全 文 ：Mycosystema
菌 物 学 报 15 March 2008, 27(2): 230-236

jwxt@im.ac.cn
ISSN1672-6472 CN11-5180Q
©2008 Institute of Microbiology, CAS, all rights reserved.






大白口蘑分离菌株的 DNA 鉴定
汤洪敏 1,2 虞泓 2 吴刚 2 崔光芬 2
1贵州民族学院化学系 贵阳 550025
2云南大学生命科学学院 昆明 650091


摘 要：以松口蘑 Tricholoma matsutake 子实体为外类群，对大白口蘑 T. giganteum 野生子实体及其组织
分离菌丝进行 ITS 序列测序，通过 DNAStar 软件进行比较分析。结果表明大白口蘑 ITS 序列长度为 589bp，
松口蘑 ITS 序列长度为 601bp，ITS1 和 ITS2 呈现不同程度的种间多态性；ITS 序列测定证实了大白口蘑
野生子实体及其组织分离菌丝的同质性，并且 ITS 区序列在大白口蘑种内不同菌株间的变异程度很小，
表明使用通用引物 ITS4 和 ITS5，通过 PCR 扩增测序即可用于大白口蘑的种质鉴定。
关键词：内转录间隔区，多态性，同质性


DNA identification of Tricholoma giganteum isolates
TANG Hong-Min 1, 2 YU Hong 2 WU Gang2 CUI Guang-Fen 2
1Department of Chemistry, Guizhou University for Nationalities, Guiyang 550025, China
2College of Life Science, Yunnan University, Kunming 650091, China
Abstract: The total ITS rDNA sequences of fruitbodies of Tricholoma giganteum and Tricholoma matsutake,
and the mycelia of cultures isolated from fruitbodies of T. giganteum were obtained and analyzed. The results
indicated that the length of entire ITS of T. giganteum was 589bp, and T. matsutake 601bp. The length
discrepancy and sequence polymorphism of ITS1 and ITS2 were existed between the two species, but there was

基金项目：贵州省科技厅科学技术基金资助项目（No. 20072043）
*Corresponding author. Tel: 0851-3610235; Fax: 0851-3610313; E-mail: thm@gznc.edu.cn
收稿日期：2007-02-28，接受日期：2007-05-28
DOI:10.13346/j.mycosystema.2008.02.015
Vol.27 No.2 231
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little ITS variability of intraspecies in T. giganteum. The mycelia isolated had the same ITS sequences as their
original basidiocarps. The results also showed that the germplasm of T. giganteum could be diagnosed by ITS
sequences.
Key words: internal transcribed spacer ( ITS ), polymorphism, homogeneity

口蘑属Tricholoma迄今为止全球报道 200 余种，我国记载约为 40余种（卯晓岚 1998）。
大白口蘑 Tricholoma giganteum Massee 是一种新近推出的珍稀栽培菌种。
ITS即内转录间隔区（Internal Transcribed Spacer）被5.8S rDNA分为 ITS1和 ITS2（Hillis
& Dixon 1991），是中度保守区域（实际运用中将 5.8S 包括其中，统称 ITS），适合于蕈菌
种质的分子鉴定以及属内种间或种内差异较明显的菌群间的系统发育关系分析（Chambers
et al. 2000; Smith & Sivasithamparam 2000）。本文通过对大白口蘑子实体、分离菌丝及其近
缘种松口蘑 Tricholoma matsutake (S. Ito & S. Imai) Singer 的 ITS 序列结构分析比较，以期
为大白口蘑菌种鉴定和遗传多样性研究提供依据和基础性资料，进而为蕈菌育种和遗传改
良奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料来源
供试大白口蘑子实体采自云南思茅地区，凭证标本现存放于中国科学院昆明植物所。
选取新鲜、完整的子实体，除去表面异物及菌柄基部泥土，在超净工作台上将子实体
掰开，用刀尖轻轻挑取内表面菌柄、菌盖交界处组织约 0.5 × 0.5cm 大小的菌块接入平板培
养基上，经过多次纯化得到分离菌株。实验材料来源见表 1。

