全 文 ：　第 24 卷第 6 期
2005年 11 月 　 　 　　　　 　
食 品 与 生 物 技 术 学 报
Journal of Food Science and Biotechnology
　 　 　　　　Vo l. 24　No . 6
Nov. 　2005
　文章编号:1673-1689(2005)06-0060-06
　　收稿日期:2005-01-10;　修回日期:2005-03-25.
　　基金项目:无锡市自然科学基金项目(CK030002)资助课题.
作者简介:魏元青(1975-), 女 ,湖北麻城人 , 发酵工程博士研究生.
松口蘑糖蛋白联合 5-Fu体外对人肝癌细胞
Bel-7402的影响及作用机理初探
魏元青 , 　陶文沂 , 　许泓瑜
(江南大学 生物工程学院 ,江苏 无锡 214036)
摘　要:采用 M TT 法研究了松口蘑抗肿瘤糖蛋白 MTS03与化疗药物 5-Fu单独及联合使用对人
肝癌细胞 Bel-7402的影响及对人正常肝细胞 L-02 的毒性作用 ,观察不同浓度配比及不同作用时
间对细胞是否具有增效减毒的作用;采用扫描电镜观察 MTS03作用后的 Bel-7402细胞形态.结果
表明 ,MTS03与 5-Fu在较低浓度单独使用对肿瘤细胞无显著差异 ,但两者联合使用增强了对肿瘤
细胞的杀伤作用 ,而对正常细胞的作用较小 ,联合使用的 q值均大于 0. 85 ,说明不存在拮抗作用.
扫描电镜观察到凋亡小体的形成 ,随着剂量升高 ,凋亡小体增多.这一结果说明两者合用后 MTS03
增加了 5-Fu对肝癌细胞的敏感性 ,同时降低了两者单一高剂量使用时引起的毒副作用 ,同时
MTS03能诱导 Bel-7402细胞膜皱缩和凋亡小体的形成.
关键词:松口蘑;糖蛋白;抗肿瘤;协同增效;细胞毒性;凋亡
中图分类号:R 979. 1 文献标识码:A
Combinational Effects of a Glycoprotein from Tricholoma matsutake with
5-Fu on Human Liver Cancer Cells Bel-7402 in Vitro and
the Relevant Mechanisms
WEI Yuan-qing , 　TAO Wen-yi , 　XU Hong-yu
(Schoo l o f Bio technolog y , Southe rn Yangtze Univer sity , Wuxi 214036 , China)
Abstract:M TT assay w as used to study the ef fects of a gly copro tein M TS03 from Tricholoma
matsutake combined w ith 5-Fu on human liver cancer Bel-7402 cells and the cytotoxicity of the
drug s against human liver L-02 cells. The preliminary mechanism of M TS03 on cancer cells w as
also inve stig ated. The results show ed that M TS03 significantly decreased the surviv al level o f
Bel-7402 cells combined wi th 5-Fu at low do se , as compared w ith that using the drug s
individually , and it had no o r lit tle side ef fects against human liver L-02 cells. The values of q
w ere larger than 0. 85 , they had no antagonistic effect w ith each othe r. The cells t reated w ith
M TS03 at dosage of 40 , 20 , 5 g /mL w ere abno rmal , and apoptot ic bodies w ere visualized by
microscope and scanning electromicro scope. The result suggested that M TS03 could increase the
sensitivity of human liver cancer cel ls to 5-Fu , and reduce the side ef fects w hen using high dosage
of either M TS03 or 5-Fu , MTS03 could also cause cell shrinkage w ith the formation of apopto tic
bodies.
Key words:Tricholoma matsutake;g lycopro tein;anti tumo r;synergistic effect ;cyto tox icity;
apoptot ic bodie s
　　临床上化疗是治疗癌症的一种重要的手段 ,通
常为了增强疗效 ,都是联合使用几种药物. 合用具
有不同作用的几种药物 ,可以杀死更多的癌细胞 ,
并可降低人体对某种特定药物产生耐药性的可能 ,
同时以几种方式攻击癌细胞 ,比单用一种药物更有
疗效.
