全 文 :• 150 • 中华中医药杂志(原中国医药学报)2011年1月第26卷第1期 CJTCMP , January 2011, Vol . 26, No. 1
维药罗勒不同提取组分在体外对Ecv304细胞
COX-1活性的影响
何志琴1,阿布力孜•阿布杜拉2,艾尼瓦尔•吾买尔3,周文婷3,依巴代提•吐乎提3
( 1重庆医药工业研究院有限责任公司,重庆 400061;2新疆医科大学生化教研室,乌鲁木齐 830011;
3新疆医科大学药理教研室,乌鲁木齐 830011)
摘要:目的:探讨维药罗勒不同提取组分在体外对环氧化酶-1(COX-1)的合成物6-keto-PGF1α浓度的影
响,间接证明其对COX-1活性的影响,进而找出该药抗血栓的作用机制及其有效部位。方法:将维药罗勒不同提
取组分对Ecv304细胞进行不同时间的药物干预,采用MTT法检测活细胞数目,ELISA法测定细胞上清液中6-keto-
PGF1α的浓度。结果:不同组分在不同时间内对6-keto-PGF1α的浓度有不同的影响,在短时间内,OBL-正丁醇和
OBL-乙醇均能显著增加6-keto-PGF1α的浓度(P<0.01);长时间内,OBL-乙酸乙酯可显著性地降低6-ket-PGF1α的
浓度(P<0.05),而OBL-氯仿和OBL-正丁醇中高剂量可显著增加6-keto-PGF1α的浓度(P<0.01)。结论:维药罗
勒可能通过抑制TXA2合成酶的活性,激活COX-1的酶活性,最终维持TXA2-PGI2的平衡而产生抗血栓作用,正丁醇
提取部位是其发挥激活COX-1酶活性作用的有效部位。
关键词:罗勒;环氧化酶-1;抗血栓;细胞;有效部位;酶活性
基金资助:国家自然科学基金(No.30660210)
Studies of Uighur Ocimum basilicum L. on effective parts and mechanism of
anti-thrombus
HE Zhi-qin1, Abulizi-Abudula2, Ainiwar-Wumair3, ZhouWen-ting3, Ibadet-Tuhti3
(1Chongqing Pharmaceutical Research Institute Co., Ltd., Chongqing 400061, China; 2Department of Biochemistry, Xinjiang
Medical University, Urumqi 830011, China; 3Department of Pharmacology, Xinjiang Medical University, Urumqi 830011, China)
Abstract: Objective: To study the effects of different polar extract of Uighur Ocimum basilicum L. on COX-1 activity
in ECV304 cells in vitro, and fi nd its anti-thrombus mechanism and effective parts. Methods: Ecv304 cells was interfered with
different polar extract of Uighur Ocimum basilicum L. in different time.The number of living cells was detected by MTT method.
And the concentration of 6-keto-PGF1αin supernatant was analyzed by ELISA method.Results: There are different effects of
different polar extract on the concentration of 6-keto-PGF1α in different time. In short, OBL- n-butyl alcohol and OBL-ethanol
can signifi cantly increase the concentration of 6-keto-PGF1α (P<0.01); a long time, OBL-ethyl acetate can signifi cantly reduce
the concentration of 6-keto-PGF1α (P<0.05), whereas OBL-chloroform and OBL-n-butyl alcohol in middle and high doses can
signifi cantly increase the concentration of 6-keto-PGF1α (P<0.01). Conclusion: Uighur Ocimum basilicum L. may inhibit the
activity of TXA2 enzyme and activate the activity of COX-1 enzyme. And then the balance between TXA2 and PGI2 will be
maintained which can cause anti-thrombus. And the extract part of n-butyl alcohol is one of effective parts when activating the
activity of COX-1 enzyme.
