全 文 ：第 19卷第 3期
2005年 9月
上 海 中 医 药 大 学 学 报
ACTAUNIVERSITATISTRADITIONISMEDICALISSINENSISPHARMACOLOGIAEQUESHANGHAI
Vol.19No.3
Sep., 2005
豨莶草抗血栓有效组分筛选研究
侴桂新 1 金若敏 2 王峥涛 1＊ 陈长勋2
1.上海中医药大学中药研究所 (上海 201203) 2.上海中医药大学科研实验中心 (上海 201203)
摘要:目的 筛选出豨莶草抗血栓有效组分。方法 分别以对正常小鼠凝血时间的影响、对冰水 肾上腺素型大鼠血
栓形成的影响和对静脉血栓型大鼠体内血栓形成的影响 3种动物模型为指标 ,采用活性追踪的方法 ,确定豨莶草抗血
栓有效组分。结果 腺梗豨莶部位Ⅱ抗血栓作用最好。结论 腺梗豨莶部位Ⅱ为抗血栓有效组分。
关键词:豨莶草;抗血栓;有效组分
中图分类号:R285.5 文献标识码:A 文章编号:1008 861X(2005)03 0039 03
[基金项目 ] 上海市高等学校科学技术发展基金资助项目
(2000C03)
[作者简介 ] 侴桂新(1956 ),男 ,辽宁沈阳人 ,副研究员 ,博士 ,
主要从事中药活性成分与质量标准研究。 ＊为本文通讯作者。
豨莶草为常用中药 , 始载于唐代《新修本草》。 《中国
药典》(2005年版)收载菊科植物豨莶 Siegesbeckiaorientalis
L.、腺梗豨莶 SiegesbeckiapubescensMakino和毛梗豨莶 Sieg-esbeckiaglabrescensMakino三种植物的地上部分作为中药豨
莶草入药 , 具有祛风湿 、利关节 、解毒之功效。豨莶草中主
要含有二萜类 、倍半萜类 、黄酮类等成分 , 药理学研究表明 ,
豨莶草在心血管系统 、抗炎 、抗病原微生物 、免疫系统以及
抗早孕方面均有良好的活性 [ 1] 。豨莶草传统用于治疗急慢
性风湿性关节炎 、腰腿疼痛等症。 随着现代科学的发展和
研究的日益深入 ,豨莶草的临床应用范围也逐渐扩大 ,用于
治疗的疾病可达十余种 , 尤其是在心血管方面 , 对高血压 、
冠心病 、高胆固醇血症 、脑血管意外后遗症 、面神经瘫痪等
均有较好的疗效。研究表明 ,家兔静脉注射豨莶草提取物 ,
可使血栓湿重明显减轻 , 其抑制率为 51.41%[ 2] 。为阐明
豨莶草抗血栓有效组分 , 本研究通过口服给药途径对豨莶
草抗血栓的作用进行了系统的筛选与分析 , 确定了豨莶草
抗血栓有效组分。
1 材料与方法
1.1 动物 昆明种小鼠 , 合格证号:医动 02 24 3号;SD
大鼠 , 合格证号:医动 02 24 4号。均由上海中医药大学实
验动物中心提供。
1.2 仪器 MR 4型多环血栓检测仪 , 上海斯隆医电设备
有限公司产品;SN-682放射免疫 γ计数器 , 中国科学院上海
原子核研究所日环仪器厂。
1.3 实验用药
1.3.1 药品 丹参注射液 , 上海中西药业股份有限公司 , 批
号:010104;复方丹参片 , 上海雷允上药业有限公司 , 批号:
020802;盐酸肾上腺素注射液(Adr), 上海禾丰制药有限公
司 , 批号:0006017。
1.3.2 3种豨莶草总提物的制备 豨莶(2001年 9月采集 ,
产地安徽 , 由安徽中医学院生药教研室周建理教授鉴定为本
种),腺梗豨莶(2001年 8月采集 , 产地辽宁 , 由沈阳药科大
学药用植物教研室孙启时教授鉴定为本种), 毛梗豨莶(2001年 10月采集 ,产地云南 , 由中国药科大学生药学研究
室张勉博士鉴定为本种),将三种豨莶草分别用 70%乙醇回