松口蘑(Tricholoma matsutake , S. Ito et imai
Sing. )是与松树共生的一种外生菌根真菌 ,日本学
者对其进行了一些研究 ,从子实体和菌丝体提取的
活性物质具有良好的抗肿瘤作用 ,而对正常细胞的
毒性较小 ,是一种高效低毒的活性物质[ 1 ～ 3] .万彩霞
等人[ 4] 从松口蘑中提取到一种糖蛋白 ,对 S180 肉
瘤具有良好的抑制作用. 作者拟从联合用药的角
度 ,研究此糖蛋白与化疗药 5-Fu的药物配比 ,观察
两者的相互作用 ,并初步探讨了 MTS03 抗肿瘤的
机理.
1　材料与方法
1. 1　实验材料与仪器
1. 1. 1　材料
1)松口蘑:作者所在实验室保藏菌种 ,松口蘑
菌丝体根据文献[ 5] 的方法发酵获得. 松口蘑糖蛋
白(M TS03)从松口蘑发酵菌丝提取 、分离纯化获
得 ,用 RPMI 1640完全培养基溶解后经 0. 22μm 微
孔滤器过滤除菌 , 4 ℃保存 ,临用前用完全 RPMI
1640培养液稀释到所需浓度.
2)细胞株:人肝癌细胞 Bel-7402 、人正常肝细
胞 L-02 ,购自中国科学院上海细胞研究所 ,常规体
外细胞传代 ,培养基为 RPMI l640完全养基.
3)主要试剂:小牛血清 ,上海华美生化试剂公
司产品;谷氨酰胺 、台盼蓝 、MT T ,Sigma公司产品;
RPM I 1640细胞培养基 ,GIBCO 公司产品;胰蛋白
酶 ,Amresco公司分装;二甲亚砜(DMSO),国产分
析纯.
1. 1. 2　仪　器　96孔细胞培养板 ,美国 Costar 公
司产品;超净工作台 ,苏净集团安泰公司产品;圆筒
式不锈钢过滤器 ,绍兴卫星医疗设备制造有限公司
产品;自动双重纯水蒸馏器 SZ-93 ,上海亚荣生化仪
器厂制造;酶联免疫检测仪 Multiskan MK3 , T her-
molabsystems公司制造;CO 2培养箱 , Thermo For-
ma公司制造;倒置相差显微镜 Bi-4463 , Union Op-
tical Tokyo 制造;SX-40 扫描电子显微镜 ,日本日
立公司制造.
1. 2　方法
1. 2. 1　M TS03与 5-Fu 单独及联合使用对人肝癌
细胞 Bel-7402 的影响　取对数生长期的 Bel-7402
细胞 ,经体积分数 0. 25%胰蛋白酶消化后用 RPM I
1640完全培养液调整细胞浓度为 5×104个 /mL ,加
样于 96孔细胞培养板中 ,每孔 150 μL ,置于 37 ℃、
体积分数 5%的 CO 2培养箱培养 24 h 后加样 ,采用
不同加样方案:1)单独加入不同浓度的 M TS03;2)
单独加入不同浓度的 5-Fu;3)不同浓度的 MTS03
与 5-Fu 联合使用. 用完全培养基将 MTS03 、5-Fu
稀释成不同浓度的样品 ,合用时将两者以不同浓度
进行配比 ,每孔加入 150 μL ,空白对照组加入等体
积的 RPM I 1640完全培养基 ,每组设复孔 4 孔 ,置
于 37 ℃、体积分数 5%的 CO2条件下培养 24 ,48 , 72
h.小心弃去上清液 ,每孔加入 MTT 液(0. 5 mg /mL )
100μL 继续培养 4 h.弃去上清液 ,每孔加入 150 μL
DMSO ,37 ℃10 min后测定 OD570 ,计算抑制率[ 6] .
1. 2. 2　M TS03与 5-Fu 单独及联合使用对人正常
肝细胞 L-02的细胞毒性作用　方法同 1. 2. 1.
1. 3　统计学处理与 q值的计算
结果用 OD 570 ±S 表示 ,组间处理用双侧 t 检
验. 根据下面的公式计算 q值[ 7] :
q = EAB
EA +(1 - EA)EB
式中 ,EA 为A药抑制率 , EB为B药抑制率 , EAB 为两
药合用抑制率 ,q <0. 85 为两药拮抗;q在 0. 85 ～
1. 15范围为两药作用相加;q >1. 25 为两药作用增
强(或协同).
