全 文 ：马蹄蕨黄酮的纯化及抗氧化活性研究
江明珠，颜 辉，闻 燕 (江苏科技大学生物与化学工程学院，江苏镇江 212018)
摘要 ［目的］纯化马蹄蕨黄酮并研究其抗氧化活性。［方法］在以 70%乙醇为溶剂、料液比 1∶ 40、超声时间 1 h、超声功率 140 W的条件
下提取了马蹄蕨黄酮;以吸附量和解析率为指标研究了分离纯化马蹄蕨黄酮的最佳工艺;并通过测定还原能力、清除 DPPH和羟自由基
能力研究了所得黄酮的抗氧化活性。［结果］AB-8树脂的纯化效果最好，黄酮纯度达 40． 6%;马蹄蕨黄酮具有较强的抗氧化活性，一定
范围内抗氧化活性和浓度呈正相关。［结论］为马蹄蕨资源的综合开发利用提供了理论依据。
关键词 马蹄蕨;黄酮;纯化;抗氧化性
中图分类号 S682． 35 文献标识码 A 文章编号 0517 －6611(2011)26 －15922 －02
Purification of Horseshoe fern Flavonoids and Studies on its Antioxidant Activity
JIANG Ming-zhu et al (College of Biological and Chemical Engineering，Jiangsu University of Science and Technology，Zhenjiang，Jiangsu
212018)
Abstract ［Objective］The aim was to purify Horseshoe fern flavonoids and study its antioxidant activity．［Method］Flavonoids were extracted
from Horseshoe fern under the conditions of ethanol concentration 70%，material / liquid 1∶ 40，ultrasonic power 140 W and extracting time 1 h． The
optimal isolation and purification technology of Horseshoe fern flavonoids was studied by taking adsorption capacity and desorption rate as indexes．
Furthermore，the antioxidant activity of orseshoe fern flavonoids was studied by deter mining their clear ability about DPPH radicals and OH radi-
cals and their reductive ability．［Result］The AB-8 macroporous resin showed the best adsorption and desorption ability comparing with the other
seven kind of macroporous resins，and the purity of flavonoid reached 40． 6% ． Total flavonoids of Horseshoe fern had strong antioxidant activity．
The antioxidant activity of Horseshoe fern flavonoids was positively correlated with the concentration within a certain range．［Conclusion］The re-
search provides theoretical basis for the comprehensive development and utilization of Horseshoe fern resources．
Key words Horseshoe fern;Flavonoids;Purification;Antioxidant activity
作者简介 江明珠(1971 － ) ，女，江苏镇江人，实验师，硕士，从事生物
资源开发利用研究，E-mail:dgjmz@ 163． com。