流提取 2次 , 合并提取液 ,回收乙醇 , 分别得到三种豨莶草的
总提取物。
1.3.3 腺梗豨莶三个部位的制备 将上述腺梗豨莶的总提
取物用乙醇溶解 ,再用硅藻土拌匀 ,分别用石油醚 、乙酸乙酯
和甲醇进行抽提 , 按极性大小分为部位 Ⅰ (石油醚抽提部
分)、部位Ⅱ (乙酸乙酯抽提部分)和部位 Ⅲ (甲醇抽提部
分)。
1.4 方法
1.4.1 正常小鼠凝血时间测定 [ 3] 取正常小鼠 ,雌雄各半 ,
体重(20±2)g,随机分组 , 灌胃(ig)给药或等容积蒸馏水 ,每
日 1次 ,连续 4 d。末次给药 1 h后 , 摘眼球取血 ,以毛细玻管
法测定凝血时间(CT)。
1.4.2 冰水 肾上腺素型大鼠血栓形成模型造模 [ 3] 取正
常 SD大鼠 ,雌雄各半 , 体重(200±20)g, 随机分为 9组。灌
胃给药或等容积蒸馏水。每日 1次 ,连续 8 d。于第 7日除正
常组外 ,其余各组大鼠皮下注射 Adr, 每次 0.5 mg/kg体重 ,
共 2次 ,间隔 4 h。正常组皮下注射等容积生理盐水。处置
后禁食不禁水过夜。第 8日末次给药 1 h后 , 除正常组外 ,
其余各组大鼠均皮下注射 Adr0.5 mg/kg, 20 min后浸入冰
水中 5min。正常组动物仅皮下注射等容积生理盐水。然
后 ,所有动物用 25%乌拉坦 0.5 ml/100 g体重麻醉后 , 腹主
静脉取血 1 ml, 按照 Chandler体外法立刻将血注入旋转环
内 ,迅速密封。置血栓形成仪上 , 旋转 15 min, 倾出血栓 , 用
滤纸吸干表面鲜血 ,称量血栓湿重;或置血栓形成仪上 , 旋转
15min,倾出血栓 , 用滤纸吸干表面鲜血 ,将血栓条置 80℃烘
箱 1h,恒重后称重 ,即为血栓干重。
1.4.3 静脉血栓型大鼠体内血栓形成模型造模 [ 3] 取正
常 SD大鼠 ,雌雄各半 , 体重(200±20)g, 随机分组 , ig给药
或等容积蒸馏水。每日 1次 ,连续 8 d。末次给药前禁食不
禁水过夜 ,末次给药后 1 h,乌拉坦麻醉(麻醉剂量同前),剖
开大鼠腹部 , 于左肾静脉下方用粗丝线结扎下腔静脉。 2 h
后自结扎处下方 2cm处纵行剖开管腔 , 取出血栓 , 吸干表面
鲜血 ,称重。
1.4.4 对冰水 肾上腺素型大鼠凝血系统的影响测定 取
正常大鼠 ,雄性 , 随机分组。灌胃给药或等容积蒸馏水。每
日 1次 ,连续 8日。于第 7日除正常组外 , 其余各组大鼠皮
下注射肾上腺素 , 每次 0.5 mg/kg体重 , 共 2次 , 间隔 4 h。
正常组皮下注射等容积生理盐水。处置后禁食不禁水过夜。
第 8日末次给药后 1h,除正常组外 , 其余各组大鼠均皮下注
射 Adr0.5mg/kg, 20 min后浸入冰水中 5min。正常组动物
仅皮下注射等容积生理盐水。然后 , 所有动物用乌拉坦麻醉
(剂量同前)后 , 腹主动脉取血 5 ml, 其中 2 ml血注入放有
3.8%枸橼酸钠的试管中(抗凝剂和全血的比例为 1∶9),
3 ml血注入含有消炎痛-EDTA-Na2液 0.2 ml的试管内 , 4℃,
3500 r/min,离心 15 min, 分离血浆。按试剂药盒说明书测定
凝血酶原时间(PT)、凝血酶时间(TT)、白陶土部分凝血活酶
时间(KPTT)和 TXB2。
1.4.5 统计学方法 采用 t检验 ,数据用均数 x±s表示。
2 结果
2.1 三种豨莶草总提物抗血栓作用的比较 对正常小鼠凝
血时间影响的实验结果显示 , 3种豨莶草均可显著延长小鼠
凝血时间 , 其中腺梗豨莶作用更好 ,与豨莶组比有显著性差
