全 文 ：醋糟纤维素分解菌的筛选与环境适应性研究
杨运克 , 朱咏莉 , 李萍萍
(现代农业装备与技术省部共建教育部重点实验室 /江苏省重点实验室 /江苏大学农业工程研究院 ,江苏镇江 212013)
　　摘要:以羧甲基纤维素钠(CMC)培养基为基础培养基 , 从林地土壤 、已经堆肥处理的锯末和醋糟 、未经堆肥的新
鲜醋糟样品中初步分离筛选出 13株菌株。通过采用纤维素刚果红染色法测定其相对酶活力 , 进一步得到 3株(分别
命名为 SL02、SL04和 SL10)分解纤维素能力较强的菌株。对这 3株菌株分别进行温度 、碳源 、氮源和酸碱度的适应性
研究 ,结果表明:SL10菌株的适宜生长温度为 28℃左右 , SL02、SL04菌株则分别为 28 ～ 31 ℃和 25 ～ 31 ℃。醋糟和麸
皮的不同配比对菌株的生长影响较大 , SL02菌株的适宜配比为 2 ∶3, SL02和 SL10菌株则分别为 1 ∶4或 0 ∶5;以
NH4NO3作为氮源 , 3株菌株均表现出较高的酶活性;SL04菌株生长的适宜 pH值为 6左右 , SL02和 SL10菌株生长适
宜的 pH值为 8 ～ 9。
　　关键词:纤维素分解菌;醋糟;分离筛选
　　中图分类号:Q936　　文献标志码:A　　文章编号:1002-1302(2009)06-0410-03
(上接第 409页)
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　　醋糟是在制醋过程中排放出的有机废弃物 ,具有含水量
高 、自然状态下难以发酵的特点 ,如何对其进行处理并加以利
用是目前制醋行业面临的一大难题 [ 1 ] 。目前对醋糟的利用
主要集中在将其发酵后和其他有机物料(如锯末 、芦苇末等)
配合用作食用菌 [ 2 ]和植物栽培基质等方面 [ 1, 3] ,并取得较好
的效果 。但由于传统自然发酵周期长 、粗纤维降解率较低的
原因 ,醋糟的利用率仍较低 [ 4] ,这很难满足制醋行业日益发
展的需求 。
从自然环境中筛选纤维素分解菌已经有很多研究报
道 [ 5 -8] 。但对于不同的发酵材料 、不同的环境条件和发酵工
艺等 ,纤维素菌种类的要求有较大差异 。因此 ,需要针对醋糟
的发酵筛选出适应性较强的菌种 ,并对其适宜的发酵条件进
行研究以提高其发酵的腐熟效率 。本研究从林地土壤 、已堆
肥的醋糟和锯末 、未进行堆肥处理的新鲜醋糟中分离筛选高
效纤维素分解菌 ,并对其环境 (温度、碳源 、氮源 、酸碱度 )适
应性进行了初步研究 。
收稿日期:2009-03-25
基金项目:国家农业科技成果转化项目(编号:2008GB2C100106);江
苏省科技攻关项目(编号:BE2006385)。
作者简介:杨运克(1981—),男 ,硕士 , 河北人 ,主要从事纤维素分解
菌的相关研究。 E-mail:mail2cyon@yahoo.com。
通讯作者:李萍萍 ,博士生导师 , 教授。 E-mail:lipingping@ujs.edu.
cn。
1　材料与方法
1.1　纤维素分解菌菌种来源
试验采用的菌种来源于江苏大学校园内林地土壤 、已经
堆肥处理的锯末和醋糟 、未经堆肥的新鲜醋糟。采用对角线
法进行样品采集 [ 9] ,并及时活化培养 。
1.2　供试醋糟材料
试验所用的醋糟由江苏恒顺醋业集团提供 。基础性状
为:全氮 1.36%、全磷 0.28%、全钾 0.30%、粗纤维含量为
20%。
1.3　培养基
(1)菌种生长培养基 [10] :PDA培养基 (培养真菌用 )和
牛肉膏蛋白胨培养基(培养细菌用)。
(2)固体初筛培养基(CMC平板培养基)[11] :CMC-Na
15 g、MgSO4 · 7H2O0.5g、NH4 NO3 1.0 g、KH2PO4 1.0g、琼脂
20 g、H2O1 000 ml, 121 ℃灭菌 25 min,过夜备用 。
(3)液体发酵培养基:KH2PO4 1.0 g、MgSO4 · 7H2O
0.6g、 NaCl0.1g、NaNO3 2.5g、CaCl2 0.05 g、FeCl3 0.01 g、
醋糟 (干燥后)20 g、水 1 000 ml, pH值自然 , 121 ℃灭菌
25 min。
1.4　试验方法
1.4.1　菌种的初筛　将分离的菌种点接到 CMC平板培养基
上 ,在 28℃下培养 48h,用 0.2%的刚果红溶液染色 5 min,
用去离子水冲洗至无游离染色液 ,最后用 0.9%的 NaCl溶液
定影 ,测量各菌株透明圈的直径并计算其相对酶活力(表 1),
—410— 江苏农业科学　2009年第 6期
