全 文 ：　第 20 卷第 6 期
2001年 11 月 　 　 　　　　 　
无 锡 轻 工 大 学 学 报
Journal of Wuxi University of Light Industry
　 　 　　　　Vol.20　No.6
Nov.　2001
　文章编号:1009-038X(2001)06-0599-04
　　收稿日期:2001-09-08;　修订日期:2001-11-08.
作者简介:刘萍(1970-), 女(满族),吉林长春人 , 发酵工程博士研究生.
松口蘑菌丝体蛋白质诱导细胞凋亡
刘 萍 , 　陶文沂 , 　孙 震 , 　唐雪明
(江南大学 生物工程学院 ,江苏无锡 214036)
摘　要:采用深层发酵技术培养菌丝体并提取分离出的蛋白质 ,进行体外抗人子宫颈癌 HeLa 细
胞增殖及诱导细胞凋亡机理的研究.试验发现松口蘑菌丝体水提液中活性蛋白质 TMP 在体外具
有抑制肿瘤细胞增殖的作用 ,扫描电镜观察到 TMP 处理细胞产生明显的凋亡小体 , TMP 对细胞
周期的影响是通过抑制细胞从 S 到 G2M 期的转化来抑制 HeLa 细胞增殖 ,诱导细胞发生凋亡的.
DNA电泳出现以 200 bp左右为单位的 DNA碎片.结果表明:采用液体培养方法生产的松口蘑菌
丝体蛋白质 ,具有显著的抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡作用.
关键词:松口蘑;抗癌蛋白质;细胞凋亡
中图分类号:Q 279 文献标识码:A
The Apoptotic Effect of Active Protein from
Tricholoma matsutake Mycelium
LIU Ping , 　TAO Wen-yi , 　SUN Zhen , 　TANG Xue-ming
(School of Bio technology , Southern Yangtze University , Wuxi 214036 , China)
Abstract:The anti tumor ef fect of active materiel f rom Tricholoma matsutake mycelium against HeLa
cell in vi tro.was studied in the paper.Active protein w as separated f rom the mycelium produced by
deep fermentat ion , and studied about i ts antitumor effect ag ainst HeLa cell in v itro by cell culture ,
scanning elect ron microscope , flow cy tometry and DNA electrophoresis.The active pro tein-TMP from
the mycelium of T .matsutake had the antitumor effect and induced apoptosis in v itro.TMP inhibi t-
ed cell proliferation and induced cell apoptosis by inhibiting cell conversion from S to G2M stage.
Therefo re , The natural anti tumor medicine could be volumn-produced by deep fermentation.
Key words:Tricholoma matsutake;antitumor protein;apoptosis
　　松口蘑(Tricholoma matsutake Sing.)系担子
菌纲口蘑科真菌 ,含有多种活性成分 ,具有强身 、抗
肿瘤 、治疗糖尿病等作用.在 27种担子菌类抗癌食
用菌中 ,松口蘑抗癌活性位于第二[ 1 , 2] ,是重要的抗
癌植物.作者采用深层发酵技术培养菌丝体并提取
分离出的蛋白质 ,进行体外抗肿瘤研究 ,发现具有
较强的抗癌活性.
1　材料与方法
1.1　实验材料
1.1.1　松口蘑菌丝体活性蛋白的提取1 TMP 菌丝
体水提液经硫酸铵沉淀 ,收集沉淀透析除盐 , 过
DEAE-52离子交换柱 ,用 HeLa 细胞作为靶细胞筛
选有抑癌活性的组分 ,再过 Sephadex G-200层析柱
分离 ,得到一活性较高组分 ,定名为 TMP.
1.1.2　完全培养液的配制　RPM I 1640培养液过
滤除菌 ,用前加入 10%小牛血清 ,1%谷氨酰胺 、分
别加入 100 U/mL 的青霉素和链霉素溶液 ,用无菌
的 1 mol/ L HCl或 NaOH 溶液调 pH 至 7.0 ～ 7.2 ,
即为完全培养液.
1.1.3　细胞系　人子宫颈癌细胞 Hela系苏州大学
医学院提供 ,肉瘤-180(S-180)细胞购自中国科学院
上海细胞所.
1.2　实验方法
1.2.1　细胞培养1 HeLa细胞生长在 RPM I 1640
完全培养基中 , 37 ℃,5%CO2 温箱培养.传代至旺
盛生长后 ,试验 24 h前半量换液 ,0.4%台盼蓝鉴定
活细胞数应为 98%以上.所有实验均经 2次重复
证实.