异。 3种豨莶草总提物对冰水 肾上腺素型大鼠血栓形成影
响的实验结果表明 , 毛梗豨莶小剂量组 、腺梗豨莶大 、小剂量
组对冰水 肾上腺素造成的 “血瘀 ”大鼠血栓形成有抑制作
用 , 以腺梗豨莶的抑制作用为最强。 3种豨莶草总提物对静
脉血栓型大鼠体内血栓形成影响的实验结果表明 ,毛梗豨莶
小剂量组 、豨莶大 、小剂量组 、腺梗豨莶大 、小剂量组均可抑
制大鼠静脉体内血栓的形成。 (表 1 ～ 3)
上述实验采用一种正常动物凝血时间的测定及两种血
瘀动物模型血栓形成的方法 , 对 3种药典中收载的豨莶草
进行了抗血栓作用的比较 , 结果显示 3种豨莶草总提取物
均有延长小鼠凝血时间及不同的抗血栓的作用 , 其中以腺
梗豨莶抗血栓作用为好 , 为此决定对腺梗豨莶做进一步的
研究。
2.2 腺梗豨莶 3个不同部位提取物抗血栓作用的比较 对
正常小鼠凝血时间影响的实验结果表明 ,部位Ⅱ小剂量能够
显著延长小鼠的凝血时间 , 与部位Ⅰ 、Ⅲ相比较有显著性差
异。对静脉血栓型大鼠体内血栓形成影响的实验结果显示 ,
3个部位均有抗血栓作用 , 各组间作用无显著性差异。 (表
4,表 5)
表 1 3种豨莶草总提物对正常小鼠凝血时间的影响( x±s,
n=10)
组别 剂量(g生药 /kg) CT(s)
正常组
丹参注射液组
毛梗豨莶组
豨莶组
腺梗豨莶组
—
2.3
3.0
1.0
3.0
1.0
3.0
1.0
125.7±29.6
194.8±53.1＊＊
205.6±36.6＊＊
196.4±32.4＊＊
215.9±25.0＊＊
179.3±38.1＊＊
210.3±16.1＊＊
219.8±21.6＊＊■
注:与正常组比较 , ＊＊P<0.01;与腺梗豨莶小剂量组比较 , ■P<
0.05。
表 2 3种豨莶草总提物对冰水 肾上腺素型大鼠血栓形成
的影响 ( x±s, n=10)
组别 剂量(g生药 /kg) 血栓湿重(mg)
正常组
模型组
复方丹参组
毛梗豨莶组
豨莶组
腺梗豨莶组
—
—
1.5
4.8
2.4
4.8
2.4
4.8
2.4
35.1±5.6＊＊
57.6±7.8
39.1±8.2＊＊
51.3±16.9
44.6±15.5＊
48.4±7.1
55.4±11.1
42.6±9.7＊＊
43.3±10.2＊＊■
注:与模型组相比 , ＊P<0.05, ＊＊P<0.01;与腺梗豨莶小剂量比
较 , ■P<0.05。
表 3 3种豨莶草总提物对静脉血栓型大鼠体内血栓形成的
影响( x±s, n=10)
组别 剂量(g生药 /kg) 血栓湿重(mg)
正常组
复方丹参组
毛梗豨莶组
豨莶组
腺梗豨莶组
—
1.5
4.8
2.4
4.8
2.4
4.8
2.4
12.9±9.0
2.9±1.9＊＊
9.1±4.5
7.2±7.9＊＊
6.4±4.8＊＊
3.5±4.2＊＊
5.4±3.4＊＊
5.5±4.4＊＊
注:与正常组比较, ＊P<0.05, ＊＊P<0.01。
表 4 腺梗豨莶 3个部位提取物对正常小鼠凝血时间的影
响( x±s, n=10)
组别 剂量(g生药 /kg) CT(s)
正常组
丹参注射液组
部位Ⅰ
部位Ⅱ
部位Ⅲ
—
2.3
4.0
2.0
4.0
2.0
4.0
2.0
172.1±35.3
229.5±43.5＊＊
160.5±42.0
160.4±33.9 ■■
170.5±29.1
210.4±16.8 ＊
166.2±49.2
178.4±26.0 ■
注:与正常组比 ＊P<0.05, ＊＊ P<0.01;与部位Ⅱ小剂量比较 , ■
P<0.05, ■■P<0.01。
表 5 腺梗豨莶 3个部位提取物对静脉血栓型大鼠体内血
