全 文 ：Chinese Journal of New Drugs 2014,23(24)
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中国新药杂志 2014 年第 23 卷第 24 期
［基金项目］ 国家工信部中药材扶持项目;国家药典委员会“2015
年版《中国药典》科研课题”资助项目
［作者简介］ 张旭，男，硕士研究生，主要从事新药开发与中药活性
成分研究。联系电话:18811527950，E-mail:villa1123@ 163． com。
［通讯作者］ 史社坡，男，副研究员，硕士生导师，主要从事中药活性
成分生物合成和中药质量控制研究。联系电话: (010)64286350，
E-mail:shishepo@ 163． com。屠鹏飞，男，教授，博士生导师，主要从事
活性成分、质量控制、创新药物研究。联系电话: (010)64286350，
E-mail:pengfeitu@ 163． com。
·实验研究·
HPLC法测定茅莓根中表儿茶素的含量
张 旭1，2，杨万青1，2，苏 聪1，2，王 娟1，2，李 军1，张 倩1，赵云芳1，史社坡1，屠鹏飞1
(1 北京中医药大学中药现代研究中心，北京 100029;2 北京中医药大学中药学院，北京 100102)
［摘要］ 目的:建立高效液相色谱法测定茅莓根中表儿茶素的含量。方法:采用 HPLC 法，色谱柱为
Agilent Eclipse XDB C18(250 mm ×4． 6 mm，5 μm);流动相为乙腈-水溶液(12∶ 88)，等度洗脱;柱温为 25 ℃;
检测波长为 280 nm。结果:表儿茶素浓度在 0． 01 ～ 0． 6 mg·mL －1(r = 1)范围内与其峰面积线性关系良好。
平均回收率(n = 9)为 97． 9%，ＲSD为 1． 92%。结论:本方法简便准确，快速可靠，可用于茅莓根药材的质量
控制。
［关键词］ 茅莓根;表儿茶素;高效液相色谱法;含量测定;质量控制
［中图分类号］ Ｒ927． 2 ［文献标志码］ A ［文章编号］ 1003 － 3734(2014)24 － 2915 － 04
HPLC determination of L-epicatechin in Ｒubi Parvifolii Ｒadix
ZHANG Xu1，2，YANG Wan-qing1，2，SU Cong1，2，WANG Juan1，2，LI Jun1，
ZHANG Qian1，ZHAO Yun-fang1，SHI She-po1，TU Peng-fei1
(1 Modern Ｒesearch Center for Traditional Chinese Medicine，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，
China;2 School of Chinese Materia Medica，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100102，China)
［Abstract］ Objective:To establish an HPLC method for determining L-epicatechin in Ｒubi Parvifolii Ｒa-
dix． Methods:The separation was performed on an Agilent Eclipse XDB C18 column (250 mm × 4． 6 mm，5 μm)
with an isocratic elution of acetonitrile and water (12∶ 88)as the mobile phase． The column temperature was 25 ℃
and the detection wavelength was set at 280 nm． Ｒesults:A good linear correlation was observed within the range
of 0． 01 ～ 0． 6 mg·mL －1 for L-epicatechin (r = 1)． The average recoveries (n = 9)were 97． 9% with a ＲSD of
1. 92% for L-epicatechin． Conclusion:The method is simple，accurate and rapid，and can be used for the quality
control of Ｒubi Parvifolii Ｒadix．
［Key words］ Ｒubi Parvifolii Ｒadix;L-epicatechin;HPLC;content determination;quality control
茅莓根来源于蔷薇科 Ｒosaceae 悬钩子属 Ｒubus L
植物茅莓 Ｒubus parvifolius L．的干燥根，其味甘、苦，
性凉，具有清热解毒、祛风利湿、活血凉血的功
效［1］。现代药理学研究表明，茅莓根具有抗脑缺
血［2 － 4］、抗肝炎［5 － 6］、抗肿瘤［7 － 9］等多方面的药理活
性。化学成分研究表明，茅莓根中主要含有黄酮
