全 文 ：* 江西省科技计划项目(20132BBG70039) ;国家药典委员会资助项目
＊＊ 通讯作者 周国平 Tel: (0791)88158676;E － mail:13870868633@ 139． com
付辉政 Tel: (0791)86217386;E － mail:fhzfhz620@ sohu． com
第一作者 Tel: (0791)88158786;E － mail:zhongrj@ jxfda． gov． cn
ＲP － HPLC法同时测定覆盆子药材中
2 个主要黄酮苷成分的含量*
钟瑞建1，郭卿1，2，周国平1＊＊，付辉政1＊＊
(1．江西省食品药品检验所，江西省药品与医疗器械质量工程技术研究中心，南昌 330029;
2．江西中医药大学，南昌 330004)
摘要 目的:建立同时测定覆盆子药材中山柰酚 － 3 － O －芸香糖苷和山柰酚 － 3 － O － β － D －吡喃葡萄糖苷含量的高效液相
色谱法。方法:采用 Welch C18(250 mm × 4. 6 mm，5 μm)色谱柱，流动相为乙腈 － 0. 2%磷酸溶液(15 ∶ 85) ，流速 1. 0 mL·
min －1，检测波长 344 nm。结果:山柰酚 － 3 － O －芸香糖苷和山柰酚 － 3 － O － β － D －吡喃葡萄糖苷进样量分别在 0. 0789 ～
1. 1835 μg(r = 0. 9999)和 0. 0233 ～ 0. 3495 μg(r = 0. 9998)范围内与峰面积呈良好线性关系;平均回收率(n = 6)分别为
101. 9%和 97. 3%，ＲSD分别为 0. 7%和 0. 6%。结论:本法经过方法学验证，可用于覆盆子药材的质量控制。
关键词:覆盆子;山柰酚 － 3 － O －芸香糖苷;山柰酚 － 3 － O － β － D －吡喃葡萄糖苷;黄酮苷;反相高效液相色谱法;方法验证
中图分类号:Ｒ917 文献标识码:A 文章编号:0254 － 1793(2014)06 － 0971 － 04
ＲP － HPLC simultaneous determination of two main flavonoid
glycoside components in Ｒubus chingii Hu*
ZHONG Ｒui － jian1，GUO Qing1，2，ZHOU Guo － ping1＊＊，FU Hui － zheng1＊＊
(1． Jiangxi Provincial Institute for Drug and Food Control，Jiangxi Provincial Engineering Ｒesearch
Center for Drug and Medical Device Quality，Nanchang 330029，China;
2． Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine，Nanchang 330004，China)
Abstract Objective:To establish a method for the simultaneous determination of the contents of kaempferol － 3 －
O － rutinoside and kaempferol － 3 － O － β － D － glucopyranside in Ｒubus chingii Hu by HPLC．Methods:The sepa-
ration was performed in a Welch C18(250 mm ×4. 6 mm，5 μm)column with a mobile phase of acetonitrile － 0. 2%
phosphoric acid solution (15∶ 85)． The flow rate was 1. 0 mL·min －1，and the detecting wavelength was 344 nm．
Ｒesults:The linear ranges of kaempferol － 3 － O － rutinoside and kaempferol － 3 － O － β － D － glucopyranside were
0. 0789 － 1. 1835 μg (r = 0. 9999)and 0. 0233 － 0. 3495 μg (r = 0. 9998) ，respectively． The average recoveries
(n = 6)were 101. 9% (ＲSD = 0. 7%)and 97. 3% (ＲSD = 0. 6%) ，respectively． Conclusion:The method was
validated． It can be used for quality control of Ｒubus chingii Hu．