表 1 用于 ITS 分析的材料
Table 1 The materials of Tricholoma giganteum and T. matsutake used for ITS analysis
材料
Materials
来源
Origin
DNA 编号
DNA No.
1
云南思茅市三棵桩大白口蘑野生子实体
Fruitbody DNA of T. giganteum from Sankezhuang, Simao, Yunnan
fTr5
2
云南思茅市三棵桩大白口蘑野生子实体分离纯化菌株
DNA of pure isolate of T. giganteum from Sankezhuang, Simao, Yunnan
hTr5
3
云南思茅市大寨大白口蘑野生子实体分离纯化菌株
DNA of pure isolate of T. giganteum from Dazhai, Simao, Yunnan
hTr2
4
云南楚雄州双柏县团山田松口蘑野生子实体
Fruitbody DNA of T. matsutake from Tuangshantian, Chuxiong, Yunnan
fTm
1.2 DNA 提取
子实体总 DNA 提取参照 Lee & Taylor（1990）的方法。总 DNA 用 1%的琼脂糖凝胶
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（agarose gel）电泳，0.5μg/mL 溴化乙锭（ethidium bromide，EB）染色，用 25ng/µL，50ng/µL，
75ng/µL，100ng/µL 的 λDNA 标定。利用 Kodak 1D 分析软件分析并标定到 30ng/μL 备用。
分离菌丝的 DNA 提取：将菌种活化后接种于 PDA 液体培养基 28℃培养 10d，收集菌丝，
DNA 提取方法同上。
1.3 ITS 引物和反应体系
ITS4 ： 5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′ ； ITS5 ： 5′-GGAAGTAAAAGTCGTAAC
AAGG-3′（White et al. 1990）。
50μL 反应体系包括：10 × buffer 5μL（Taq 酶配套）；dNTP 2.5μL（25mmol/L）（上海
生工）；ITS4、ITS5 各 2.5μL；Taq 酶 2.5μL（Promega，上海生工进口分装）；Mg2+ 2.5μL
（Taq 酶配套）；2.5μL DMSO（AMRESCO，上海生工），2μL 模板 DNA；无菌超纯水补
足 50μL。
反应在 PE2400 型 PCR 仪（美国应用生物系统公司）进行，采用梯度降温 PCR 方法，
循环参数为 94℃预变性 5min，然后经 91℃变性 30s，60℃梯度降温退火 30s（每个循环降
温 1℃），72℃延伸 30s，循环 15 次后，将退火温度恒定在 46℃再循环 20 次，最后 72℃
延伸 7min，灭菌水代替模板 DNA 作空白对照。10μL PCR 产物经 1.5%琼脂糖凝胶电泳检
测扩增效果，并将扩增条带挖下转入 1.5mL 离心管，加水 100μL，沸水加热 5min 使琼脂
糖胶充分溶解，低速离心取上清液 2.5μL 进行第二轮 PCR 扩增。第二轮扩增条件和反应体
系同第一轮 PCR 扩增。
反应结束后将 PCR 扩增产物全部转入 1 支新的 1.5mL 离心管中，按上海生工柱离心
式 Golden Beads 反应体系 DNA 纯化试剂盒（产品号 SK152）操作手册进行直接纯化。
1.4 测序反应与测序产物纯化
用美国应用生物系统公司 BigDyeTM Terminator Cycle Sequencing v 3.0 测序试剂盒进
行测序反应，测序反应的参数为：Kit-Mix 1.5μL，纯化后的 PCR 产物 2μL（60-100ng），ITS
引物（ITS5/ITS4）3.2pmol/L，补水到 10μL 体系。测序反应条件为 95℃预变性 5min，96℃
变性 10s，50℃退火 5s，60℃延伸 4min，共 25 个循环。
测序反应后的混合物中加入 2.5μL，1%的 SDS，使终浓度为 0.2%，进行测序反应产
物纯化，以除去残余染料。具体方法为：98℃加热 5min，25℃保温 10min，加入 40μL NaAc/
无水乙醇混合物，混匀，室温静置 15min，12,000 转离心 20min，124μL 70%乙醇洗两次，
12,000 转离心 10min，100μL 无水乙醇洗 1 次，12000g 离心 10min，70℃加热 10min，烘
干乙醇。
1.5 样品变性与测序电泳
电泳前在纯化好的测序产物管中加入 3μL Loading Buffer，充分震荡，溶解沉淀。重悬
后的测序产物经 95℃加热变性 5min 后，立即置于冰浴 5min，即可上样电泳测序。用 PE
Biosystems公司ABI PRISMTM-377型自动测序仪进行序列测定。测序胶为BMA公司Long
Ranger® Singel® packs，测序模块为 Seq Run 48E-1200。
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每个自测样品均进行了 3 次重复测序以确保准确性。
1.6 DNA 序列数据分析
对有 N 值和计算机误读的个别碱基进行人工校对，用 DNAStar 商用软件包 SeqMan
进行序列拼接，截去测序引物及头尾多余序列，所得 DNA 序列用 Clustal X 进行多重对比
排列，并将获得的序列用 NCBI 的 BLAST 进行序列搜索，用 DNAStar 软件进行序列比较。
2 结果
2.1 ITS 序列长度
测序所得大白口蘑和松口蘑 ITS 序列（GenBank 登记号：EU051917 和 EU051918），
分别为 589bp 和 601bp，其中大白口蘑 ITS1 spacer 222bp，5.8S rDNA 157bp，ITS2 spacer
210bp。松口蘑 ITS1 spacer 245bp，5.8S rDNA 157bp，ITS2 spacer 199bp。详见图 1（“·”
表示具有相同的碱基，“－”表示出现碱基空缺）和表 2。