收稿日期 2011-06-09
马蹄蕨是多年生大型陆生蕨类，植株高 1． 5 ～3． 0 m。根
状茎直立，块状。叶柄粗壮，长约 50 cm，以带叶柄的根状茎
入药的蕨类具有清凉败毒、祛风解毒等功效，是应用广泛的
中草药之一［1］，主要用于祛瘀止血、痈肿疮毒、毒蛇咬伤、跌
打肿痛、外伤出血、崩漏、乳痈、风湿痹痛等，对治疗冠心病也
有很好的效果［2］。马蹄蕨的治疗效果与其具有较强的抗氧
化性有关，随着马蹄蕨研究的不断深入，马蹄蕨有望成为一
些疾病尤其是老年性疾病的重要治疗药品。鉴于此，笔者选
用 8种树脂对马蹄蕨黄酮进行纯化，筛选最优树脂并进行纯
化工艺研究;采用 3 种方法测定了马蹄蕨黄酮的抗氧化性，
以期为马蹄蕨资源的综合开发利用提供理论依据。
1 材料与方法
1． 1 材料
1． 1． 1 供试植物。马蹄蕨购自安徽亳州中药材市场，取原
材料于 60 ℃烘干，磨粉过 40目筛。精确称取 10． 0 g马蹄蕨
干粉置于索氏提取器中，加入石油醚抽提至无色，冷却后取
出置于烘箱内 45 ℃烘干备用。
1． 1． 2 主要试剂与仪器。D280、D392、S-8、X-5、AB-8、D151、
D3520、NKA-II型大孔吸附树脂购自南开大学化工厂;芦丁
(标准品) ，中国药品生物制品检定所出品;其他试剂均为市
售分析纯。UV-9100 紫外可见分光光度计购自北京瑞利分
析仪器公司;电子天平购自上海精密科学仪器有限公司;
KQ5200DB型数控超声波清洗器购自江苏昆山超声仪器有
限公司;DHG-9240A型电热恒温鼓风干燥箱购自上海一恒科
技有限公司。
1． 2 方法
1． 2． 1 马蹄蕨黄酮检测方法。
1． 2． 1． 1 标准曲线的绘制。准确称取在 105 ℃下干燥至恒
重的芦丁对照品 0． 1 g，置于 100 ml容量瓶中，用 60%乙醇溶
解稀释至所需体积，摇匀。即得每 1 mg /ml 芦丁标准液。准
确吸取芦丁标准液 0、0． 5、1． 0、2． 0、3． 0 和 4． 0 ml，分别放入
10 ml刻度试管中，加入 30%乙醇溶液至 5． 0 ml，再依次加入
5%亚硝酸钠溶液 0． 3 ml，振摇后静置 5 min，然后加入 10%
硝酸铝溶液 0． 3 ml，摇匀，放置 6 min，加入 1． 0 mol /L氢氧化
钠溶液 2． 0 ml，再用 30%乙醇定容至刻度，以零管为空白，摇
匀后用1 cm比色皿于510 nm处测定吸光度。计算得回归方
程为:A =0． 571 7C +0． 004 1，r =0． 999 6［3］。
1． 2． 1． 2 黄酮含量的测定 。将马蹄蕨样品在烘箱中 60 ℃
干燥 24 h至恒重，粉碎过 40目筛。称量 50． 0 g样品，加入 2
L 70%乙醇，于 140 W超声功率浸提 1 h，得黄酮提取液并于
90 ℃水浴浓缩 24 h 备用。将马蹄蕨样品液稀释到一定倍
数，吸取稀释液 1 ml 于 10 ml 试管中测定吸光度，计算样品
液中黄酮的含量［3］。
1． 2． 2 马蹄蕨黄酮的纯化。
1． 2． 2． 1 树脂的预处理。将树脂放入三角瓶中，用无水乙
醇浸泡，放摇床中 180 r /min振荡，以除去树脂表面和孔内的
有机杂质，多次换用新的乙醇，直到乙醇液澄清为止。然后
用去离子水洗至无乙醇味。将处理过的树脂于 45 ℃烘干，
保存于干燥器内备用［4］。
1． 2． 2． 2 静态吸附和静态解吸试验。选择 D280 等 8 种大
孔树脂进行试验，测定其对马蹄蕨黄酮的静态吸附量、静态
吸附率和解吸率以筛选树脂。取 1． 0 g 预处理好的大孔树
脂，加入黄酮浓度为 0． 361 mg /ml 的马蹄蕨提取液 50． 0 ml，
于室温下振荡(180 r /min)24 h至吸附平衡，过滤，滤液定容
至 50． 0 ml，测定滤液中黄酮含量，计算各树脂的静态吸附量
和吸附率。用 95%乙醇溶液 30． 0 ml 对吸附饱和的树脂进
行解吸，测定解吸液中黄酮含量，计算解吸率［4］。
责任编辑 乔利利 责任校对 卢瑶安徽农业科学，Journal of Anhui Agri． Sci． 2011，39(26):15922 － 15923，15926
DOI:10.13989/j.cnki.0517-6611.2011.26.182
吸附量(mg /g)=(Co － Ce)× V /m