1.2.2　TMP 对 HeLa细胞生长曲线的影响1 将对
数生长期的HeLa 细胞 ,用完全培养液悬浮并计数 ,
调细胞浓度 8×104 mL-1 ,然后将细胞接种于 24孔
培养板中 ,每孔 1 mL ,将不同浓度的 TMP 加入各
培养孔中 ,每种浓度设 3个复孔 ,同时设完全培养
液 3孔为对照 ,于 37 ℃, 5%CO2 培养箱中培养 24 、
48 、72 、96 h后 ,取出 ,进行细胞计数 ,每个组分浓度
的细胞数取 3个复孔的平均值 ,计算松口蘑活性物
质对人HeLa 细胞的增殖抑制率[ 3] .
1.2.3 1 TMP 对 HeLa细胞增殖抑制的 IC50测定　
将对数生长期的 HeLa细胞 ,用完全培养液悬浮并
计数 ,调细胞浓度 1×105 mL-1 ,于 96孔培养板中 ,
每孔 100 μL ,将不同质量浓度 TMP 加入各培养孔
中 ,培养 48 h.培养结束后 , 每孔加入 MTT 溶液
(5 mg/mL)20 μL , 37 ℃继续孵育 4 h.每孔加入
50 mL 盐酸异丙醇使紫色结晶溶解 ,然后在酶联免
疫检测仪上测定各孔在 570 nm吸光度值.
1.2.4 1 TMP 对细胞形态的影响　将 HeLa细胞用
完全培养液稀释 ,加入细胞培养瓶中 ,使细胞终浓
度为5×104 mL-1 ,分别加入 TMP(40μg/mL)或生
理盐水 ,将培养瓶移入 CO2培养箱中 ,在 37 ℃、5%
CO2 及饱和湿度条件下培养 48 h.用 0.25%胰蛋白
酶消化 , PBS 洗涤两次 ,细胞离心后用 2%～ 3%戊
二醛4 ℃固定 1 h ,PBS液洗3次 ,1%锇酸固定 1 h ,
PBS洗 3次 ,酒精上行脱水 ,进行扫描电镜观察.
1.2.5 1 流氏细胞术测定 TMP 对HeLa细胞细胞周
期 、细胞凋亡的影响
将HeLa细胞按 2×105 mL-1接种于 60 mL 培
养瓶中 ,分别加入不同质量浓度的 TMP ,在 37 ℃、
5%CO2 及饱和湿度条件下培养作用 24 ～ 96 h ,对
照组加等量培养液[ 4] .
将 TMP 培养不同时间的细胞用 PBS 漂洗 ,胰
蛋白酶消化 ,收集于离心管内 , 1 500 r/min 离心 5
min ,弃上清液 ,使细胞悬浮 ,加 90%冷乙醇 ,用吸管
将细胞分散均匀 ,置冰箱内固定 12 h以上.测定前
离心除去乙醇 ,用 PBS 再洗一次后 , 然后离心去除
上清液 ,加 1 500μL 的碘化丙啶作用 15 min以上 ,
用 200目尼龙网过滤 ,以保证样品呈单细胞悬液状
态 ,即可上机检测.
流式细胞仪上作 DNA 细胞周期及凋亡分析.
数据处理采用 B.D公司 Cellf it软件 ,每个样品均分
析 5 000个细胞.
1.2.6 1 TMP 对 HeLa细胞 DNA 凝胶电泳的影响
　用 TMP 或生理盐水处理后的 HeLa 细胞
3×106 mL-1 ,800 g 离心 5 min ,弃上清液.PBS 洗
涤两遍 ,加入 DNA 抽提缓冲液(10 mmol/L Tris-
HCl ,pH 8.0;150 mmol/ L NaCl;10 mmol/ L EDTA;
0.4%SDS)0.5 mL ,移入 Eppendorff 管 ,加入蛋白
酶 K ,最终质量浓度为 100 μg/mL ,充分混匀 , 50 ℃
水浴保温 3 h ,不时振摇.取出 , 加入等体积 0.5
mol/L Tris-HCl(pH 8.0)平衡的饱和酚 , 混合 10
min ,室温 5 000 g 离心 15 min.吸出上清液于另一
离心管中 ,加入等体积氯仿-异丙醇混合液(V氯仿∶
V乙醇=24∶1)充分混匀 ,室温 5 000 g 离心 15 min.
吸出上清液 ,加入 2 倍无水乙醇及 10%体积 NaAc
(pH 5.2), -20 ℃过夜.12 000 g 离心沉淀 DNA ,
70%乙醇涤洗 1次 ,室温干燥 ,适量电泳缓冲液 TE
溶解 ,加 RNA 酶 20 μg , 37 ℃水浴 1 h.取制备的
DNA 样品 , 1.5%琼脂糖凝胶电泳 2 h ,电泳缓冲液
为 TBE.紫外灯下观察 DNA 梯带并摄影.
