全 文 ：·论著·
覆盆子抗耐药真菌活性成分提取方法比较及
活性部位初步筛选
韩冰1 林辉2 陈佳1 喻轶群1 曹永兵2，3 姜远英2，3
( 1．上海市闵行区中心医院药剂科，上海 201199; 2．福建中医药大学药学院中药学教研室，福州 350000; 3．
上海第二军医大学药学院新药研究中心，上海 200433)
【摘要】 目的 考察热回流法、超声法及冷浸法提取覆盆子抗菌活性成分的优劣，初步筛选覆盆子提取物中具有体外抗真
菌活性的部位。方法 以覆盆子提取物联合氟康唑体外抗耐药真菌活性为主要指标，结合提取率评价三种提取覆盆子抗菌
活性成分方法的优劣;依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯及正丁醇萃取覆盆子提取物，以所得部位联合氟康唑体外抗耐药真菌
的活性为评价指标，初步筛选覆盆子提取物的抗菌活性部位。结果 热回流法、超声法及冷浸法三种提取方法的提取率分
别为 21． 0%、16． 8%及 12． 8%，所得提取物联合氟康唑对耐药菌株 100 的 FICI值分别为 0． 035 2、0． 032 2 及 0． 046 9，所得
提取物联合氟康唑对耐药菌株 103 的 FICI值分别为 0． 033 2、0． 031 7 及 0． 039 1;覆盆子提取物的石油醚、氯仿、乙酸乙酯、
正丁醇及水部位对耐药菌株 100 的 FICI值分别为 ＞ 1、0． 502 0、0． 507 8、0． 033 2 及 ＞ 1，对耐药菌株 103 的 FICI值分别为 ＞
1、0． 531 3、0． 507 8、0． 033 2 及 ＞ 1。结论 与热回流法及冷浸法相比，超声法提取覆盆子抗菌活性成分简便、稳定、高效，是
一种较优的提取方法;覆盆子提取物的活性部位为其正丁醇部位。
【关键词】 覆盆子;抗菌活性成分;提取方法;活性部位
【中图分类号】 R 978． 5 【文献标识码】 A 【文章编号】 1673-3827(2012)07-0326-04
Preliminary screening active constituent against Candida albicans resistant to fluconazole from Rubus ch-
ingii Hu fruits
HAN Bing1，LIN Hui2，CHEN Jia1，YU Yi-Qun1，CAO Yong-Bing2，3，JIANG Yuan-Ying2，3
(1． Department of pharmacy，Shanghai minhang district center hospital，Shanghai 201199，China;2． Department of Traditional
Chinese Materia Medica，School of Pharmacy，Fujian University of Traditional Chinese Medicine，Fuzhou 350000，China;3． R＆D
Center of New Drug，School of Pharmacy，Second Military Medical University，Shanghai 200433，China)
【Abstract】 Objecive To compare three methods (cold-soak method，ultrasonic wave method and hot reflux method)of extrac-
ting antifungal constituents from Rubus chingii Hu fruits and preliminary screen active part of the extracts．Methods The three ex-
tractive methods were evaluated through antifungal activity in vitro of extracts from Rubus chingii Hu fruits combining with fluconazole
against durg-resistant Candida albicans and extraction rate． The compositions of these extracts were separated with petroleum ether，
chloroform，ethyl acetate，n-butyl alcohol and water． Screening out the active part were performed through evaluating antifungal ac-
tivity in vitro of parts from the extracts of Rubus chingii Hu fruits combining with fluconazole against durg-resistant Candida albicans