吸附率(%)=(Co － Ce)/Co ×100%
解析率(%)= C1V1 /(Co － Ce)× V ×100%
式中，Co 为起始浓度(mg /ml) ;Ce 为平衡浓度(mg /ml) ;V为
吸附液体积(ml) ;m 为树脂质量(g) ;C1 为解吸液浓度
(mg /ml) ;V1 为解吸液体积(ml)
［4］。
1． 2． 2． 3 动态吸附和动态解吸试验。对已吸附样品的树脂
用50． 0 ml 50%乙醇溶液室温下进行动态解吸试验，流速1． 0
BV /h，测定洗脱液浓度并计算黄酮的纯度［4］。计算式为:
黄酮纯度 =洗脱液浓度 ×洗脱液体积 /黄酮粗品 ×100%
1． 2． 3 马蹄蕨提取物的抗氧化性测定。
1． 2． 3． 1 还原能力测定。在 2． 5 ml磷酸盐缓冲液(pH 6． 6)
中加入不同浓度的黄酮提取液 1． 0 ml、1%铁氰化钾 2． 5 ml，
混匀后 50 ℃恒温 20 min，再加 2． 5 ml 10%三氯乙酸，然后
3 000 r /min离心分离 10 min。取上层清液加蒸馏水 2． 5 ml
和 0． 1%FeCl3 0． 5 ml，测定反应产物在 710 nm处吸光值。还
原力与抗氧化活性存在极大的相关性，还原力越强，表明被
测样品的抗氧化活性越好［5］。
1． 2． 3． 2 清除羟自由基能力测定。将马蹄蕨提取液用双蒸水
配制成不同浓度梯度溶液，各取 2． 0 ml 上述浓度的马蹄蕨提
取液，依次加入 2． 0 ml 6 mmol /L硫酸亚铁、2． 0 ml 6 mmol /L的
双氧水，混匀后静置10 min，再加入2． 0 ml 6 mmol /L水杨酸，混
匀后静置 30 min，在 510 nm处测其吸光值记为 Ai，当用双蒸水
代替水杨酸时测得的吸光值记为 Aj。空白对照以双蒸水代替
马蹄蕨提取液，吸光值记为 A0。计算式为:
E(·OH)=［1 －(Ai － Aj)/A0］×100%
式中，E为羟自由基的清除率，%;A0 为空白吸光值;Ai 为马
蹄蕨提取液反应的吸光值;Aj 为无水杨酸参加反应时马蹄蕨
提取液的吸光度值［6］。
1． 2． 3． 3 清除 DPPH能力测定。取 4 ml 试样溶液(浓度分
别为2． 5 ～20． 0 μg /ml) ，分别加入新配制的0． 4 mmol /L DP-
PH乙醇溶液 1 ml，呈深紫蓝色，混合均匀，反应 10 min。用
分光光度计在 517 nm波长下测定其吸光值。计算式为:
DPPH自由基清除能力 =［(控制组在 517 nm下吸光值 －试
样在 517 nm 下吸光值)/控制组在 517 nm 下吸光值］×
100%［7］
2 结果与分析
2． 1 黄酮纯化
2． 1． 1 树脂的选择。以树脂的静态吸附量与解吸率为指标
筛选最适于分离马蹄蕨黄酮的树脂。不同类型树脂对黄酮
的吸附量和解吸率不同，这主要与树脂本身的结构和性能有
关，树脂的极性和空间结构(主要指孔径、比表面积和孔容)
是影响树脂吸附性能的主要因素［4］。经比较，D392、AB-8、
D3520、D280树脂的吸附效果较好，但 D392、D3520、D280 的
解吸效果较差(表 1) ，故选用 AB-8树脂纯化黄酮，该种树脂
因具有弱极性，且黄酮类物质自身含羟基具有极性，容易吸
附水溶液中的黄酮。
2． 1． 2 黄酮纯度。用 AB-8树脂对已吸附的黄酮进行洗脱，
收集洗脱液，测定其浓度，过滤烘干后称量所得黄酮粗品。
结果显示，称取洗脱下来的烘干的黄酮粗品为 25． 89 mg，经
计算，黄酮纯度为 40． 6%。
表 1 大孔吸附树脂的结构性能参数及静态吸附解吸结果
Table 1 Performance parameters and static adsorption and desorption
results of macroporous resins
树脂
Resin
极性
Polarity
吸附量
Adsorption
amount∥mg /g
吸附率
Adsorption
rate∥%
解吸率
Desorption
rate∥%
D392 非极性 91． 55 51． 60 31． 50
S-8 极性 83． 10 46． 00 31． 30
AB-8 弱极性 78． 50 43． 10 44． 20
D280 非极性 90． 20 50． 10 29． 00