1.2.7 1 TMP 体外增强免疫实验 　取健康人的血
球(分离血浆后的血制品),轻轻加在淋巴细胞分离
液上 ,离心收集白细胞层 ,用 PBS 离心洗涤两次 ,最
后用完全培养液调细胞数为 1×106 mL-1备用.将
细胞加入 96孔培养板中 ,每孔体积 100 μL.加入不
同质量浓度的 TMP(40 ～ 160μg/mL),稳定培养 10
h后加入 PHA(最终质量浓度为 10 μg/mL),在 37
℃、5%CO2 及饱和湿度条件下培养 72 h.培养结束
后 , 每孔加入 MTT 溶液(5 mg/mL)20 μL , 37 ℃
继续孵育 4 h.然后终止培养 , 小心吸弃孔内培养上
清液.每孔加入 50 mL 盐酸异丙醇使紫色结晶溶
解 ,然后在酶联免疫检测仪上测定各孔 570 nm 吸
光度值.
600　　　　　　　　　　　　　　　无　锡　轻　工　大　学　学　报　　　　　　　　　　　第 20卷
2　结果与分析
2.1　TMP对 HeLa细胞生长周期的影响
将HeLa 培养不同时间后计数 ,计算 TMP 对人
HeLa 细胞的增殖抑制率 ,结果见图 1.
图 1　TMP 对 HeLa细胞生长曲线的影响
Fig.1　TMP effect on cell growth curve
　　TMP 在质量浓度较低的情况下 ,对 HeLa 细胞
增殖抑制作用较弱(图 1).TMP 对 HeLa 细胞的增
殖抑制作用与作用时间和作用剂量均相关(图 2),
随着培养液中 TMP质量浓度的增加和作用时间的
延长 ,对HeLa细胞增殖抑制率不断提高.在作用 24
h时 ,低剂质量浓度的 TMP 对 HeLa 细胞的增殖抑
制率只有 20%,而在较高质量浓度(80 ～ 160 μg/
mL)时对HeLa细胞的增殖抑制率为 40%～ 60%.
在 48 h时 ,40μg/mL ΣΜΡ对 HeLa细胞的增殖抑
制率上升为 60%,160 μg/mL 时对 HeLa细胞的增
殖抑制率高达 77.1%.但总体来说 , ΣΜΡ具有抑制
细胞分裂的作用(图 1),对细胞的毒性不是很强烈 ,
ΣΜΡ不能象小分子化合物那样在短时间内杀死细
胞.
图 2　TMP对 HeLa 细胞抑制率的影响
Fig.2　TMP effect on Hela cell antiproliferative rate
2.2 1 ΣΜΡ对 HeLa细胞增殖抑制的 IC50测定
从图 3中可以看出 ,随着 TMP 质量浓度的增
加 ,活细胞数量逐渐减少 ,但 TMP 在 0 ～ 160 μg/
mL 质量浓度下并不能全部杀死癌细胞.从回归方
程计算 TMP 对人 HeLa 细胞 IC50值为 30.58 μg/
mL.
图 3　TMP对 HeLa细胞增殖抑制的 IC50
Fig.3　The IC50 of TMP against HeLa cell
2.3　TMP对细胞形态的影响
TMP 对 HeLa细胞形态影响 ,扫描电镜观察结
果见图 4.
　　a.Hela细胞对照(1 840 倍)　　　b.TMP 作用 Hela细胞(1840 倍)　　　c.TMP作用 Hela细胞(2 700 倍)
图 4　TMP 对 HeLa细胞形态的影响
Fig.4　The morphological change of HeLa cells under scanning electronic telescope af fter treating by TMP
　　从图 4中可以看出 ,细胞处理 48 h 后 ,其形态
学变化与对照组相比有明显差异.扫描电镜可见:
细胞粘度增高 ,不易分离成单个细胞 ,细胞表面形
成凋亡小泡(blebbing),有小泡破裂或脱落形成凋
亡小体(apopto tic bodies).在 TMP 作用的 HeLa 细
胞(2 700倍)图中可以明显地观察到凋亡小体.
2.4　流氏细胞术测定 TMP对 HeLa细胞的细胞周
期影响
TMP 对 HeLa细胞的细胞周期影响见表 1 ,表
2 ,其中低于 G1 期 DNA 含量的细胞判定为凋亡细
601第 6期 刘 萍等:松口蘑菌丝体蛋白质诱导细胞凋亡
胞.