Key words: Ocimum basilicum L.; COX-1; Anti-thrombus; Cells; Effective parts; Enzyme activity
Fund assistance: National Natural Science Foundation of China (No. 30660210)
通讯作者:依巴代提•吐乎提,新疆乌鲁木齐市新医路393号新疆医科大学药理教研室,邮编:830011 ,电话:0991-4362421
E-mail:ibadettohti@126.com
·研究报告·
罗勒(Ocimum basilicum L.)是唇形科罗勒属植物,是维
吾尔医[1]应用历史悠久的常用药材,也是心脑血管疾病的首选
药材之一[2]。本课题前期研究发现罗勒提取物具有抗血栓形
成的作用[3],能显著降低大鼠血浆TXB2的浓度和维持TXA2-
PGI2的平衡,PGI2和TXA2主要由环氧化酶-1(COX-1)催化花生
四烯酸(AA)代谢产生的。PGI2是血管内皮细胞的主要产物,
其生物半衰期很短,迅速代谢为6-酮前列腺素PGF1α(6-keto-
PGF1α)。
• 151 •中华中医药杂志(原中国医药学报)2011年1月第26卷第1期 CJTCMP , January 2011, Vol . 26, No. 1
文章通过研究维药罗勒对人脐静脉内皮细胞Ecv304细胞
6-keto-PGF1α生物合成的影响,探讨罗勒对COX-1活性的影响,
进一步找出其抗血栓的作用机制。目前对罗勒药理作用的研究
主要采用的是提取物,研究表明其乙醇提取物往往有更好的效
果,所以文章进一步对维药罗勒的乙醇提取物及4个不同萃取
组分进行研究,筛选出该药的有效部位。
材料与方法
1 . 主 要 仪 器 及 试 剂 低 温 高 速 离 心 机(B e c k m a n
CoulterTM,美国);生物安全柜(HERA safe,德国);倒置荧光
显微镜(Leica,德国);CO2培养箱(HERAEUS,日本);全自动
酶标仪(BECKMAN COULTER AD340)。
胎牛血清FBS(北京元亨金马生物技术,批号:090608);
DMEM干粉培养基(GIBCO公司);四唑盐MTT(Sigma公司);
20×PBS缓冲液(Sigma公司,批号:90320P16);6-keto-PGF1α
ELISA试剂盒(武汉中美科技有限公司,批号:E0700Hu);阿
司匹林(Sigma 公司,批号:200-064-1);双抗(Sigma 公司,批
号:1008074),其他试剂均为国产分析纯。
2. 药物制备 本课题的药材采集于新疆吐鲁番市,品种由
新疆农业大学林学院植物教研室田桂玲教授鉴定。将采集的
罗勒全草阴干后,剪碎,称取适量药材,用70%乙醇室温密闭浸
泡1h后超声30min,提取3次,合并滤液,减压浓缩回收乙醇得
提取物,取部分提取物加适量水分散后,依次用石油醚、氯仿、
乙酸乙酯、正丁醇萃取,包括母液共得到5个不同极性的提取
组分,用OBL-乙醇、OBL-石油醚、OBL-氯仿、OBL-乙酸乙酯、
OBL-正丁醇表示,分别减压浓缩回收各组分溶剂,挥干溶剂
后,进行冷冻干燥。实验时,用二甲基亚砜(DMSO)溶解干燥
物,15 000r/min离心10min,取上清,热压灭菌后,-20℃保存备
用,实验前用DMEM培养基稀释成所需浓度。
3. 细胞培养 人脐静脉内皮细胞Ecv304细胞株购自武
汉大学细胞库(中国典型培养物保藏中心CCTCC)。在37℃,
5%CO2条件下,用含10%FBS、1%双抗的DMEM培养基传代培养[4],
实验用细胞均处于指数生长期。
4. 药物浓度的选择 为保证实验条件的均一性,长时间
药物干预实验中,罗勒各组分药的最大浓度采用预实验即细胞
毒性实验中细胞生长抑制率为90%左右的药物浓度,即OBL-石
油醚、OBL-氯仿、OBL-乙酸乙酯、OBL-正丁醇、OBL-乙醇的最
大浓度分别为50、7.5、50、10、100µg/mL,每种药设3个浓度梯
度,配制时用培养基进行稀释;不同时间药物干预实验中的药
物浓度为前部分实验的中剂量浓度。
5. 维药罗勒提取物对COX-1活性的影响
5.1 长时间干预对COX-1活性的影响 参照文献[5],略改
动。将指数生长期的ECV304细胞按1×105个/mL接种于96孔培
养板中,每孔200μL,设溶剂对照组、阳性药物阿司匹林组及
高、中、低浓度的各提取组分药处理组,每组3复孔,于37℃,