表 2 大白口蘑与松口蘑 ITS 和 5.8S 长度、同源性及碱基替代率比较
Table 2 Comparisons of the length, homologies, base substitution ratio of ITS and 5.8S in Tricholoma giganteum and T.
matsutake
ITS、5.8S 序列长度 (bp)
Lengths (bp) of ITS and 5.8S
DNA 大白口蘑
T. giganteum
(EU051917)
松口蘑
T. matsutake
(EU051918)
大白口蘑与松口
蘑同源性比较 (%)
Homology
between T. giganteum
and T. matsutake (%)
碱基替代率
Base substitution ratio
(%)
ITS 589 601
ITS1 spacer 222 245 63 53.4
5.8 rDNA 157 157 100 0
ITS2 spacer 210 199 67 43.2

2.2 G＋C 含量
从表 3中可以看出，大白口蘑和松口蘑的 5.8S rDNA的G＋C含量完全相同，只是 ITS1
和 ITS2 的 G＋C 含量百分比存在着的差异。总 ITS 的 G＋C 含量比分别为 40.6%和 43.9%。
相对于松口蘑和假松口蘑 T. bakamatsutake 的同源性（沙涛等 2005），说明大白口蘑与松
口蘑的亲缘关系相对稍远，详见表 4。
2.3 ITS 序列分析比较
大白口蘑子实体 DNA（编号：fDNA.1）与其纯化分离菌丝 DNA（编号：hDNA.1）
的 ITS 序列具有 100%的同源性，与另一纯化分离菌丝 DNA（编号：hDNA.2）的 ITS 序
列只在 ITS2 区间内有一个碱基的差异。除了大白口蘑与松口蘑的 5.8S rDNA 具有 100%的
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同源性外，它们的 ITA1 和 ITS2 表现出种间的多态性。其中，ITS1 有 63%的同源性，ITS2
有 67%的同源性，见表 2、表 3、图 1。ITS1 更具种间多态性。