Key words:Ｒubus chingii Hu;kaempferol － 3 － O － rutinoside;kaempferol － 3 － O － β － D － gluco pyranside;fla-
vonoid glycoside;ＲP － HPLC;method validation
覆盆子为蔷薇科植物华东覆盆子 Ｒubus chingii
Hu的干燥果实，主要分布于浙江、江西、安徽及贵州
等地，具有补肾、固精、明目之功效，用于肾虚遗尿、
小便频数、阳痿早泄、遗精漏精等症的治疗［1 － 2］。覆
盆子所含化学成分较复杂，迄今已报道的从覆盆子
果实和叶中分离得到的化学成分包括酚酸类、黄酮
类、生物碱类、甾醇类、萜类、香豆素类、长链脂肪族
类、有机酸等［3］。国内学者曾报道过用 HPLC 测定
—179—药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2014，34(6)
DOI:10.16155/j.0254-1793.2014.06.018
覆盆子中椴树苷［4 － 5］、没食子酸［6 － 7］和 VE［8］的含
量，用 HPLC － UV 同时测定覆盆子药材中鞣花酸、
异槲皮苷、山柰酚 － 3 － O － β － D －芸香糖苷、椴树
苷和山柰酚含量以及 HPLC － ELSD 测定覆盆子苷
－ F5 的含量［9］，用比色法测定覆盆子中总黄酮的含
量［10］，以及用 UPLC 同时测定覆盆子中椴树苷、槲
皮素、芦丁 3 个黄酮的含量［11］。作者对覆盆子 70%
乙醇提物化学成分进行了系统的研究，从覆盆子药
材中分离鉴定了 9 个成分，其中山柰酚 － 3 － O －芸
香糖苷和山柰酚 － 3 － O － β － D －吡喃葡萄糖苷为
覆盆子中的主要特征成分，药理学研究表明，其均具
有抗氧化，抗炎作用［12］，目前尚未见测定覆盆子药
材中上述 2 个成分的文献报道。且覆盆子药材也是
中国药典 2015 年版起草品种。基于对覆盆子化学
成分研究基础，收集来自不同产地的 10 批覆盆子药
材，采用 HPLC法同时测定了覆盆子中山柰酚 － 3 －
O －芸香糖苷和山柰酚 － 3 － O － β － D －吡喃葡萄
糖苷的含量，以此考察不同产地覆盆子药材中山柰
酚 － 3 － O －芸香糖苷和山柰酚 － 3 － O － β － D －吡
喃葡萄糖苷含量差异，经方法学考察试验，表明该方
法专属性强，准确可行，重现性好，可作为覆盆子药
材的质量控制方法。
1 仪器与试药
岛津 LC 2010 高效液相色谱仪:四元泵，在线脱
气，柱温箱，自动进样器，紫外可变波长检测器，Shi-
madzu Lcsolution 色谱工作站。Mettler Toledo 十万
分之一电子天平。电热恒温水浴锅(上海跃进医疗
器械厂)。
乙腈为色谱纯，水为娃哈哈饮用纯净水，其他试
剂均为分析纯。
山柰酚 － 3 － O －芸香糖苷和山柰酚 － 3 － O －
β － D － 吡喃葡萄糖苷对照品为本实验室自制，通
过1H － NMＲ、13 C － NMＲ、MS 等手段确证了它的结
构，纯度经 HPLC 检测大于 98% (面积归一法测
得) ;覆盆子药材由汇仁药业有限公司提供，经江西
省食品药品检验所袁桂平主任中药师鉴定为蔷薇科
悬钩子属植物覆盆子(Ｒubus chingii Hu)的干燥果
实。标本保存在江西省食品药品检验所科研室。
2 方法与结果
2. 1 色谱条件 采用 Welch C18色谱柱(250 mm ×
4. 6 mm，5 μm) ，乙腈 － 0. 2%磷酸溶液(15 ∶ 85)为
流动相，流速 1. 0 mL·min －1，检测波长 344 nm，柱
温 30 ℃，进样量 10 μL。在上述色谱条件下，覆盆
子中山柰酚 － 3 － O －芸香糖苷和山柰酚 － 3 － O －
β － D －吡喃葡萄糖苷与其他组分的色谱峰分离度
良好。色谱图见图 1。
图 1 混合对照品(A)和覆盆子药材样品(B)高效液相色谱图
Fig 1 HPLC chromatograms of mixed reference substances (A)and the
Ｒubus chingii Hu sample (B)
1．山柰酚 － 3 － O －芸香糖苷(kaempferol － 3 － O － rutinoside) 2． 山
柰酚 － 3 － O － β － D －吡喃葡萄糖苷(kaempferol － 3 － O － β － D －
glucopyranoside)
2. 2 对照品溶液的制备 精密称取对照品山柰
酚 － 3 － O －芸香糖苷和山柰酚 － 3 － O － β － D －吡
喃葡萄糖苷适量，分别置 50 mL量瓶中，加甲醇溶解
并定容，摇匀，分别得山柰酚 － 3 － O － 芸香糖苷
(1. 578 mg·mL －1)和山柰酚 － 3 － O － β － D －吡喃
葡萄糖苷(0. 466 mg·mL －1)的对照品溶液。精密
量取上述对照品溶液各 25 mL，置于 500 mL 量瓶