栓形成的影响( x±s, n=10)
组别 剂量(g生药 /kg) 血栓湿重(mg)
正常组
部位Ⅰ
部位Ⅱ
部位Ⅲ
—
2.4
1.2
2.4
1.2
2.4
1.2
10.5±4.1
5.4±4.0＊＊
5.2±2.7＊＊
5.8±4.2＊＊
6.1±2.1＊＊
4.0±2.0＊＊
7.3±3.5＊
注:与正常组比较, ＊P<0.05, ＊＊P<0.01。
表 6 腺梗豨莶部位 Ⅰ 、Ⅱ对冰水 肾上腺素型大鼠体内血
栓形成的影响( x±s)
组别 剂量(g生药 /kg)动物数(n) 血栓干重(mg)
正常组
模型组
部位Ⅰ
部位Ⅰ
部位Ⅱ
部位Ⅱ
—
—
2.4
1.2
2.4
1.2
7
7
7
8
6
7
39.6±8.0＊＊
83.6±6.2
113.4±15.5＊＊
95.8±40.0
56.5±7.0＊＊■■
102.1±47.8
注:与模型组比 , ＊＊P<0.01;与部位 I大剂量比较 , ■■ P<0.01。
为更好地筛选出腺梗豨莶的抗血栓有效部位 , 作者进一
步比较了 3个部位的毒性 ,通过腺梗豨莶 3个部位对小鼠的
急性毒性实验 ,表明部位Ⅲ有一定的毒性 , 其半数致死量为
16.17 g提取物 /kg(相当于 571.4 g生药 /kg), 部位Ⅰ 、Ⅱ无
毒性 ,经测定部位Ⅰ 最大给药量为 20 g提取物 /kg, 相当于
1 626g生药 /kg, 部位Ⅱ最大给药量为 20 g提取物 /kg, 相当
40实验中医
于 1 747 g生药 /kg。因此选择部位 Ⅰ 和Ⅱ , 做进一步的比
较 , 通过腺梗豨莶部位Ⅰ 、Ⅱ对冰水 肾上腺素型大鼠血栓形
成的影响 , 表明部位Ⅱ可显著减轻血栓干重 , 其作用显著强
于部位Ⅰ 。 (表 6)
综合上述结果 , 结合药效与毒理研究 ,部位Ⅱ抗血栓作
用较强且毒性较小 , 为腺梗豨莶抗血栓的有效组分。
2.3 腺梗豨莶抗血栓有效组分的有效剂量及作用机理初步
研究
采用冰水 肾上腺素型大鼠血栓模型 ,对腺梗豨莶抗血
栓有效组分(部位Ⅱ)的有效剂量进行了研究 , 结果表明 , 腺
梗豨莶抗血栓有效组分(部位Ⅱ)可显著减轻血栓湿重和干
重 , 在剂量为 55 mg/kg时有显著意义。(表 7)
腺梗豨莶抗血栓有效组分(部位Ⅱ )对冰水 肾上腺素
型大鼠凝血系统影响的实验结果显示 , 有效组分(部位Ⅱ )
能显著抑制冰水 肾上腺素型大鼠血栓形成 , 显著延长大鼠
凝血酶原时间(PT)、凝血酶时间(TT)、白陶土部分凝血活酶
时间(KPTT),明显降低血中 TXB
2
的含量。 (表 8)
通过腺梗豨莶部位Ⅱ对冰水 肾上腺素型大鼠血栓形成
影响的实验研究 , 确定了腺梗豨莶抗血栓有效组分的剂量在
55 mg/kg为有效剂量。经测定凝血酶原时间(PT)、凝血酶
时间(TT)、白陶土部分凝血活酶时间(KPTT)和 TXB2 , 表明腺梗豨莶抗血栓有效组分是通过抑制大鼠内源性及外源性
凝血系统和抗血小板聚集而发挥抗血栓作用的 , 进一步显示
腺梗豨莶部位Ⅱ应为豨莶草抗血栓作用的有效组分。
表 7 腺梗豨莶部位Ⅱ对冰水 肾上腺素型大鼠血栓形成的
影响( x±s, n=10)
组别 剂量(mg提取物 /kg) 血栓湿重(mg) 血栓干重(mg)
正常组
模型组
复方丹参组
部位Ⅱ
—
—
1.5g/kg
110
55
27.5
169.9±22.0＊＊
428.1±114.9
122.6±24.8＊＊
274.5±77.2＊＊
312.9±73.7＊＊
392.5±62.6
40.7±9.4＊＊
101.7±10.4
48.8±13.6＊＊
64.1±16.3＊＊
68.0±23.7＊＊