表 1　不同质量浓度的 TMP 作用 HeLa 细胞 72 h后周期分
布及细胞凋亡变化
Tab.1　Effects of dif ferent TMP concentrations against HeLa
cell on the cell cycle progression
TMP 质量浓度 G/ % S/ % G 2M/ % 凋亡百分比/%
对照 57.3 26.4 16.3 0
10μg/ mL 53.6 21.6 24.9 1.9
20μg/ mL 42.9 41.5 15.6 6.4
40μg/ mL 44 44.1 11.8 7.0
80μg/ mL 41.6 51.6 6.8 13.1
表 2　80 μg/mL TMP 作用不同时间后 HeLa 细胞周期分布
及细胞凋亡变化
Tab.2 　Effects of TMP reaction for different time against
HeLa cell on the cell cycle progression
TMP作用时间 G/ % S/ % G2M/ % 凋亡百分比/%
24 h　对照 60.9 23.2 15.0 0
24 h　TMP 44.2 52.8 3.0 0.7
48 h　对照 59.4 24.9 15.7 0
48 h　TMP 51.1 37.5 11.4 0.5
72 h　对照 57.3 26.4 16.3 0
72 h　TMP 41.6 51.6 6.8 13.1
96 　对照 53.5 28.1 16.9 1.5
96 h　TMP 48.3 49.5 2.2 41.5
　　经 TMP 处理后的细胞其周期分布与对照明显
不同 ,且不同质量浓度的 TMP 变化情况各异 ,培养
24 h 后 , TMP 处理的 HeLa 细胞其 S 期由对照 23.
2%上升至 52.8%, G2 期比例从 15%降至 3%.这
表明 TMP 在最初是通过干扰细胞 S 期的通过而影
响周期进行.随着 TMP 质量浓度的增高 ,处理细胞
的S 期比例增高.而 G2M 期比例逐渐下降 ,凋亡细
胞比例即亚G1 峰则由1.9%增至 13.1%,与 S期比
例增高的幅度一致.
同一质量浓度下 ,随着 TMP 作用时间延长 ,凋
亡细胞所占比例进行性上升 ,同时也观察到 S 期细
胞比例始终保持在相当高的比例 ,由此推测 TMP
可能是通过抑制细胞周期中 S 到 G2M 期的转化阶
段而影响细胞的生长 ,进而诱导细胞发生凋亡.
2.5　TMP对 HeLa细胞 DNA凝胶电泳的影响
细胞凋亡最突出的生化特征是细胞染色质的
有控降解 ,即 DNA 双链在核小体联结子部位逐渐
断裂 ,形成一系列长度约为 185 ～ 200 bp 倍数的碎
片.DNA 电泳显示 DNA 结构断裂 ,表现为梯状带
型.由图 5 中可以看出 , TMP 在作用 HeLa细胞 48
h后 ,开始发生 DNA断裂 ,形成以 200 bp左右为最
小单位的 DNA梯形电泳结果 ,处理 72 h比 48 h 形
成的 DNA梯带明显.而处理 24 h和对照均无 DNA
梯带.
　2 、3 、4 分别为 80 、40 、20 μg/ mL 的 TMP 作用 HeLa
细胞 36 h;
　5 、6 、7 分别为 80 、40 、20 μg/ mL 的 TMP 作用 HeLa
细胞 48 h;
　8 、9 、10 分别为 80 、40 、20 μg/m L的 TMP 作用 HeLa
细胞 72 h;
　11为培养 72 h 的 HeLa 细胞无药对照;
　1 和 12为 Marker.
图 5　TMP 处理 HeLa细胞的 DNA琼脂糖凝胶电泳
Fig.5 　Agarose gel electrophoresis of DNA extracted
from Hela cell after treatment with TMP
2.6　TMP 对 PHA活化的人外周血淋巴细胞增殖
的调节作用
经 PHA 活化的人外周血淋巴细胞在不同质量
浓度的 TMP 作用下培养 72 h ,MTT 比色法检测结
果见表 3.其 OD值的变化与质量浓度不呈正相关 ,
高质量浓度的 TMP(80 ～ 160 μg/mL)无促增殖作
用 ,而较低质量浓度具有明显的促增殖作用.
表 3　TMP 对人淋巴细胞转化的影响
Tab.3　The effect of TMP on the lymphocyte transformation
组别 TMP 质量浓度/(μg/m L) OD570
PHA 对照组 ——— 0.163±0.01
20 0.190±0＊
PHA+TMP处理组 40 0.210±0＊＊
80 0.167±0.006
160 0.120±0.02
　注:与对照比较＊P<0.05 , ＊＊P <0.01.