中，加甲醇定容至刻度，即得混合对照品溶液。
2. 3 供试品溶液的制备 取本品粉末(过 4 号筛)
约 1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入 70%
甲醇溶液 50 mL，称定重量，加热回流提取 1 h，放
冷，再称定重量，用 70%甲醇溶液补足减失的重量，
摇匀，滤过，精密量取续滤液 25 mL，蒸干，残渣加水
20 mL使溶解，用石油醚提取 3 次，每次 20 mL，弃去
石油醚液，再用水饱和正丁醇振摇提取 3 次，每次
20 mL，合并正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇使溶解，转
移至 5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续
滤液，即得。
2. 4 线性关系考察 取“2. 2”项下山柰酚 － 3 －
O －芸香糖苷和山柰酚 － 3 － O － β － D －吡喃葡萄
糖苷混合对照品溶液，精密吸取 1、3、5、10、15 μL，
按上述色谱条件进样分析，以进样量 X(μg)为横坐
标，峰面积 Y为纵坐标，绘制标准曲线。结果表明:
山柰酚 － 3 － O －芸香糖苷和山柰酚 － 3 － O － β －
—279— 药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2014，34(6)
D －吡喃葡萄糖苷进样量分别在 0. 0789 ～ 1. 1835
μg和 0. 0233 ～ 0. 3495 μg 范围内与峰面积呈良好
线性关系，回归方程分别为:
Y = 1. 218 × 106X － 9. 996 × 103 r = 0. 9999
Y = 2. 244 × 106X － 5. 923 × 103 r = 0. 9998
2. 5 精密度试验 精密吸取按“2. 3”项下方法制
备的供试品溶液 10 μL，在上述色谱条件下连续进
样 6 次，测定峰面积。结果山柰酚 － 3 － O －芸香糖
苷和山柰酚 － 3 － O － β － D －吡喃葡萄糖苷峰面积
的 ＲSD(n = 6)分别为 1. 2%和 0. 82%，表明方法精
密度良好。
2. 6 稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液 10
μL，分别于 0、2、4、8、12、24 h 进样测定，测得山柰
酚 － 3 － O －芸香糖苷和山柰酚 － 3 － O － β － D －吡
喃葡萄糖苷峰面积的 ＲSD(n = 6)分别为 1. 4%和
1. 1%，说明供试品溶液在 24 h内稳定。
2. 7 重复性试验 取同一批覆盆子粉末(过 4 号
筛)6 份，每份约 1. 0 g，精密称定，按“2. 3”项下方法
制备供试品溶液，在上述色谱条件下进行分析测定，
山柰酚 － 3 － O －芸香糖苷及山柰酚 － 3 － O － β －
D － 吡喃葡萄糖苷含量的平均值分别为 0. 7797
mg·g －1和 0. 2337 mg·g －1，ＲSD 分别为 1. 6%和
0. 93%。
2. 8 检测限与定量限测定 在本文色谱条件下，以
信噪比 S /N = 3 计，山柰酚 － 3 － O －芸香糖苷和山
柰酚 － 3 － O － β － D －吡喃葡萄糖苷的检测限分别
为 0. 0064 μg和 0. 0021 μg;以信噪比 S /N = 10 计山
柰酚 － 3 － O －芸香糖苷和山柰酚 － 3 － O － β － D －
吡喃葡萄糖苷的定量限分别为 0. 0179 μg和 0. 0065
μg。
2. 9 加样回收率试验 取已知含量的覆盆子药材
粉末(过 4 号筛)6 份，每份约 0. 5 g，每份精密加入
含山柰酚 － 3 － O －芸香糖苷(0. 0078 mg·mL －1)和
山柰酚 － 3 － O － β － D － 吡喃葡萄糖苷(0. 0023
mg·mL －1)的对照品混合溶液 50 mL，按“2. 3”项下
方法制备供试溶液，在上述色谱条件下进行分析测
定，计算回收率。结果山柰酚 － 3 － O －芸香糖苷和
山柰酚 － 3 － O － β － D －吡喃葡萄糖苷的平均回收
率(n = 6)分别为 101. 9% 和 97. 3%，ＲSD 分别为
0. 70%和 0. 60%。
2. 10 样品测定 分别取不同产地的覆盆子药材，
每个样品取 3 份，按“2. 3”项下方法制备供试品溶
液。精密吸取供试品溶液 10 μL，在上述色谱条件
下进样分析，测定峰面积，用外标法计算出山柰酚 －
3 － O －芸香糖苷和山柰酚 － 3 － O － β － D －吡喃葡
萄糖苷的含量，测定结果见表 1。
表 1 山柰酚 －3 －O －芸香糖苷和山柰酚 －3 －O － β －D －吡喃葡萄糖苷的含量(mg·g －1，n =3)