1. 4　扫描电镜观察样品对细胞形态的影响
培养的BEL-7402细胞经体积分数 0. 25%的胰
酶消化收集 , PBS 洗2次(1 000 r /min ,5 min),立刻
用体积分数 2. 5%的戊二醛溶液于 4 ℃固定 1 h ,
PBS液洗3次 ,再用体积分数 1%的锇酸溶液固定1
h ,PBS 洗 3 次 ,酒精上行脱水 ,进行扫描电镜观察
细胞形态[ 8] .
2　结果与讨论
2. 1　5-Fu及 MTS03单独使用对 Bel-7402 、L-02细
胞增殖的影响
采用 M TT 法分别考察了不同质量浓度的
MTS03和 5-Fu单独使用对 Bel-7402 和 L-02作用
61　第 6期 魏元青等:松口蘑糖蛋白联合 5-Fu体外对人肝癌细胞 Bel-7402的影响及作用机理初探
不同时间的增殖抑制作用 ,结果见表 1 ,2.
从表 1可以看出 ,MTS03与 5-Fu单独使用时 ,
随剂量的加大和时间的加长 ,对 Bel-7402细胞的抑
制率增大 ,在 MTS03质量浓度小于 5 μg /mL 时无
显著影响 ,5-Fu的质量浓度小于 0. 75 μg /mL 、作用
48 h内对 Bel-7402细胞的抑制率无显著影响(P >
0. 05). 从表 2 可以看出 , 当作用时间小于 48 h ,
MTS03质量浓度小于 20μg /mL 、5-Fu质量浓度小
于 0. 5 μg /mL时 ,对正常细胞无毒性或毒性极小.
表 1　5-Fu及 MTS03 单独使用对 Bel-7402 细胞增殖抑制率的影响
Tab. 1　Inhibitory effect of 5-Fu and MTS03 on the proliferation in Bel-7402 cells , individually
质量浓度 /
(μg /m L)
时间 /h
24
OD570 ±s 抑制率 /%
48
OD570 ±s 抑制率 /%
72
OD570 ±s 抑制率 /%
对照 1. 125±0. 038 0. 579±0. 024 0. 496±0. 015
M TS03 1. 25 1. 246±0. 019 -10. 76 0. 603±0. 015 -4. 06 0. 492±0. 017 0
2. 5 1. 299±0. 019 -15. 49 0. 599±0. 036 -3. 37 0. 483±0. 029 2. 71
5 1. 085±0. 015 3. 53 0. 583±0. 021 0 0. 419±0. 006 15. 52
10 0. 897±0. 095* 20. 24 0. 493±0. 014 14. 94 0. 212±0. 013** 57. 26
20 0. 688±0. 035* 38. 87 0. 313±0. 012 ** 45. 95 0. 157±0. 056** 68. 28
5-Fu 0. 25 1. 058±0. 048 5. 99 0. 481±0. 015 16. 88 0. 334±0. 033* 32. 71
0. 50 1. 039±0. 005 7. 64 0. 469±0. 003 18. 96 0. 288±0. 006** 41. 88
0. 75 0. 979±0. 011 12. 98 0. 467±0. 017* 19. 43 0. 247±0. 032** 50. 15
　注:*P<0. 05 , **P<0. 01 与对照相比 , 以下同
表 2　5-Fu及 MTS03 单独使用对 L-02 细胞杀伤率的影响
Tab. 2　Inhibitory effect of 5-Fu and MTS03 on the proliferation in L-02 cells , individually
质量浓度 /
(μg /m L)
时间 /h
24
OD570 ±s 抑制率 /%
48
OD570 ±s 抑制率 /%
72
OD 570±s 抑制率 /%
对照 0. 537±0. 036 1. 050±0. 036 1. 175±0. 081
M TS03 1. 25 / / 1. 132±0. 062 -7. 83 1. 459±0. 012 -24. 28
2. 5 / / 1. 106±0. 054 -5. 29 1. 456±0. 048 -23. 98
5 0. 624±0. 074 -16. 16 1. 069±0. 063 -1. 76 1. 176±0. 017 0
10 0. 574±0. 006 -6. 95 0. 995±0. 020 5. 25 1. 133±0. 069 3. 59
20 0. 520±0. 005 3. 10 0. 969±0. 055 7. 74 1. 017±0. 078 13. 48
5-Fu 0. 25 0. 690±0. 011 -28. 49 1. 102±0. 064 -4. 95 1. 259±0. 072 -7. 23
0. 5 0. 556±0. 011 -3. 44 1. 017±0. 095 3. 17 1. 145±0. 045 2. 47
0. 75 0. 514±0. 013 4. 38 0. 893±0. 064 14. 92 0. 950±0. 092* 19. 06
2. 2　MTS03 与 5-Fu 联用后对 Bel-7402 细胞增殖
的影响
根据单独使用两者对两细胞作用的结果 ,采用
了 MTS03对 L-02的无毒或低毒的剂量 ,即小于 10
μg /mL 与 5-Fu 合用或 20 μg /mL 合用作用 24 h ,
MTS03与 5-Fu以不同质量浓度配比后联合使用对
Bel-7402细胞的抑制率见表 3.