表1 维药罗勒不同提取组分长时间干预对COX-1活性的影响
(x-±s,n=3)
组别
溶剂对照组
阿司匹林
OBL-石油醚
OBL-氯仿
OBL-乙酸乙酯
OBL-正丁醇
OBL-乙醇
浓度(µg/mL)
360
50
10
2
7.5
1.5
0.3
50
10
2
10
2
0.4
100
20
4
6-keto-PGF1α(pg/mL)
710.26±2.33
589.60±4.80*
741.84±70.05
779.23±5.49
775.22±34.41
950.29±37.07**
896.13±16.79**
706.98±35.95
574.66±52.81*
574.66±37.84*
623.63±37.57
968.05±8.82**
930.82±0.82**
809.90±27.51
637.09±3.49
662.82±45.28
637.61±12.75
注:与溶剂对照组比较,*P<0.05,**P<0.01。
5% CO2培养24h。更换培养基后,分别加入各组药物(溶剂对照
组加入0.5% DMSO),继续在37℃,5% CO2培养箱中培养24h
后取出,加入底物AA(终浓度为10μmol/L),37℃孵育30min,
收集细胞上清液,-20℃冻存待测。用MTT法检测活细胞数目,
ELISA法测定上清液中6-keto-PGF1α的浓度。
5.2 不同时间干预对COX-1活性的影响 将指数生长期的
ECV304细胞按1×105个/mL接种于96孔培养板中,每孔200μL,
设3个不同时间组,每组分别再设溶剂对照组和各提取组分药
处理组,每组3复孔,于37℃,5% CO2培养24h。更换培养基后,
加入各组药物(溶剂对照组加入0.5% DMSO),分别孵育1、4、
24h后,加入底物AA(终浓度为10μmol/L),37℃孵育30min,
收集细胞上清液,-20℃冻存待测。用MTT法检测活细胞数目,
ELISA法测定上清液6-keto-PGF1α的浓度。
6. 统计学方法 数据用SPSS 13.0统计软件处理,所有结
果用x- ±s表示,采用方差分析和SNK两两比较,P<0.05为差异
有统计学意义。
结果
1. 长时间干预对COX-1活性的影响 由表1得出,长时间
药物干预后,维药罗勒不同极性提取组分对6-keto-PGF1α的浓
度有不同的影响。与溶剂对照组比较,OBL-石油醚和OBL-乙醇
对其影响较小;OBL-氯仿和OBL-正丁醇中高剂量可显著增加
6-keto-PGF1α的浓度(P<0.01);而OBL-乙酸乙酯则显著降低6-keto-
PGF1α的浓度(P<0.05)。表明罗勒的各提取组分对COX-1的活性有
不同的影响。
2. 不同时间干预对COX-1活性的影响 由表2得出,与溶
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剂对照组比较,在短时间(1、4h)内,OBL-石油醚、OBL-氯仿、
OBL-乙酸乙酯组对6-keto-PGF1α的浓度影响较小,OBL-正丁
醇和OBL-乙醇均能显著增加6-keto-PGF1α的浓度(P<0.01);
24h药物干预后,OBL -正丁醇显著增加6 -keto-PGF1α的浓度
(P<0.01),其他各组对其影响均不明显。表明维药罗勒的乙醇
和正丁醇提取组分在短时间内可直接激活COX-1的酶活性。
的血小板活性内源性抑制剂,具有抑制血小板聚集的作用[6]。
前期研究发现维药罗勒提取物能显著性地降低血浆TXA2的
浓度。合成TXA2的环氧化酶在血小板上主要以COX-1的形式
存在,而本研究发现罗勒可以快调节的方式直接激活COX-1
的酶活性。因此,推测维药罗勒可能通过抑制TXA2合成酶的
活性,降低血浆TXA2的合成;并通过激活COX-1的酶活性,增
加PGI2的合成,最终维持TXA2-PGI2的平衡而产生抗血栓的作
用,正丁醇提取部位是维药罗勒发挥激活COX-1酶活性作用的
有效部位。
本实验以新疆地产罗勒为原料,结合药效学筛选,寻找出
了其抗血栓的可能作用机制,并初步筛选出罗勒产生抗血栓作
用的有效部位,为进一步有效成分的筛选奠定了基础,为有效
开发利用新疆植物资源及研制创新药物提供了科学依据。
参 考 文 献
[1] 新疆维吾尔自治区卫生厅.维吾尔药材标准.新疆:乌鲁木齐:
新疆科技卫生出版社,1993:183-187
The health department of Xinjiang Uygur Autonomous Region.