DOI :10.15889/j.issn.1002-1302.2009.06.031
筛选出相对酶活力较高的菌株做进一步分析 。
1.4.2　温度对纤维素分解菌的相对酶活力的影响 　温度是
微生物生长环境的重要因素 ,本试验对温度进行了 6个处理 。
将各菌种采用点接法接种到 CMC平板培养基上 ,然后在不同
温度(22、25、28、31、34、37 ℃)下培养 。培养 48 h后测量透
明圈直径 。然后用刚果红染色法 [ 12]测定各菌种相对酶活力 。
透明圈直径的大小可直接反映纤维素分解菌酶活力的大小 ,
所以下面以透明圈直径的日扩大量 (cm/d)来表示相对酶活
力 。每个处理重复 3次 ,下同 。
1.4.3　不同碳源及配比对纤维素分解菌 CMC酶活力的影响
　应用醋糟和麸皮 2种碳源的不同配比(重量比)来测定最
佳碳源配比 。设定醋糟麸皮配比梯度为 5 ∶0、4 ∶1、3 ∶2、
2 ∶3、1 ∶4、0 ∶5。分别用上述不同配比的碳源代替发酵培养
基中的醋糟 ,按照等质量碳源进行添加 。将各菌种分别接种
到液体发酵培养基中 ,在 28 ℃下培养 5 d, 用 DNS法测其
CMC酶活力大小 [ 13 ] 。
1.4.4　氮源对纤维素分解菌的相对酶活力的影响 　分别以
NH4Cl、(NH4)2SO4 、尿素作为氮源来代替 CMC平板培养基中
的 NH4NO3 ,按照等价总氮含量进行添加 。在 28 ℃下培养
2 d后用刚果红染色法测量各菌种的相对酶活力大小 。
1.4.5　初始 pH值对纤维素分解菌的 CMC酶活力的影响　
根据实际的醋糟堆肥过程中酸碱度的变化 ,试验定初始 pH
值范围为 3 ～ 10。将各菌种接种到液体发酵培养基中 ,调节
pH值(NaOH/HCl),在 28 ℃下培养 5 d后 ,用 DNS法测其
CMC酶活力大小 ,方法同 1.4.3。
2　结果与分析
2.1　纤维素分解菌的初筛
以羧甲基纤维素钠为唯一碳源进行初筛 ,经过长期(6 ～
8代)的筛选培养 ,得到 13株具有持久性酶活力的菌株 ,经刚
果红染色后测定其相对酶活力 ,并进行多重比较(表 1)。
表 1　纤维素分解菌的相对酶活力
菌种编号 相对酶活力(cm/d) 菌种编号
相对酶活力
(cm/d)
SL01 0.64±0.06a SL08 0.50±0.04c
SL02 1.55±0.07b SL09 0.71±0.04a
SL03 0.45±0.04cd SL10 1.60±0.09e
SL04 1.53±0.09e SL11 0.14±0.01fg
SL05 0.50±0.04c SL12 0.36±0.03d
SL06 0.23±0.03f SL13 0.13±0.01fg
SL07 0.11±0.02g 13个菌株平均 0.65
　　注:同列不同字母表示 5%显著差异性。
　　在初筛得到的 13个菌株中 ,其相对酶活力相差较大
(0.13 ～ 1.60 cm/d)。其中 ,以编号分别为 SL10、SL02和 SL04
的 3株菌株的相对酶活力为最高(1.60、1.55、1.53cm/d),平
均为 1.56 cm/d。其余 10株菌株的酶活力则较低 (0.11 ～
0.71 cm/d),平均仅为 0.38cm/d。从以上结果来看 ,相对酶
活力较高的 SL02、SL04、SL10为分解纤维素能力较强的菌
株 。将这 3株菌株接种到种子斜面培养基中进行保存 ,并对
其最佳生长的环境条件进行试验分析 。
2.2　温度对纤维素分解菌的相对酶活力的影响
温度是影响微生物生长的重要因素 ,一般微生物的最佳
发酵温度为 25 ～ 35 ℃[ 14] 。以初筛的 3株菌株(SL02、SL04、
SL10)为对象 ,分别在不同温度下进行培养并测定其酶活力
(图 1)。随着温度的升高 , 3株菌株酶活性都表现出先升高
再降低的趋势 ,但其最适宜温度的变化范围和酶活性的变化
幅度有所差异 。 SL02的适宜温度为 28 ～ 31 ℃(其对应的酶
活性没有显著差异 ), SL04菌株的适宜温度范围较大 ,为 25
～ 31 ℃(其对应的酶活性没有显著差异)。相比较而言 , SL10
菌株对温度的变化表现则最为敏感 ,温度 22 ～ 25 ℃范围时 ,
其酶活力没有明显变化 ,但当温度升至 28 ℃时其酶活力
(1.5 cm/d)达到了 25 ℃时(0.6 cm/d)的 2.4倍左右 ,而当
温度继续升高时 ,其酶活力开始急剧下降 ,然后变化则比较平
稳 。因此 , SL10菌株的最适温度为 28 ℃左右 ,最高酶活力为
1.5cm/d。