． Results The extraction rate of the Cold-soak method，ultrasonic wave method and hot reflux method was 21． 0%，16． 8% and 12．
8% ． The FICIs of the extracts using three methods combining with fluconazole against Candida albicans 100 were 0． 035 2，0． 032 2
and 0． 046 9，and 0． 033 2，0． 031 7 and 0． 039 1 against Candida albicans 103． The FICIs of petroleum ether，chloroform，ethyl
acetate，n-butyl alcohol and water part combining with fluconazole against Candida albicans 100 were ＞ 1，0． 502 0，0． 507 8，0．
033 2 and ＞ 1，and ＞ 1，0． 531 3，0． 507 8，0． 033 2 and ＞ 1 against Candida albicans 103． Conclusions Ultrasonic wave meth-
od is simple，reliable and efficient． Compared with the other methods，it is the best method of extracting antifungal constituents from
Rubus chingii Hu fruits． The active part of the extracts from Rubus chingii Hu fruits is the n-butyl alcohol part．
【Key words】 Rubus chingii Hu fruits;antifungal constituents;extraction methods;activity part
［Chin J Mycol，2012，7(6) :326-329］
作者简介:韩冰，男 (汉族) ，硕士研究生在读，主任药师． E-mail:hbshcn@ 163． com
通讯作者:姜远英，E-mail:jiangyycn@ yahoo． com． cn
·623· 中国真菌学杂志 2012 年 12 月 第 7 卷 第 6 期 Chin J Mycol，December 2012，Vol 7，No． 6
近年来，由于真菌感染的发病率不断上升，抗
真菌药物被广泛应用，导致临床耐药真菌越来越
多［1］。耐药真菌感染的治疗问题常令临床医生
感到棘手，而联合用药是目前解决这一问题的有
效方法之一，通过联用药物的协同作用能使药物
的抗菌活性大大增强，从而使原本耐药的病原真
菌变得敏感［2］。
覆盆子为蔷薇科悬钩子属植物掌叶覆盆子
(Rubus chingii Hu)的近成熟干燥果实，临床主要
用于治疗肾阳虚惫、宫冷不孕、尿频、遗尿、虚劳、须
发早白等症［3］。随着近年来对覆盆子研究的深入，
一些新的药理活性被揭示，覆盆子这一常用中药越
来越引起学者们的关注［4-5］。本课题组前期研究发
现，覆盆子提取物对白念珠菌等多种致病真菌具有
较好的抗真菌活性，而白念珠菌耐药株也对其具有
耐药性。但当覆盆子提取物与氟康唑联合使用时，
两者能较好地发挥协同作用，有效抑制白念珠菌耐
药株的生长［6］。因此，本研究对覆盆子中协同抗耐
药真菌活性成分的提取方法进行了优化，并对其有
效部位进行了初步研究，为后续抗耐药真菌活性成
分的分离鉴定、协同抗耐药机制研究等奠定基础。
1 材料与方法
1． 1 材料
菌株 白念珠菌 (Candida albicans)耐药菌
株 100 和 103 均为本实验室所保存。
培养基 制备 RPMI 1640 液体培养基，用 1
mol /L NaOH溶液调整该液体培养基在 25℃的 pH
值为 (7． 0 ± 0． 1) ，滤过灭菌，4℃保存备用。
药物 覆盆子 (浙江，2010110581) ，氟康唑注
射液由上海信谊金朱药业有限公司提供。
主要试剂和仪器 灭菌双蒸水 (实验室自
制) ，RPMI 1640 粉末 (美国 Gibco 公司) ，无水乙
醇、石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇均为分析纯，由
国药集团化学试剂有限公司提供，电子分析天平
(上海精密科学仪器有限公司，YP1002N) ，超净工
作台 (苏州净化设备厂) ，恒温培养箱 (上海市跃