Tab 1 The contents of kaempferol －3 －O － rutinoside and kaempferol －3 －
O － β －D － glucopyranoside in Ｒubus chingii Hu
编号
(No．)
批号
(Lot No．)
山柰酚 －3 － O －芸香糖苷
(kaempferol － 3 － O － rutinoside)
山柰酚 －3 － O － β － D －吡喃葡萄糖苷
(kaempferol － 3 － O － β － D － glucopyranoside)
1 四川 －1(Sichuan － 1) 0. 058 0. 016
2 四川 －2(Sichuan － 2) 0. 041 0. 014
3 浙江临安(Lin’an，Zhejiang) 0. 076 0. 020
4 浙江丽水(Lishui，Zhejiang) 0. 040 0. 016
5 浙江绍兴(Shaoxing，Zhejiang) 0. 036 0. 016
6 浙江台州(Taizhou，Zhejiang) 0. 039 0. 016
7 浙江金华 －1(Jinhua，Zhejiang － 1) 0． 076 0. 020
8 浙江金华 －2(Jinhua，Zhejiang － 2) 0. 011 0. 005
9 浙江金华 －3(Jinhua，Zhejiang － 3) 0. 080 0. 020
10 浙江金华 －4(Jinhua，Zhejiang － 4) 0. 056 0. 017
3 讨论
3. 1 检测波长的选择 应用光电二极管阵列检测
器在 190 ～ 400 nm 范围内对山柰酚 － 3 － O －芸香
糖苷和山柰酚 － 3 － O － β － D －吡喃葡萄糖苷进行
光谱扫描，结果表明:山柰酚 － 3 － O －芸香糖苷在
263 nm和 350 nm波长处有最大吸收，山柰酚 － 3 －
O － β － D －吡喃葡萄糖苷在 263 nm和 344 nm波长
处有最大吸收，考虑到在短波长处样品中其他组分
的干扰较大，故选择 344 nm 作为检测波长，结果选
择性好，灵敏度高。
3. 2 提取方式的选择 考察了加热回流法、超声提
取法和冷浸过夜 3 种方法对山柰酚 － 3 － O －芸香
—379—药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2014，34(6)
糖苷和山柰酚 － 3 － O － β － D －吡喃葡萄糖苷含量
测定的影响，结果表明，加热回流提取法提取更完
全，故选择回流提取法;提取溶剂考察了乙醇、50%
甲醇溶液、70%甲醇溶液、甲醇 4 种溶剂，结果表明，
70%甲醇溶液提取效率最高，故选择 70%甲醇溶液
为提取溶剂;提取时间考察了 30、60、90 min，结果表
明 60 min可提取完全，故提取时间定为 60 min。
3. 3 水饱和正丁醇提取次数的考察 取本品(过 4
号筛)约 1 g，精密称定，置锥形瓶中，精密加 70%甲
醇溶液 50 mL，称定重量，加热回流 1 h，放冷，再称
定重量，用 70%甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，滤
过，精密量取续滤液 25 mL，蒸干，残渣加水 20 mL
使溶解，用石油醚提取 3 次，每次 20 mL，弃去石油
醚液，再用水饱和正丁醇振摇提取 4 次，每次 20
mL，每次分别收集与蒸干，残渣加甲醇使溶解，并定
容至 5 mL量瓶中，分别测定。测定结果表明用水饱
和正丁醇提取第 3 次时已提取完毕，故选择用水饱
和正丁醇提取 3 次。
3. 4 流动相的选择 考察了甲醇 － 水、甲醇 －
0. 2%磷酸溶液、乙腈 － 0. 2%磷酸溶液 3 个溶剂系
统。结果表明，以乙腈 － 0. 2%磷酸溶液为流动相，
所得色谱峰峰形较好，分离效果最佳。
3. 5 耐用性试验考察 分别用Welch C18(250 mm ×
4. 6 mm，5 μm)、Promosi C18 (250 mm × 4. 6 mm，5
μm)、Diamonsil C18(250 mm ×4. 6 mm，5 μm)3 种品
牌的色谱柱按“2. 1”项的色谱条件对样品进行了含
量测定，3 种色谱柱测定山柰酚 － 3 － O －芸香糖苷
的结果分别为 0. 7842、0. 7816、0. 7648 mg· g －1，
ＲSD为 1. 4%，测定山柰酚 － 3 － O － β － D －吡喃葡
萄糖苷的结果分别为 0. 2325、0. 2343、0. 2316 mg·
g －1，ＲSD为 0. 6%。结果无明显差别。
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(本文于 2013 年 12 月 2 日收到)
—479— 药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2014，34(6)