图 1 大白口蘑与松口蘑 ITS 全序列
Fig. 1 Sequence alignment of the ITS of Tricholoma giganteum and T. matsutake.
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表 3 大白口蘑与松口蘑 G＋C含量比较
Table 3 Comparison of the G＋C content in Tricholoma giganteum and T. matsutake
DNA 编号
DNA No.
ITS
(%)
ITS1
(%)
5.8S rDNA
(%)
ITS2
(%)
fTr5 40.8 37.4 45.2 41.0
hTr5 40.8 37.4 45.2 41.0
hTr2 40.9 37.4 45.2 41.4
fTm 43.9 44.9 45.2 41.7

表 4 大白口蘑、松口蘑和假松口蘑的同源性比较
Table 4 Comparison of homologies in Tricholoma giganteum, T. matsutake and T. bakamatsutake
同源性
Homology DNA 序列
DNA sequence 大白口蘑与松口蘑
T. giganteum and T. matsutake
松口蘑与假松口蘑
T. matsutake and T. bakamatsutake（沙涛等 2005）
ITS1 63% 75.9%
ITS2 67% 89.4%

3 讨论
人工驯化栽培食用菌的前提条件是制备菌种，分离所得的菌丝体是否为原子实体的无
性培养菌丝，单从菌丝的形态特征上是不能进行判断的。随着分子生物学技术的发展，DNA
作为遗传物质能客观和真实地反映物种之间的亲缘关系，对于菌种鉴定和系统分类则是一
种更有力的依据和补充（罗信昌 2001）。
本研究采用 ITS 通用引物 ITS4 和 ITS5 成功地扩增了大白口蘑和松口蘑的 ITS 区段，
所测松口蘑 ITS 区序列与沙涛等（2005）所测的完全相同，即同源性高达 100%。进一步
证实了 ITS 序列在松口蘑种内不同菌株间的变异程度非常小（Kikuchi et al. 2000）。大白口
蘑与松口蘑的 ITS1 和 ITS2 的同源性分别仅为 63%和 67%，而假松口蘑与松口蘑的 ITS1
和 ITS2 的同源性高达 75.9%和 89.4%，说明大白口蘑与松口蘑的亲缘关系较假松口蘑的为
远。Deng 等（2004）鉴于大白口蘑的营养菌丝具有锁状联合，呈现非菌根菌的特点，已
将其排除口蘑属外。Pegler 等（1998）甚至认为洛巴伊口蘑 Tricholoma lobayense R. Heim、
大白口蘑、大口蘑 T. spectabilis Peerally et Sutra 应归为大头菇属（Macrocybe）而非口蘑属。
上述分类结果从一个侧面解释了本研究中的一个实验结果，即大白口蘑与松口蘑 ITS1 和
ITS2 序列中的碱基替代率高达 53.4%和 43.2%。
本实验通过序列测定和比对，证实了大白口蘑野生子实体 DNA（编号：fTr5）与其组
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织分离菌丝 DNA（编号：hTr5）的 ITS 测序完全相同，说明所得分离菌丝与子实体的同质
性，为大白口蘑菌丝的继续研究提供科学证据。对不同分离菌株的 ITS 区序列的比较表明：
ITS 区序列在大白口蘑种内不同菌株间的变异程度很小，在两个分离菌株的 ITS 序列分析
结果中，获得 100%的自展支持率，而它们之间的绝对遗传距离只有 1bp。然而大白口蘑与
松口蘑的 ITS 存在种间的多态现象，ITS1 和 ITS2 序列之间存在明显的差异，碱基替代率
分别为 53.4%和 43.2%。因此，使用通用引物 ITS4 和 ITS5，通过 PCR 扩增测序即可用于
大白口蘑的种质鉴定，为大白口蘑作为珍稀菌种在世界范围的推广提供科学的种质保证。

[REFERENCES]
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