进医疗器械一厂) ，超声仪 (昆山市超声仪器有限
公司，KQ5200) ，旋转蒸发仪 (BUCHI，B-490)。
1． 2 方法
覆盆子提取物的制备 ①热回流法:所购覆盆
子粉碎后称取 5． 00 g 置于 250 mL 圆底磨口烧瓶
中，加 70%乙醇溶液 50 mL，于 90℃水浴回流 2 h，
趁热过滤，所得滤渣重复上述操作 2 次，合并 3 次
滤液，将滤液于 50℃水浴中减压浓缩至干重得提
取物，称重后计算提取率，并用 70%乙醇溶液定容
为 0． 5g 生药 /mL 提取物溶液。②超声法:所购覆
盆子粉碎后称取 5． 00 g 置于 250 mL 圆底磨口烧
瓶中，加 70%乙醇溶液 50 mL，于室温下超声 40
min，过滤，所得滤渣重复上述操作 2 次，合并 3 次
滤液，将滤液于 50℃水浴中减压浓缩至干重得提
取物，称重后计算提取率，并用 70%乙醇溶液定容
为 0． 5 g生药 /mL提取物溶液。③冷浸法:所购覆
盆子粉碎后称取 5． 00 g 置于 250 mL 圆底磨口烧
瓶中，加 70%乙醇溶液 50 mL，于室温下静置 12 h，
过滤，所得滤渣重复上述操作 2 次，合并 3 次滤液，
将滤液于 50℃水浴中减压浓缩至干重得提取物，
称重后计算提取率，并用 70%乙醇溶液定容为 0． 5
g生药 /mL提取物溶液。
覆盆子提取物各萃取部位的制备 按上述超
声法制备覆盆子提取物溶液 80 mL (0． 5 g 生药 /
mL) ，于 50℃水浴中减压浓缩至干重，加灭菌双蒸
水定容至 80 mL 得提取物水溶液，依次用石油醚、
氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取该水溶液，通过点硅胶
板判断萃取终点，分别将各萃取液于 50℃水浴中
减压浓缩至干重，加 70%乙醇溶液 80 mL，即得覆
盆子提取物各部位药物溶液，浓度均为 0． 5 g 生
药 /mL。
菌悬液的配制 从 4℃保存的 SDA 培养基上
挑取少量耐药白念珠菌，接种至 1 mL YEPD 培养
液，于 30℃，200 r /min振荡培养，活化 16 h 使真菌
处于指数生长期后期。取该菌液同样方法再次活
化，16 h后用血细胞计数板计数，以 RPMI 1640 培
养液调整菌液浓度至 1 × 103 ～ 5 × 103 CFU /mL。
覆盆子提取物联合氟康唑体外抗耐药真菌活
性 采用棋盘微量稀释法［7］，分别测定三种提取
方法下得到的覆盆子提取物联合氟康唑体外对两
种耐药菌株 100 和 103 的 FICI 值，具体方法如
下:合用的两种药物于 96 孔板上以二维棋盘的纵
(A至 H)横 (2 至 11)两方向分别进行四倍的倍
比稀释，使得氟康唑的终浓度为 1 024、256、64、
16、4、1、0． 25、0． 062 5、0． 015 63、0 μg /mL，覆盆
子提取物的终浓度为 1 024、256、64、16、4、1、0．
25、0 μg生药 /mL，铺好各个浓度的 96 孔板置于
35℃恒温培养箱中培养 48 h 后拿出，测定并计算
FICI值。上述实验重复 3 次，以 FICI 值最大的那
·723·中国真菌学杂志 2012 年 12 月 第 7 卷 第 6 期 Chin J Mycol，December 2012，Vol 7，No． 6
一次实验结果为准。
覆盆子提取物各部位联合氟康唑体外抗耐药
真菌活性 采用棋盘微量稀释法［4］，分别测定石油
醚、氯仿、乙酸乙酯及正丁醇部位联合氟康唑体外
对两种耐药菌株 100 和 103 的 FICI 值，具体方法
如下:合用的两种药物于 96 孔板上以二维棋盘的
纵 (A至 H)横 (2 至 11)两方向分别进行四倍的
倍比稀释，使得氟康唑的终浓度为 1 024、256、64、
16、4、1、0． 25、0． 062 5、0． 015 63、0 μg /mL，覆盆子
提取物部位的终浓度为 5 000、1 250、312． 5、78．
125、19． 53、4． 88、1． 22、0 μg 生药 /mL，铺好各个浓
度的 96 孔板置于 35℃恒温培养箱中培养 48 h 后
拿出，测定并计算 FICI值。上述实验重复 3 次，以
FICI值最大的那一次实验结果为准。
联合用药效果的评价 部分抑菌浓度指数
(fractional inhibitory concentration index，FICI)是评
价药物联用中两药相互作用方式的主要参数。FI-
CI 的计算方法为:将每一种药物联合抑菌时所需
最低抑菌浓度 (MIC)与单用时的 MIC 比值相加。
本实验选用目前国外期刊采用的标准评价联合用
药效果:当 FICI≤0． 5 时，两药的相互作用确定为
协同作用，且 FICI 值越小，两药的协同作用越强;
当 0． 5 ＜ FICI≤4 时为无关作用;当 FICI ＞ 4 时为拮
抗作用［8］。
2 结 果
2． 1 三种覆盆子抗耐药真菌活性成分提取方法的