(下转第 607页)
602　　　　　　　　　　　　　　　无　锡　轻　工　大　学　学　报　　　　　　　　　　　第 20卷
一烷 、己酸乙酯等.
3　结　论
1)菌种配合是蔬菜汁乳酸菌发酵中对产酸速
度和总菌数最主要的影响因素.嗜热链球菌 、双歧
杆菌 、嗜酸乳杆菌配合发酵的蔬菜汁诱导期最短 ,
约1 ～ 2 h ,对数期产酸速度较快 ,终点 pH 在 3.8 ～
4.2 ,全部发酵时间约 6 ～ 7 h.保加利亚乳杆菌和嗜
热链球菌配合发酵的总菌数最高 ,都在 2.0×108 个
/mL 以上;其次是嗜热链球菌 、双歧杆菌 、嗜酸乳杆
菌配合 ,总菌数也在 1.2×108个/mL 以上.
2)大豆黄浆水可明显提高乳酸菌发酵蔬菜汁
的总菌数 ,说明大豆黄浆水对乳酸菌生长有促进作
用.
3)嗜热链球菌 、双歧杆菌 、嗜酸乳杆菌配合发
酵除了产生乳酸 ,还可以产生较多的乙酸 ,因此发
酵产品中的有机酸组成更为丰富.
4)嗜热链球菌 、双歧杆菌 、嗜酸乳杆菌配合发
酵的蔬菜汁较未发酵的蔬菜汁 ,产生了较多的风味
成份 ,除了双乙酰 、异丁酮 ,还合成了许多小分子的
醛 、醇 、烃 、酯等.
注:本项目中有机酸及风味物质的测定工作由无锡轻工大学测
试中心完成.
参考文献:
[ 1] 内蒙古轻工业学校编.乳品工艺[ M] .北京:中国轻工业出版社 , 1993.
[ 2] 马钢 , 刘英华 ,姜莹等.双歧杆菌酸奶的研制[ J] .食品与发酵工业 , 1992 , 1:13 ～ 15.
[ 3] 范秀容 , 沈萍编.微生物学实验[ M] .北京:高等教育出版社 , 1980.
[ 4] [英] A.H 罗斯编.发酵食品[ M] .朱庆裴 , 唐是雯译.北京:中国轻工出版社 , 1989.
(责任编辑:杨 萌)
(上接第 602页)
3　讨　论
已知的食用菌子实体 、菌丝体中存在的抗癌物
质其主要作用机制是增强免疫力 ,即是佐剂效果 ,
因此发挥抗肿瘤效果的时间较长.河村幸雄(1994)
将松口蘑子实体经水提取 、凝胶过滤 、阴离子交换
树脂和疏水色谱层析后获得能够直接杀伤皮肤癌 、
子宫癌等上皮癌细胞的蛋白质[ 5] .本文作者采用发
酵法 ,从产生的菌丝体中提取的蛋白质 ,也具有体
外抑癌活性.作者研究发现 ,松口蘑菌丝体水提液
中活性蛋白质 TMP 在体外抗肿瘤试验中 ,具有杀
伤肿瘤细胞的作用.较低剂量(20 ～ 160 μg/mL)时
即能抑制 HeLa细胞增殖 ,诱导细胞发生调亡.表现
为细胞形态异常 ,形成凋亡小体.随 TMP 剂量的增
加和作用时间的延长 ,发生形态变化和凋亡的细胞
数量亦相应增加.由于松口蘑是一种活体外共生
菌 ,目前还不能进行人工栽培 ,产量稀少 ,致使国内
外对其研究较少.鉴此 ,本项研究结果对今后批量
生产抗癌的天然药物有一定参考价值.
参考文献:
[ 1] 神田光治.抗癌物质 Emitanin-51 的制造方法[ J] .国外食用菌研究 , 1983 , 1(3):199 ～ 201.
[ 2] 杨新美.中国食用菌栽培学[ M] .北京:中国农业出版社 , 1988 , 155.
[ 3] 郑建仙主编.功能性食品(第二卷)[ M] .北京:中国轻工业出版社 , 1999 , 57～ 59.
[ 4] 韩锐.抗癌药物研究与实验技术[ M] .北京:北京医科大学出版社 , 1997.
[ 5] 河村幸雄 , 森田昭博.抗肿瘤タンパク质の制造法[ P] .日本专利:JP 6 80699 , 1994-03-22.
(责任编辑:杨 萌 ,朱 明)
607第 6期 严维凌等:发酵条件对乳酸菌发酵蔬菜汁产品指标的影响