The standards of Uygur Materia Medica.Xingjiang:Urmqi:Xinjiang
technology and public health publishing company,1993:183-187
[2] 买买提·努尔艾合买提,吐尔洪·艾买尔,等.维吾尔药罗勒
的现代研究进展.中国民族医药杂志,2007:69-72
Maimaiti·Nueraihemaiti,Tu,erhong·Aimaier,et al.The
contemporary study progression of Uighur Ocimum basilicum L..
Journals of Medicine and Pharmacy of Chinese Minorities,2007:
69-72
[3] Tohti I,Tursun M,Umar A,et al.Aqueous extracts of Ocimum
basilicum L.(sweet basil) decrease platelet aggregation induced
by ADP and thrombin in vitro and rats arterio-venous shunt
thrombosis in vivo.Thromb Res,2006,Feb 7,[epub,ahead of print]
[4] 司徒镇强,吴军正.细胞培养.西安:世界图书出版公司,2004:
250-252
SITU Zhen-qiang,WU Zheng-jun.Cell cultivation.Xi,an:World
Publishing Corporation,2004:250-252
[5] Hu Y F,Cheng G F.Establishment of screening models for selective
cyclooxygenase-2 inhibitors.ActaPharm Sin,2000,35(5):343-346
[6] FizGerald G A.Cardiovascular pharmacology of nonselective
nonsteroidal anti-inflammatory drugs and coxibs:clinical
considerations.Am J Cardiol,2002,89(6A):26-32
(收稿日期:2010年7月21日)
6-keto-PGF1α(pg/mL)组别
溶剂对照组
OBL-石油醚
OBL-氯仿
OBL-乙酸乙酯
OBL-正丁醇
OBL-乙醇
浓度(µg/mL)
-
10
1.5
10
2
20
1h
113.73±11.83
121.89±8.47
137.70±9.28
133.48±6.45
178.38±4.97**
225.38±23.79**
4h
165.74±13.60
150.00±11.05
177.74±8.44
182.80±11.01
246.48±15.46**
248.95±19.66**
24h
708.89±22.61
699.29±27.87
848.40±61.96
571.83±19.97
983.32±94.90**
644.24±60.23
表2 维药罗勒不同提取组分短时间干预对COX-1活性
的影响(x- ±s)
注:与同一时间溶剂对照组比较,*P<0.05,**P<0.01。
讨论
药物对由COX-1催化底物外源AA生成6-keto-PGF1α的作
用主要通过以下2种途径:①直接以快调节的方式抑制或激活
COX-1酶活性,导致COX-1催化能力降低或增强,使6-keto-PGF1α
的合成相应地减少或增加。②影响COX-1 mRNA,改变COX-1蛋
白的生成,导致产物6-keto-PGF1α的合成相应地发生变化。通过
此次研究发现,维药罗勒各提取组分对ECV304细胞短时间(1、
4h)干预后,OBL-正丁醇和OBL-乙醇组可显著性地增加细胞培
养上清液中6-keto-PGF1α的浓度(P<0.01)。提示维药罗勒以快
调节的方式促进COX-1催化6-keto-PGF1α的产生,即维药罗勒可
直接激活COX-1酶活性;罗勒各提取组分对ECV304细胞长时间
(24h)干预后,不同组分对细胞培养上清液中6-keto-PGF1α的浓
度具有不同的影响。表明维药罗勒可能影响COX-1 mRNA或改
变COX-1蛋白的生成,导致产物6-keto-PGF1α的合成发生变化,且
各组分发挥该途径的作用可能不同,确切的判断还需进一步对
COX-1 mRNA或COX-1蛋白加以研究。
TXA2和PGI2在维持血管内环境的稳定中发挥了重要的作
用。TXA2首先在血小板合成,在血小板活化时产生增加。这促
进了血小板聚集,血管收缩,导致急性血管闭塞事件的发生。与
TXA2相反,PGI2是一主要的血管扩张剂,也是至今活性最强