2.3　不同碳源对纤维素分解菌的 CMC酶活力的影响
以醋糟和麸皮的不同配比进行菌株的碳源适应性研究 。
结果表明(表 2),醋糟和麸皮配比的变化对 3株菌株酶活力
的影响不同 。对于 SL02菌株 ,醋糟麸皮配比为 2 ∶3时其酶
活力达到最高(2.13 IU/ml),其次为 1∶4、0 ∶5、3 ∶2、4 ∶1 ,
以纯醋糟碳源处理的酶活性最低 ,仅为最高酶活力的 76%。
这表明麸皮的添加对菌株 SL02的酶活力影响比较显著 。对
于 SL04和 SL10菌株 ,不同醋糟和麸皮配比下的酶活性变化
幅度较小 ,当麸皮的添加比例在一半以上时酶活性则明显提
高 ,最适宜的醋糟和麸皮配比均为 1 ∶4或 0 ∶5。并且 ,对任
一醋糟与麸皮配比水平 , SL02菌株表现出的酶活性都显著高
于 SL04和 SL10菌株 。
表 2　不同碳源配比对纤维素分解菌的 CMC酶活力(IU/ml)的影响
碳源配比 SL02 SL04 SL10
5 ∶0 1.62±0.03a 1.30±0.03bc 1.21±0.02a
4 ∶1 1.74±0.05b 1.29±0.03b 1.22±0.01a
3 ∶2 1.76±0.02bc 1.21±0.02a 1.25±0.01a
2 ∶3 2.13±0.03e 1.34±0.03c 1.31±0.02b
1 ∶4 2.03±0.03d 1.42±0.01d 1.40±0.01c
0 ∶5 1.82±0.03c 1.40±0.01d 1.42±0.03c
　　注:同列不同字母表示 5%显著差异性。
2.4　氮源对各菌种的相对酶活力的影响
从图 2来看 ,使用 NH4NO3作为氮源的总体菌种的平均
相对酶活力最高 ,达到 2.10 cm/d,其次分别是(NH4 )2SO4 、
NH4Cl和尿素 ,其总平均相对酶活力分别为 1.75 cm/d、1.62
cm/d和 1.25cm/d。即各菌株对 NH4NO3均具有较高的适应
—411—杨运克等:醋糟纤维素分解菌的筛选与环境适应性研究
性 。不同氮源条件下 , SL10菌株的酶活力变化范围在 2.10 ～
2.85 cm/d之间 ,平均为 2.55 cm/d。这表明 SL10菌株对氮
源具有较强的适应性 。其次为 SL04菌株 ,其平均酶活性为
2.03 cm/d。而 SL02菌株 ,平均酶活性仅为 1.36 cm/d,并对
NH4NO3最适应 ,对尿素的适应最差 。总的来看 ,对于各菌
株 , NH4NO3均为最适宜的氮源类型 。
2.5　初始酸碱度对各菌种的 CMC酶活力的影响
在初始 pH值为 3 ～ 10之间 , 3菌株酶活性的变化均为随
着初始 pH值的增加而上升 ,当增加到一定的程度后 ,则又随
着 pH值的增加而下降(图 3)。其中变化最为明显的为 SL02
菌株 , 当初始 pH值为 8左右时 , 其酶活力达到最高
(3.18IU/ml),约为最低酶活力的 1.92倍 ,这表明 ,初始 pH
值对 SL02菌株酶活力的大小具有显著影响 。当初始 pH值
为 6左右时 , SL04菌株酶活力达到峰值(2.34 IU/ml),约为
最低酶活力的 1.45倍 。而 SL10菌株达到最高酶活力
(2.33IU/ml)时 , pH值为 9左右 ,并且其最高酶活力仅为最
低酶活力的 1.37倍左右 。这也进一步表明 ,相对于 SL02菌株
而言 , SL04和 SL10菌株对初始 pH值的变化较不敏感 。
3　结论
从林地土壤 、已经堆肥处理的锯末和醋糟以及未经堆肥
的新鲜醋糟样品中经初步分离筛选以及酶活性的测定 ,筛选
出 3株(SL02、SL04、SL10)分解纤维素能力较强的菌株 。对
这 3株菌株分别进行温度 、碳源 、氮源和酸碱度的适应性研
究 ,结论如下:
(1)3株菌株的酶活性对温度的变化均比较敏感 ,适宜生
长温度有所差异 , SL02的适宜温度为 28 ～ 31℃, SL04菌株为
25 ～ 31 ℃, SL10菌株的最适温度均为 28℃左右 。
(2)醋糟和麸皮的不同配比对 SL02菌株的酶活性影响
较大 ,并以二者配比为 2 ∶3时其酶活力达到最高;醋糟和麸
皮的不同配比对 SL02和 SL10菌株酶活性影响则较小 ,适宜
碳源配比为 1∶4或 0∶5。
(3)以 NH4NO3 作为氮源 , 3株菌株均表现出较高的酶
活性 。
(4)SL04菌株适宜偏酸性 (pH值为 6左右)的生长环
境 ,而 SL02和 SL10菌株适宜偏碱性 (pH值为 8 ～ 9)的环境
条件 。
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