全 文 ：甘肃甘草内生菌次生代谢产物抑菌活性初步研究
邓 毅1，王 艳1，丁仁伟1，任鹏飞1，张艳萍2*
(1. 甘肃中医学院 /甘肃省高校中(藏)药化学与质量研究省级重点实验室，甘肃 兰州 730000;2. 甘肃中医
学院附属医院，甘肃 兰州 730020)
摘要 目的:研究甘肃野生与栽培品甘草内生菌次生代谢产物对金黄色葡萄球菌和肺炎链球菌的抑制活性。
方法:将野生与栽培品甘草经分离纯化，筛选出具有抑菌作用的优势菌种，同时提取野生与栽培品甘草的有效成分
总黄酮、总皂苷及多糖，采用体外定量抑菌方法，观察甘草内生菌及其宿主有效成分对金黄色葡萄球菌和肺炎链球
菌的抑制活性。结果:野生与栽培甘草内生细菌 JTYB-001、JTZB-001 及总黄酮、总皂苷对金黄色葡萄球菌和肺炎链
球菌均有抑制作用，与无菌水组比较有显著性差异(P ＜ 0. 05) ;野生甘草内生细菌 JTYB-053 对金黄色葡萄球菌有
抑制作用，与无菌水组比较有显著性差异(P ＜ 0. 05) ;野生与栽培甘草内生真菌及多糖无抑菌作用。结论:野生与
栽培甘草内生细菌 JTYB-001、JTZB-001 与宿主有效成分总黄酮、总皂苷具有相同或相似的生理活性，对金黄色葡萄
球菌和肺炎链球菌均有抑制作用。
关键词 甘草;内生菌;抑菌活性
中图分类号:R282. 2 文献标识码:A 文章编号:1001-4454(2013)02-0181-04
收稿日期:2012-07-14
基金项目:甘肃省中医药管理局项目(GZK-2010-9)
作者简介:邓毅 (1964-) ，男，教授，研究方向:中药及复方的应用研究;Tel:0931-8765397，13919289773，E-mail:dengyi188@ sina. com。
* 通讯作者:张艳萍，Tel:13649313353。
内生菌(endophyte)是指生活在健康植物组织
和器官内部的真菌或细菌，与宿主植物在长期共同
进化过程中衍生的一类微生物。内生菌在演化过程
中发生基因重组并获得宿主植物的基因，能够产生
与宿主植物相同或相似的药用活性成分，并具有多
种生理活性。本实验通过甘肃野生与栽培品甘草内
生菌次生代谢产物对金黄色葡萄球菌和肺炎链球菌
的抑制作用，观察甘草内生菌与宿主有效成分在抑
菌活性方面的差异。
1 材料与仪器
1. 1 药物 野生甘草和栽培甘草于 2011 年 5 月
采自甘肃省酒泉市金塔县，经甘肃中医学院中药鉴
定教研室杨扶德教授鉴定为豆科植物甘草 Glycyr-
rhiza uralensis Fisch. 的根和根茎。将新鲜的野生与
栽培甘草的根部泥沙清理掉，用保鲜膜分开包装，4
℃保存。
1. 2 菌种 金黄色葡萄球菌(批号:CMCC(B)
26003) ，肺炎链球菌(批号:31001-9a) ，购自兰州四
方医药开发公司。
1. 3 培养基 NA固体培养基:牛肉浸膏 3 g，蛋白
胨 8 g，琼脂粉 20 g，水 1 000 mL，121 ℃灭菌 30
min。血营养琼脂培养基:琼脂粉 4. 5 g，新生小牛血
清 20 mL，水 80 mL，121 ℃灭菌 30 min。NA液体培
养基:牛肉浸膏 3 g，蛋白胨 8 g，水 1 000 mL，121 ℃
灭菌 30 min。PDA 液体培养基:马铃薯 200 g，葡萄
糖 20 g，水 1 000 mL，121 ℃灭菌 30 min。
1. 4 试剂 生理盐水(甘肃扶正药业科技股份有
限公司，批号:201101050213) ，青霉素(宜昌人福药
业有限责任公司，批号:110212) ，营养琼脂(国药集
团化学试剂有限公司，批号:20111012) ，新生小牛血
清(三利生物制品厂，批号:90436528)。
1. 5 仪器 LDZX-30FB 立体压力蒸汽灭菌锅(上
海申安医疗器械厂) ，9082-B 型电热恒温培养箱
(上海福玛实验设备有限公司) ，BS-110S 型电子分
析天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司) ，101-型
电子恒温干燥箱(北京科伟水鑫实验仪器设备厂) ，
80-1S离心沉淀器(上海手术器械厂) ，旋转蒸发器
(上海亚荣生化仪器厂) ，KQ-500DE 型数控超声清
洗器 (昆山市超声仪器有限公司) ，Analyzer 可调式
微量移液器(上海求精生化试剂仪器有限公司) ，
PB-20 标准型 pH计(北京赛多利斯仪器设备) ，SW-
1F-CJ无菌操作台 (上海新苗医疗器械制造有限公
司)。
2 方法
2. 1 具有抑菌作用的甘草内生菌的初步筛选〔1-3〕
2. 1. 1 菌种编号:野生甘草内生细菌编号为