从表 3的结果可以看出 ,在两者单独使用无效
的剂量下合用后对 Bel-7402有非常好的抑制作用 ,
与表 1 的比较看 ,在 MTS03单独使用的剂量为 10
μg /mL 时才具有显著意义 ,而以较低的剂量范围
1. 25 ～ 5μg /mL 与 5-Fu合用后 ,对肿瘤细胞的杀伤
力非常明显 ,与单独使用时比较 ,具有非常显著意义.
2. 3　MTS03与 5-Fu联合使用对人正常肝细胞 L-
02的细胞毒性的影响
MTS03与 5-Fu以不同质量浓度联合使用对人
正常肝细胞 L-02生长的影响见表 4.
由表 4可以看出 ,两者合用后 ,在低剂量范围
62 食　品　与　生　物　技　术　学　报　　　　　　　　　　　　第 24卷　
内 ,即 MTS03质量浓度小于 2. 5 μg /mL 、5-Fu 的
质量浓度小于 0. 5 μg /mL 时 ,无论两者单独使用还
是合用作用 72 h均无细胞毒性 ,而较高的剂量作用
长时间对正常肝细胞有一定的毒性. 从表 2 ～ 4 的
结果可以看出 ,在 MTS03质量浓度为 2. 5 μg /mL 、
5-Fu的质量浓度为 0. 5 μg /mL 时 ,分别作用 48 , 72
h对 L-02无细胞毒性 ,对 Bel-7402的抑制率高达
18. 74%和 40. 42%,在低于此浓度下 ,两者的合用
对 L-02 均无毒性 ,而与空白对照比较均有显著
差异.
2. 4　MTS03与 5-Fu联用后对 Bel-7402 细胞作用
的 q值
根据 MTS03与 5-Fu联用对 Bel-7402 细胞的
生长抑制率 ,计算 q值结果见表 5.
表 3　MTS03 与 5-Fu联用对 Bel-7402 细胞增殖的影响
Tab. 3　Inhibitory effect of 5-Fu combined with MTS03 on the proliferation in Bel-7402 cells
质量浓度 /
(μg /m L)
时间 /h
24
OD570 ±s 抑制率 /%
48
OD570±s 抑制率 /%
72
OD570 ±s 抑制率 /%
对照 1. 125±0. 038 0. 579±0. 024 0. 496±0. 015
M TS03
+5-Fu
1. 25 0. 25 1. 054±0. 051 6. 32 0. 508±0. 016 12. 26 0. 346±0. 041* 30. 29
0. 5 1. 035±0. 058 7. 98 0. 502±0. 026 13. 26 0. 293±0. 022* 34. 58
0. 75 0. 969±0. 068 13. 86 0. 468±0. 019 19. 13 0. 278±0. 022** 43. 90
2. 5 0. 25 1. 037±0. 044 7. 86 0. 502±0. 026 13. 30 0. 347±0. 019* 29. 99
0. 5 1. 018±0. 056 9. 53 0. 471±0. 022 18. 74 0. 296±0. 047** 40. 42
0. 75 0. 950±0. 036 15. 55 0. 444±0. 039* 23. 40 0. 269±0. 025** 45. 77
5 0. 25 0. 767±0. 028* 31. 82 0. 372±0. 009* 35. 75 0. 195±0. 016** 60. 69
0. 5 0. 777±0. 072* 30. 89 0. 357±0. 012* 38. 34 0. 171±0. 018** 65. 63
0. 75 0. 763±0. 065* 32. 16 0. 344±0. 008 ** 40. 62 0. 138±0. 009** 72. 18
10 0. 25 0. 725±0. 036* 35. 53 0. 298±0. 010 ** 48. 50 0. 048±0. 014** 90. 32
0. 5 0. 686±0. 009* 39. 02 0. 291±0. 009 ** 49. 83 0. 047±0. 011** 90. 42