类［10 － 11］、三萜及三萜皂苷类［12 － 14］成分。本课题组
前期对茅莓根进行了系统的化学成分研究，分离得
到黄酮类和三萜皂苷类化合物，其中表儿茶素的含
量较大。研究表明，该成分具有保肝、抗癌的药理作
用［15］。茅莓根疗效确切在民间使用广泛，且为 2010
年版《中华人民共和国药典》新增成方制剂鼻咽灵
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片的主要组成之一，但目前没有完善的质量标准，不
利于该药材及其成药的质量控制。本研究基于
2015 年版《中华人民共和国药典》科研课题，采用
HPLC 对不同产地茅莓根药材进行分析与评价，建
立以表儿茶素作为定量指标的测定方法，对建立茅
莓根药材质量标准并用于控制其质量有重要意义。
仪器与试药
Agilent 1260 高效液相色谱仪(包括四元泵、
DAD检测器、柱温箱、自动进样器、工作站，美国 Ag-
ilent公司) ;UP 超声波清洗器(南京垒君达超声电
子设备有限公司) ;METTLEＲ XS105 型十万分之一
天平(梅特勒-托利多仪器有限公司) ;Milli Q超纯
水机(Millipore 公司) ;AF 20A 粉碎机(天津市泰
斯特仪器有限公司) ;药筛(新乡市同心机械有限责
任公司)。
10 批茅莓根药材采自河南、山东、广西、江西、
广东等地，经北京中医药大学屠鹏飞教授鉴定为茅
莓 Ｒubus parvifolius L． 的干燥根;表儿茶素对照品
(批号:878-200102，中国食品药品检定研究院)。甲
醇(色谱纯，美国 Fisher 公司) ;乙腈(色谱纯，美国
Fisher公司) ;甲醇(分析纯，北京化工厂) ;水为超
纯水。
方法与结果
1 对照品溶液的制备
取表儿茶素对照品适量，精密称定，加 50%甲
醇充分溶解，制成浓度为 1 mg·mL －1的对照品储备
液，备用。
2 供试品溶液的制备
取本品粉末(过 3 号筛)约 1． 0 g，精密称定，置
于 100 mL 具塞锥形瓶中，精密加入 50% 甲醇
25 mL，密塞后，摇匀，称定重量。浸泡 20 min 后超
声(功率 500 W，频率 40 kHz)提取 90 min，放冷，称
定重量，用 50%甲醇补足减失的重量，摇匀，静置
20 min，取上清液离心，滤过，取续滤液，作为供试品
溶液。
3 色谱条件
色谱柱为 Agilent Eclipse XDB C18(250 mm ×
4. 6 mm，5 μm) ，流动相为乙腈-水(12 ∶ 88) ，等度洗
脱 30 min;流速为 1 mL·min －1，检测波长为 280 nm，
柱温为 25 ℃;进样量为 20 μL。在上述色谱条件下，
对照品及供试品溶液的 HPLC图见图 1。
1:表儿茶素
图 1 对照品溶液(A)及茅莓根样品(B)HPLC图
4 线性关系的考察
精密吸取对照品储备液 0． 1，0． 2，0． 5，1． 0，
3. 0，6． 0 mL，分别置于 10 mL量瓶中，加 50%甲醇稀
释至刻度，摇匀，即得系列浓度的对照品溶液。吸取
上述对照品溶液各 20 μL 注入高效液相色谱仪，按
“3”项下色谱条件进行分析，记录表儿茶素的峰面
积，以浓度(C，mg·mL －1)为横坐标，峰面积(A)为纵
坐标，绘制标准曲线。表儿茶素的回归方程为:A =
13 613C － 13． 416，r = 1。结果表明，表儿茶素在
0. 01 ～ 0． 6 mg·mL －1范围内，与其峰面积呈现良好
的线性关系。
5 检测限与定量限
将对照品溶液逐步稀释后进样测定，以色谱图
中信噪比(S /N)为 3 时的进样浓度为最低检测限
(LOD) ，信噪比(S /N)为 10 时的进样浓度为最低定
量限(LOQ)。结果表明，表儿茶素的检测限为
0. 879 μg·mL －1，定量限为 1． 503 μg·mL －1。
6 精密度
6． 1 日内精密度 精密吸取表儿茶素对照品溶液
20 μL，连续进样 6 次，记录色谱峰峰面积和保留时
间，结果表儿茶素峰面积和保留时间的 ＲSD分别为
0． 28%和 0． 95%，均 ＜ 1． 0%。结果表明，仪器的日
内精密度良好，符合分析方法的要求。
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6． 2 日间精密度 精密吸取表儿茶素对照品溶液
20 μL，每天进样 2 次，连续 3 d，记录色谱峰峰面积
和保留时间，结果表儿茶素峰面积和保留时间的
ＲSD分别为 0． 86%和 0． 95%，均 ＜ 1． 0%。结果表
明，仪器的日间精密度良好，符合分析方法的要求。
7 重复性
称取 3号茅莓根供试品(过 3号筛)适量，精密称
定，按“2”项下方法平行制备 6 份供试品溶液，并按
“3”项下色谱条件进样测定，计算表儿茶素的平均含
量为 0． 64%，ＲSD为 1． 3%，说明该方法重复性良好。
8 稳定性
称取 3 号茅莓根供试品(过 3 号筛)适量，精密
称定，按“2”项下方法制备供试品溶液，精密吸取供
试品溶液 20 μL，分别于 0，2，4，8，12，24 h 进样，测
得表儿茶素峰面积的 ＲSD 为 0． 89%，小于 3． 0%，
表明供试品溶液在 24 h内稳定。
9 加样回收率
称取已知含量的 3 号茅莓根粉末(过 3 号筛)9