比较
本实验采用热回流法、超声法及冷浸法提取覆
盆子抗菌活性成分，根据所得提取物重量计算出三
种方法的提取率分别为 21． 0%、16． 8%及 12． 8%。
从实验结果来看，三种提取方法得到的覆盆子提取
物和氟康唑联用后对耐药白念珠菌菌株 100 和 103
均产生较好的协同抑菌作用，其中超声法得到的覆
盆子提取物和氟康唑联用后对两种耐药菌株产生
的协同抑菌作用最大 (见表 1 ～ 2)。
2． 2 覆盆子提取物活性部位的初步筛选
从实验结果来看，正丁醇部位联合氟康唑时能
产生较好的协同抑菌作用，其有效抑制了耐药白念
珠菌菌株 100 和 103 的生长，而其他部位则未表现
出上述活性 (见表 3 ～ 4)。
3 讨 论
提取是从药材原料中得到有效成分的操作，提
表 1 三种覆盆子提取物联合氟康唑对耐药菌株 100 抑菌
作用的比较
Tab． 1 Effects of three kinds of Rubus chingii Hu fruits extract combi-
ning with fluconazole against durg-resistant Candida albicans 100
提取
方法
单用 联合
提取物
(μg生药/mL)
氟康唑
(μg/mL)
提取物
(μg生药/mL)
氟康唑
(μg/mL)
FICI 相互
关系
超声法 ＞ 1 024 1 024 64 1 0．032 2 协同
热回流法 ＞ 1 024 1 024 64 4 0．035 2 协同
冷浸法 ＞ 1 024 1 024 64 16 0．046 9 协同
表 2 三种覆盆子提取物联合氟康唑对耐药菌株 103 抑菌
作用的比较
Tab． 2 Effects of three kinds of Rubus chingii Hu fruits extract combi-
ning with fluconazole against durg-resistant Candida albicans 103
提取
方法
单用 联合
提取物
(μg生药/mL)
氟康唑
(μg/mL)
提取物
(μg生药/mL)
氟康唑
(μg/mL)
FICI 相互
关系
超声法 ＞ 1 024 ＞ 1 024 64 1 0．031 7 协同
热回流法 ＞ 1 024 ＞ 1 024 64 4 0．033 2 协同
冷浸法 ＞ 1 024 ＞ 1 024 64 16 0．039 1 协同
表 3 覆盆子提取物不同部位联合氟康唑对耐药菌株 100
抑菌作用的比较
Tab． 3 Effects of five parts of Rubus chingii Hu fruits extract combi-
ning with fluconazole against durg-resistant Candida albicans 100
部位
单用 联合
药物
(μg生药/mL)
氟康唑
(μg/mL)
药物
(μg生药/mL)
氟康唑
(μg/mL)
FICI 相互
关系
石油醚 ＞ 5 000 ＞ 256 5 000 ＞ 256 ＞ 1 无关
氯仿 ＞ 5 000 ＞ 256 5 000 1 0．502 0 无关
乙酸乙酯 ＞ 5 000 ＞ 256 5 000 4 0．507 8 无关
正丁醇 ＞ 5 000 ＞ 256 312． 5 1 0．033 2 协同
水 ＞ 5 000 ＞ 256 5 000 ＞ 256 ＞ 1 无关
取方法的选择直接影响提取物中有效成分的含量，
杂质的多少。一种好的提取方法应当在尽可能多
的保留有效成分的基础上去除杂质，同时提取方法
本身应当简便、稳定。传统的中药提取方法包括浸
·823· 中国真菌学杂志 2012 年 12 月 第 7 卷 第 6 期 Chin J Mycol，December 2012，Vol 7，No． 6
表 4 覆盆子提取物不同部位联合氟康唑对耐药菌株 103
抑菌作用的比较
Tab． 4 Effects of five parts of Rubus chingii Hu fruits extract combi-
ning with fluconazole against durg-resistant Candida albicans 103
部位
单用 联合
药物
(μg生药/mL)
氟康唑
(μg/mL)
药物
(μg生药/mL)
氟康唑
(μg/mL)
FICI 相互
关系
石油醚 ＞ 5 000 ＞ 256 5 000 ＞ 256 ＞ 1 无关
氯仿 ＞ 5 000 ＞ 256 5 000 16 0．531 3 无关
乙酸乙酯 ＞ 5 000 ＞ 256 5 000 4 0．507 8 无关
正丁醇 ＞ 5 000 ＞ 256 312． 5 1 0．033 2 协同
水 ＞ 5 000 ＞ 256 5 000 ＞ 256 ＞ 1 无关
渍法、渗漉法、回流法等，而一些新的提取方法如
超声法、超临界萃取法等亦得到越来越广泛的应