106.2±30.1
注:与模型组比较, ＊P<0.05, ＊＊ P<0.01。
表 8 腺梗豨莶有效组分对冰水 肾上腺素型大鼠凝血功能的影响( x±s, n=10)
组别 剂量(mg提取物 /kg) PT(s) TT(s) KPTT(s) TXB2(ng/L)
正常组
模型组
复方丹参组
部位Ⅱ
—
—
1.5g/kg
165
55
16.3±1.4＊＊
12.8±0.8
16.4±1.0＊＊
16.9±1.2＊＊
16.0±0.9＊＊
42.9±5.3＊＊
31.4±2.3
40.1±3.4＊＊
37.2±2.0＊＊
34.9±1.1＊＊
18.0±1.5＊＊
13.3±0.7
17.5±0.9＊＊
16.8±1.1＊＊
16.8±1.1＊＊
76.8±12.0＊＊
264.1±230.1
85.5±29.0＊＊
146.8±79.5＊
113.8±34.3＊＊
注:与模型组比 , ＊P<0.05, ＊＊P<0.01。
3 讨论
豨莶草用于治疗急慢性风湿性关节炎 、腰腿疼痛等症 ,
疗效较好。随着研究的深入 , 豨莶草的临床应用范围也逐渐
扩大 , 用于治疗的疾病可达十余种 ,本研究结果证实通过口
服给药途径 , 豨莶草在抗血栓方面显示良好的活性。
本研究采用一种正常动物凝血时间的测定及两种血瘀
动物模型血栓形成的方法 , 对豨莶草抗血栓的作用进行了系
统的筛选 , 最终筛选出豨莶草抗血栓的有效组分 , 为研制抗
血栓中药新药提供了重要的依据。
参考文献:
[ 1] 张喜云 ,崔颖.豨莶草的化学成分 、药理作用及临床应用研究
[ J] .天津药学 , 2001, 13(6):34 36.
[ 2] 郑占虎 , 董泽宏 , 佘靖.中药现代研究与应用(第 5卷)[ M].
北京:学苑出版社 , 1998.4634 4636.
[ 3] 李仪奎.中药药理实验方法学 [ M].上海:上海科学技术出版
社 , 1991.494 495, 145 146, 496.
编辑:季春来
收稿日期:2005 05 25
StudyonAntithromboticFractionofHerbaSiegesbeckiae
CHOUGui-xin1 JINRuo-min2 WANGZheng-tao1 CHENChang-xun2
1.InstituteofChineseMateriaMedica, ShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine
2.ExperimentalCenterofScientificResearch, ShanghaiUniversity
ofTraditionalChineseMedicineAbstract: Objective ToscreenantithromboticfractionofHerbaSiegesbeckiae.Methods Theclotingtimeanditsefectsonthrombosisintwomodelsofmiceinvivoandvitro.Results InthethreefractionsofSiegesbeckiapubescens, theantithromboticactivityoffractionIIwasthebest.Conclu-
sion FractionIIofSiegesbeckiapubescensistheantithromboticfractionofHerbaSiegesbeckiae.Keywords: HerbaSiegesbeckiae;antithromboticactivity
41实验中医