ingredients in process optimiza-
tion use orthogonal experiment design，with flavonoids，rutin extraction rate and the rate of paste as the index，to optimize the
extraction conditions for flavonoids ingredients from Ilex hainanensis Merr． The optimization of static adsorption or desorption test of
macroporous resin type of flavonoids and rutin was conducted． The results showed that the optimal extraction process is 15 times of
50% alcohol，refluxing and extracting for 2 times，1 hours each time;the best purification process is to use D101 macroporous resin，
herbs resin ratio 1∶ 2 (1 g herbs∶ 2 mL wet resin)to the 2 BV /h flow rate of the sample，the sample solution pH value 3，with 7 BV
50% with 2 BV /h ethanol elution，refined products obtained 50． 22% of the flavonoids，rutin content of 0． 52% ． The process is accu-
rate with good reproducibility，which can provide reference for industrial production.
Key words Ilex hainanensis Merr，Flavonoids ingredients，Orthogonal experiment，Extraction，Macroporous resin，Purication，Tech-
櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗
nology optimization
“生物药物研发与创新”青年学者高峰论坛
2014 年 10 月 31 日-11 月 2 日
首届“生物药物研发与创新青年学者高峰论坛”将于 2014 年 10 月 31 日-11 月 2 日在中国南京举办。
主办单位 国家自然科学基金委
协办单位 中国药科大学生命科学与技术学院;中国药科大学科技处;《药物生物技术》、《药学进展》;常州千红生化
制药股份有限公司;江苏省生物化学与分子生物学会
会议主题 1．生物药物的发展趋势、前景预测和展望;2．生物药物研发中的新思路、新技术、新方法;3．生物药物成药
性研究;4．生物药物递药系统研究;5．生物药物安全性评价中的关键问题研究。
日程安排
10 月 31 日 全天报到;地点:古南都明基酒店(玄武门店) ，玄武门 22 － 1 号;电话:025 － 83280000。
11 月 1 日(周六) 上午:开幕式及主题报告;特邀院士报告(詹启敏院士、王广基院士) ;专家报告(吴镭处长，国家自
然科学基金委员会医学科学部) ;下午:专题交流报告。
11 月 2 日(周日) 上午:专题交流报告;下午:专题交流报告及闭幕式。
会议论文征集
会议将汇编《生物药物研发与创新高峰论坛论文集》，欢迎生物药物研究人员积极撰稿。论文全文或摘要均可，Word
文档编辑，论文正文请用宋体 5 号字，投稿 E － mail 至:swywqnluntan@ 163． com。论文择优刊登在《药物生物技术》、《药学
进展》期刊上。征文截止日期:2014 年 10 月 15 日。
会议注册
会议不收会务费，食宿交通费用自理。
住宿预订
本次会议安排在南京古南都明基酒店(玄武门店)住宿。客房优惠价单间为 290元 /间·天(含早餐) ，双人间为 150 /床·天
(含早餐)。请与会代表 10 月 20 日前将《第二轮会议通知回执表》反馈会议秘书处。
会议秘书处联系方式
联系人:金健勤，025-83271398，jjq@ cpu． edu． cn;闫璐颖，025-83271290，ylystudent@ 126． com;
高美风，025-83220372，swywqnluntan@ 163． com;李 谦，025-83271282，leqean@ 163． com。
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