用。本研究在优化覆盆子抗耐药真菌活性成分提
取方法的时候，考察了热回流法、超声法及冷浸
法。我们从提取率和提取物联合氟康唑的体外抗
耐药真菌活性两个方面来评价上述三种提取方法
的优劣，从实验结果来看，超声法得到的提取物活
性最强，热回流法次之，冷浸法最弱;而提取率方
面，提取率最高的是热回流法，超声法次之，冷浸
法最低。冷浸法无加热、振荡等物理方式参与，室
温下静置，无法充分提取出有效成分，所以结果中
冷浸法提取率最低，提取物活性也最弱。热回流
法的优点是提取充分，但有效成分被充分提取的
同时，杂质也被大量提取出来，而且由于提取在高
温下进行，有效成分容易受热分解，这反而会降低
提取物中有效成分的含量，所以结果中热回流法
虽然提取率最高，但提取物活性并不是最强。与
冷浸法相比，超声法的超声振荡方式保证了有效
成分的充分溶出，所以其提取率较高，提取物活性
较强;与热回流法相比，超声法在常温下进行，避
免了有效成分在提取过程中因受热被分解，减少
了对杂质的提取，所以其提取率较低，提取物活性
反而较强，同时该法操作简单、耗时少、成本低，
故该法与另两种提取方法相比，是一种较优的提
取覆盆子抗菌活性成分的方法。
筛选中药提取物的活性部位可以为进一步分
离鉴定出活性成分提供基础。我们通过对覆盆子
提取物的石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇及水部
位进行活性研究，最终确定覆盆子提取物的活性
部位为正丁醇部位。到目前为止，对覆盆子的化
学成分研究表明，覆盆子中含有大量的三萜 (苷)
类成分，这也是悬钩子属植物的特征性成分之
一［9］，而正丁醇部位正是三萜 (苷)类成分富集
的部位。由此，我们认为覆盆子的抗耐药真菌活
性可能来源于其含有的三萜 (苷)类成分。本研
究为进一步从覆盆子中分离鉴定具有高效协同抗
耐药真菌活性的活性化合物并开展其协同机制研
究奠定了基础。
参 考 文 献
［1］ Pfaller MA． Antifungal drug resistance:mechanisms，epidemiol-
ogy，and consequences for treatment［J］． Am J Med，2012，125
(1 Suppl) :S3-13．
［2］ Hemaiswarya S，Kruthiventi AK，Doble M． Synergism between
natural products and antibiotics against infectious diseases［J］．
Phytomedicine，2008，15(8) :639-652．
［3］ 国家中医药管理局中华本草编委会． 中华本草:第 4 分册，第
10 卷［M］． 上海科学技术出版社，1999:247-250．
［4］ Patel AV，Rojas-Vera J，Dacke CG． Therapeutic constituents and
actions of Rubus species［J］． Curr Med Chem，2004，11(11) :
1501-1512．
［5］ Novakovic＇ MM，Stevanovic＇ SM，Gorjanovic＇ SZ，et al． Changes of
hydrogen peroxide and radical-scavenging activity of raspberry
during osmotic，convective，and freeze-drying［J］． J Food Sci，
2011，76(4) :C663-C668．
［6］ 张石群，林辉，苗琦，等． 覆盆子提取物联合唑类药物抗真菌
活性研究［J］． 中国真菌学杂志，2012，7(1) :4-7．
［7］ Vandenbossche I，Vaneechoutte M，Vandevenne M，et al． Suscep-
tibility testing of fluconazole by the NCCLS borth macrodilution
method，E-est，and disk diffusion for application in the routine
laboratory［J］． J Clin Microbiol，2002，40(3) :918-921．
［8］ Odds FC． Synergy，antagonism，and what the chequerboard puts
between them［J］． Antimicrob，2003，52(1) :1．
［9］ 苗菊茹，谢一辉，刘红宁． 覆盆子的研究进展［J］． 江西中医
药，2004，35(253) :54-55．
［收稿日期］ 2012-04-27
［本文编辑］ 王 飞
·923·中国真菌学杂志 2012 年 12 月 第 7 卷 第 6 期 Chin J Mycol，December 2012，Vol 7，No． 6