D151 非极性 72． 00 39． 90 41． 00
D3520 非极性 94． 20 52． 10 27． 40
X-5 非极性 67． 00 37． 10 41． 60
NKA-II 极性 81． 50 45． 20 35． 20
图 1 还原能力随黄酮浓度的变化
Fig． 1 Change of reductive ability with the concentration of fla-
vonoids
图 2 羟自由基清除率随黄酮浓度的变化
Fig． 2 Change of the scavenging rate of hydroxyl radical with
the concentration of total flavonoids
图 3 DPPH自由基清除率随黄酮浓度的变化
Fig． 3 Change of the scavenging rate of DPPH free radical with
the concentration of total flavonoids
(下转第 15926 页)
3295139 卷 26 期 江明珠等 马蹄蕨黄酮的纯化及抗氧化活性研究
枝的木质化程度有关，一般红毛五加在 6月底枝 7月初新梢
完成第一次生长，处于半木质化状态，是红毛五加嫩枝扦插
的最佳时间;扦插部位以红毛五加中下部枝条为插穗成活率
高、根长最长、根数最多，说明红毛五加嫩枝扦插生根率、根
长及根数与枝条的营养状况有关，中下部髓心小于枝条直径
的 1 /2，枝条较为充实，营养状况相对较高，而上部枝条髓心
大于枝条直径的 1 /2，营养状况相对较低;激素浓度(ABT1
号生根粉)以 150 mg /L成活率最高、根长最长、根数最多，说
明红毛五加嫩枝扦插生根率与外源激素的浓度有关，很多研
究表明，外源激素对植物扦插繁殖有促进的作用。
红毛五加嫩枝扦插生根随扦插时期的不同而引起的插
穗生根能力的差异，与插穗内部激素水平和营养物质含量随
生长周期而变化以及和插穗的成熟度有密切关系。扦插的
最适时期，是以一定的生理状态为依据，而不是固定不变的
日期，时期不同则生根情况也不同。青海红毛五加 1 a 中有
2生长高峰，取插穗应在不同的生长高峰时期。在扦插环境
得到保证的基础上，红毛五加适宜的扦插期在 6月下旬至 7
月上旬，适宜的扦插期在 20 d左右。
该试验仅研究了红毛五加嫩枝插穗扦插生根适宜的基
质、扦插时期、插穗部位和激素浓度。此外，影响插穗生根的
内、外部因素很多［10］，有关不同种源插穗、插穗的长度和粗
度、激素种类与浓度交互作用、基质营养成分、插穗叶面积等
也制约着插穗质量、产量以及生根问题，还有待进一步研究。
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90 －92．
(上接第 15923 页)
2． 2 马蹄蕨黄酮的抗氧化能力 从图 1 可见，随着马蹄蕨
黄酮提取液浓度的增加，其还原能力也增强，说明黄酮溶液
的还原能力随黄酮提取液浓度增加而增大。
从图 2可知，不同浓度的黄酮提取液对羟自由基的清除
作用不同，随着黄酮浓度的增加，其对羟自由基的清除率增
大，最高清除率达到 73． 07%。
从图 3可知，当马蹄蕨黄酮提取液浓度为 0． 108 mg /ml
时即浓度较低时其清除率较小，但随着提取液浓度的增加，
清除率呈增大趋势，但当提取液浓度增加到 0． 887 mg /ml 时
其清除率已随提取液浓度的变化增加幅度越来越小，最后基
本不变。这说明当黄酮浓度较低时，黄酮浓度和清除率正相
关性明显。
3 结论
用静态吸附以及解吸的方法筛选 8 种大孔树脂，通过计
算各吸附率和解吸率可知，AB-8 树脂的吸附率和解吸率均
较好，吸附率达到 43． 10%，解吸率达到 44． 20%，所得粗品中
黄酮的纯度达到 40． 6%。通过测定还原能力、清除 DPPH自
由基能力、清除羟自由基能力对马蹄蕨黄酮进行了体外抗氧
化活性研究，结果表明 3种检测方法都测得马蹄蕨黄酮有良
好的抗氧化活性。总体上看，较低浓度下，3种测定方法测得
马蹄蕨黄酮的抗氧化活性都与黄酮浓度正相关。马蹄蕨黄
酮表现出较强的抗氧化活性，可作为天然绿色抗氧化剂的来
源应用于药品和食品领域。
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62951 安徽农业科学 2011年