0. 75 0. 671±0. 001 ** 40. 36 0. 288±0. 007 ** 50. 22 0. 041±0. 007** 91. 73
20 0. 25 0. 540±0. 034 ** 51. 97 / / / /
0. 5 0. 541±0. 066 ** 51. 88 / / / /
0. 75 0. 508±0. 075 ** 54. 84 / / / /
表 4　MTS03 与 5-Fu联合使用对 L-02细胞增殖的影响
Tab. 4　Inhibitory effect of 5-Fu combined with MTS03 on the proliferation in L-02 cells
质量浓度 /
(μg /m L)
时间 /h
24
OD570 ±s 抑制率 /%
48
OD570±s 抑制率 /%
72
OD570 ±s 抑制率 /%
对照 0. 537±0. 036 1. 050±0. 036 1. 175±0. 081
M TS03
+5-Fu
1. 25 0. 25 / / 1. 068±0. 028 -1. 71 1. 258±0. 015 -7. 18
0. 50 / / 1. 015±0. 011 3. 33 1. 134±0. 016 3. 45
0. 75 / / 0. 889±0. 048 15. 37 1. 012±0. 016 13. 84
2. 5 0. 25 / / 1. 052±0. 038 0 1. 401±0. 015 -19. 34
0. 50 / / 0. 994±0. 035 5. 37 1. 154±0. 028 1. 70
0. 75 / / 0. 848±0. 033 19. 27 0. 838±0. 018* 28. 67
5 0. 25 0. 601±0. 048 -11. 92 1. 020±0. 010 2. 86 0. 906±0. 010* 22. 86
0. 50 0. 584±0. 042 -8. 64 0. 926±0. 027 11. 81 0. 717±0. 010* 38. 93
0. 75 0. 572±0. 061 -6. 43 0. 808±0. 002* 23. 10 0. 643±0. 012** 45. 27
10 0. 25 0. 550±0. 044 -2. 42 0. 945±0. 036 10. 03 0. 795±0. 040* 32. 28
0. 50 0. 541±0. 041 -0. 68 0. 904±0. 042 13. 95 0. 646±0. 032** 44. 95
0. 75 0. 544±0. 041 -1. 30 0. 866±0. 059 17. 57 0. 524±0. 020** 55. 35
20 0. 25 0. 509±0. 048 5. 21 / / / /
0. 50 0. 478±0. 035 11. 03 / / / /
0. 75 0. 456±0. 064 15. 04 / / / /
63　第 6期 魏元青等:松口蘑糖蛋白联合 5-Fu体外对人肝癌细胞 Bel-7402的影响及作用机理初探
　　由表 5的 q值可以看到 ,在 MTS03 质量浓度
小于 2. 5 μg /mL 时合用的 q值大于 0. 85 而小于
1. 25 ,而随着浓度加大 , q值均大于 1. 25 ,具有良好
的增效作用. 两者合用后的 q值均大于 0. 85 ,说明
两者合用不存在拮抗作用 ,当 MTS03质量浓度为 5
μg /mL 、10 μg /mL , 与 5-Fu 合用的 q 值均大于
1. 25 ,具有良好的增效作用.但是从安全的角度考
虑 ,两者的剂量不可太大 ,但由此可以看出 ,两者合
用具有良好的协同作用 ,在较低剂量合用时 ,并不
增加对正常细胞的毒副作用 ,而增加了对肿瘤细胞
的杀伤率 ,达到了单一使用 5-Fu 或 MTS03在高剂
量下才能达到的效果 ,从而避免了使用高剂量单一药
物所带来的毒副作用 ,从而有一定的增效减毒作用.