份(表儿茶素含量为 0． 64%) ，每份约 0． 50 g，精密
称定，分别置 100 mL具塞锥形瓶中，每 3 份一组，分
别依次精密加入低、中、高浓度的表儿茶素对照品
2． 560 0，3． 200 0，3． 840 0 mg，按“2”项下方法制备供
试品溶液，并按“3”项下色谱条件进样测定，计算加
样回收率，结果见表 1。
表 1 表儿茶素加样回收率测定结果 n = 9
测定成分 称样量 / g 加入量 /mg 样品含量 /mg 测得总量 /mg 回收率 /% 平均回收率 /% ＲSD /%
表儿茶素 0． 500 1 2． 560 0 3． 200 6 5． 804 9 101． 7 97． 9 1． 92
0． 500 2 2． 560 0 3． 201 3 5． 733 2 98． 9
0． 500 0 2． 560 0 3． 200 0 5． 730 8 98． 9
0． 500 3 3． 200 0 3． 201 9 6． 304 2 97． 0
0． 500 1 3． 200 0 3． 200 6 6． 274 6 96． 1
0． 500 2 3． 200 0 3． 201 3 6． 307 8 97． 1
0． 500 0 3． 840 0 3． 200 0 6． 997 7 98． 9
0． 500 2 3． 840 0 3． 201 3 6． 882 5 95． 9
0． 500 2 3． 840 0 3． 201 3 6． 903 3 96． 4
10 不同产地茅莓根样品含量测定
称取 10 个不同产地的茅莓根药材(过 3 号筛)
各 2 份，每份约 1． 0 g，精密称定。分别按“2”项下方
法制备供试品溶液，并按“3”项下色谱条件，每个供
试品溶液进样 2 次，记录峰面积，按外标法计算不同
产地茅莓根中表儿茶素的含量，结果见表 2。
表 2 不同产地茅莓根中表儿茶素的
含量测定结果 n = 2
编号 收集地 表儿茶素含量 /%
1 河南信阳和孝营 1． 04
2 山东临沂平邑 0． 44
3 河南洛阳伊川 0． 64
4 广西 0． 22
5 山东济南长清 0． 80
6 江西上饶 0． 56
7 河南信阳游河 0． 55
8 广东广州 0． 26
9 广东广州 0． 21
10 河南洛阳 1． 11
讨 论
1 测定指标的选择
本课题组前期从茅莓根药材中分离鉴定了多个
化学成分，经分析发现，药材中表儿茶素含量较其他
成分高，具有代表性。文献报道表儿茶素具有一定
的药理活性，如保肝、抗癌、抗氧化等。同时经过稳
定性考察发现，表儿茶素具有较好的稳定性，故本研
究以此作为含量测定指标来控制茅莓根药材的
质量。
2 色谱条件的考察
分别考察了甲醇-水、乙腈-水系统，结果发现乙
腈-水系统有较好的分离度。本研究对柱温(20，25，
30 ℃)和流速(0． 8，1． 0，1． 2 mL·min －1)进行了考
察。结果表明，柱温为 20，25，30 ℃时均能实现良好
分离，最终采用常温 25 ℃的柱温。而在不同流速下
表儿茶素与相邻的色谱峰均能实现良好分离，考虑到
时间因素和普遍适用性，采用流速为 1． 0 mL·min －1。
通过 190 ～ 400 nm 全波长扫描，表儿茶素的最大吸
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收波长在 280 nm，故以此作为测定波长。
3 供试品溶液制备方法的考察
实验中分别对提取方法、提取时间、提取溶剂、
溶剂比例及物料比进行了考察，最终确定 50%甲醇
25 mL超声处理 90 min对目标化合物的提取效率较
高。研究中发现，超声提取前将药材浸泡 20 min，有
利于目标成分更充分的提取，且重复性较好
4 不同产地茅莓根中表儿茶素的含量
从含量测定结果可以看出，不同产地和批次茅
莓根中表儿茶素的含量为 0． 21% ～ 1． 11%。不同
省份不同批次的茅莓根质量存在差异，同一个省份
不同批次的茅莓根质量也存在差异。根据测定结
果，建议茅莓根药材含表儿茶素应不低于 0． 20%。
［ 参 考 文 献 ］
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编辑:周卓 /接受日期:
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(上接第 2914 页)
4 样品测定
取血清胸腺因子适量，精密称定，加流动相溶解
并制成 0． 5 mg·mL －1的溶液。精密量取 10 μL，注入
色谱仪，记录色谱图;另取血清胸腺因子对照品适
量，同法测定。按外标法以峰面积计算含量。以无
水、无醋酸物计，3 批含量测定结果为 97． 6%，
99. 4%，98． 0%。
讨 论
本研究用高效液相色谱法建立了血清胸腺因子
及其制剂的含量测定方法，方法简便、准确。并且使
用了新型的 HILIC 色谱柱，解决了亲水性物质用反
相色谱柱分析困难的问题。随着生物制药的蓬勃发
展，会逐渐涌现出大量的亲水性与强极性的多肽类
药物，以本研究中的血清胸腺因子为例，可以把
HILIC色谱柱作为一种新的选择，提供更加有效、可
靠的分析测定。
［ 参 考 文 献 ］
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编辑:周卓 /接受日期:2014 － 10 － 31