2. 5　扫描电镜观察糖蛋白 MTS03对 Bel-7402 细
胞形态的影响
Bel-7402细胞在扫描电镜下的细胞形态见图
1.从图 1 可以看出 ,经 M TS03作用后的 Bel-7402
细胞与空白对照细胞比较 ,细胞粘度增加 ,不易分
离成单个细胞 ,细胞膜皱缩外突形成小泡 ,有的小
泡破裂 ,或脱落形成凋亡小体 ,凋亡小体的形成与
剂量有关 ,随剂量增高 ,细胞出现的凋亡小体明显
增多.
表 5　MTS03 与 5-Fu联用后对 Bel-7402细胞作用的 q值
Tab. 5　The q values of 5-Fu combined with MTS03 on the proliferation in Bel-7402 cells
质量浓度 /(μg /m L)
q值
24 h
5-Fu(0. 25) 5-Fu(0. 50) 5-Fu(0. 75)
q1 q2 q3
48 h
5-Fu(0. 25) 5-Fu(0. 50) 5-Fu(0. 75)
q1 q2 q3
72 h
5-Fu(0. 25) 5-Fu(0. 50) 5-Fu(0. 75)
q1 q2 q3
1. 25 1. 055 1. 045 1. 068 0. 956 0. 890 1. 238 0. 926 0. 826 0. 875
2. 5 1. 312 1. 247 1. 198 0. 945 1. 155 1. 400 0. 868 0. 930 0. 889
5 3. 418 2. 834 2. 004 2. 118 2. 022 2. 091 1. 406 1. 289 1. 247
10 1. 361 1. 872 1. 319 1. 655 1. 604 1. 596 1. 260 1. 203 1. 166
图 1　扫描电镜观察MTS03 对 Bel-7402 细胞形态的影响
Fig. 1　The morphological change of Bel-7402 cells under scanning electromicroscope
64 食　品　与　生　物　技　术　学　报　　　　　　　　　　　　第 24卷　
3　结　论
松口蘑是一种珍贵的野生食用菌 ,采用深层发
酵技术获得的菌丝体提取出一种抗肿瘤糖蛋白 ,经
体外的抗肿瘤实验表明 ,对肝癌细胞有一定的抑制
作用 ,而对正常细胞毒副性较小. 5-Fu是临床上广
泛使用于肿瘤治疗的药物 ,在细胞内转变为 5-氟尿
嘧啶脱氧核苷酸(5F-dUMP)而抑制脱氧胸苷酸合
成酶 ,阻止脱氧尿苷酸(dUMP)甲基化为脱氧胸苷
酸(dTMP),从而影响 DNA 的合成 ,然而其毒副反
应也限制了它的大剂量使用 ,常时间使用也存在抗
药和耐药性 ,因此多采用几种药物联合使用的方案
对患者进行治疗. 基于两者的特点 , 作者研究了
MTS03与 5-Fu ,观察两者单独使用及联用对 Bel-
7402细胞的抑制作用及对正常细胞 L-02 的毒性
反应.
实验结果表明 ,在两者低剂量范围内即 MTS03
小于 2. 5 μg /mL 、5-Fu小于 0. 5 μg /mL 时 ,单独使
用或联合使用 72 h 均无细胞毒性 ,增大剂量会出现
一定的毒副作用. M TS03 低剂量单独使用对 Bel-
7402细胞的作用不显著 ,而与 5-Fu 合用时 ,对肿瘤
细胞的抑制率与空白对照比较具有显著差异 ,两者
合用的 q值均大于 0. 85 ,说明两者不存在拮抗作用 ,
MTS03明显增加了5-Fu对肝癌细胞的敏感性. 因此
可以采用低剂量的两者合用来增加对肿瘤细胞的杀
伤率 ,同时又降低了单独使用高剂量 5-Fu引起的对
正常细胞的毒性 ,有一定的增效减毒作用.
通过扫描电镜观察 MTS03 作用后的 Bel -
7402细胞形态 ,发现有凋亡小体的形成 ,随剂量加
大凋亡小体也增多 ,初步说明 MTS03可能引起 Bel
- 7402肿瘤细胞的凋亡.
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(责任编辑:李春丽 ,朱 明)
65　第 6期 魏元青等:松口蘑糖蛋白联合 5-Fu体外对人肝癌细胞 Bel-7402的影响及作用机理初探