JTYB-001 ～ JTYB-0065，内生真菌的编号为 JTYF-
001 ～ JTYF-007;栽培甘草内生细菌编号为 JTZB-001
～ JTZB-053，内生真菌编号为 JTZF-001 ～ JTZF-007。
2. 1. 2 供试菌活化:金黄色葡萄球菌和肺炎链球
菌分别于 NA 和血营养琼脂培养基中 37 ℃活化 24
h，甘草内生细菌在 NA中 37 ℃活化 24 h。
·181·Journal of Chinese Medicinal Materials 第 36 卷第 2 期 2013 年 2 月
DOI:10.13863/j.issn1001-4454.2013.02.018
2. 1. 3 菌落点样法:将金黄色葡萄球菌和肺炎链
球菌分别于 NA 和血营养琼脂试管斜面中活化 24
h，于试管中加入 3 mL无菌水，微量移液器吸取 100
μL，均匀涂抹于 NA和血营养琼脂培养基上，用接种
环挑取已编号的各内生细菌菌落，分别点到 NA 和
血营养琼脂培养基 3 个方位，做好标记，每皿 3 株细
菌，重复 3 次，25 ℃培养 2 d，观察结果，测量抑菌圈
直径。
2. 1. 4 数据处理:所有数据都以 珋x ± s 表示，暂不
做 SPSS分析。
2. 2 具有抑菌作用的内生细菌次生代谢产物的分
离 采用摇瓶发酵，在无菌操作台上，将已纯化的斜
面培养基中的细菌菌株划线接入 NA 固体培养基，
28 ℃暗光培养 24 h活化，再将 NA液体培养基按每
瓶 100 mL分装于 250 mL 三角瓶中，121 ℃灭菌 30
min。然后将活化的菌株用接种环各挑去 3 环菌种
接种于以上 NA液体培养基中，28 ℃，200 r /min，摇
床培养 4 d，发酵完成后，于 4 ℃、3 000 r /min 离心
15 min，取上清液烘干，根据需要用无菌水稀释为相
应浓度即为供试溶液。
2. 3 甘草内生真菌次生代谢产物的分离 采用摇
瓶发酵，将已纯化保存的真菌划线接入 PDA固体培
养基中，25 ℃暗光培养 48 h，然后将活化的真菌于
无菌操作台上用打孔器打取 10 块直径为 0. 4 cm的
菌饼，接种于装有 100 mL PDA 液体培养基的 250
mL三角锥形瓶中，然后在 25 ℃、200 r /min 条件下
培养 7 d，将发酵液用 3 层无菌纱布过滤，除去菌丝
和孢子，发酵液于 4 ℃，3 000 r /min 离心 15 min，取
上清液烘干，根据需要用无菌水稀释为相应浓度即
为供试品溶液。
2. 4 甘草总黄酮提取〔4〕 取野生与栽培甘草粉末
各 0. 1 g，精密称定，加甲醇 50 mL，称重，(250 W，20
kHz)超声提取 80 min，称重，补足损失重量，过滤，
收集滤液，即得。
2. 5 甘草总皂苷提取〔5〕 取野生与栽培甘草粉末
各 500 mg，精密称定，加 70%乙醇 50 mL，水浴回流
2 h，过滤，收集滤液，用 70%乙醇反复多次冲洗滤
渣，洗液合并至滤液，置旋转蒸发仪器蒸干，以 10
mL 0. 5%氨水溶解，过滤。取滤液 3 mL至 10 mL 刻
度离心管，加入 3. 5 L硫酸至 pH 2 ～ 3，低温静置，离
心，除去上清液，沉淀加稀氨水溶解，重复酸沉碱溶
4 次后定容至 10 mL，得到供试液。
2. 6 甘草多糖提取〔6〕 将野生与栽培甘草粉碎过
筛后各称取 40 g，加 95%乙醇 100 ℃提取 3 次，过
滤，药渣于室温下置通风处晾干，然后用热水回流提
取 3 次，合并提取液，浓缩，所得样品加入适量 95%
乙醇使溶液的乙醇体积分数为 80%进行沉淀，4 ℃
下静置 24 h，过滤，沉淀物合并以无水乙醇洗涤，冷
冻干燥得样品，取得到的干燥样品，以 Sevag 法除蛋
白，即加入 Sevag试剂(氯仿∶ 正丁醇 = 5∶ 1)与多糖
样品 1∶ 1 混匀，静置，除去下层蛋白质变性层，将样
品浓缩，重复除蛋白操作 10 次，浓缩除蛋白样品后
用 95%乙醇洗涤，再浓缩，冻干得粗多糖样品。
2. 7 定量抑菌 将供试品分为 11 组，第 1 组 YH
(野生甘草黄酮) ，第 2 组 YZ(野生甘草皂苷) ，第 3
组 YD(野生甘草多糖) ，第 4 组 ZH(栽培甘草黄
酮) ，第 5 组 ZZ(栽培甘草皂苷) ，第 6 组 ZD(栽培甘
草多糖) ，第 7 组 JTYB-001、JTYB-053、JTZB-001(野
生与栽培有效内生细菌发酵液) ，第 8 组 JTYF-001、
JTYF-002、JTYF-003、JTYF-004、JTYF-005、JTYF-
006、JTYF-007(野生甘草内生真菌发酵液) ，第 9 组
JTZF-001、JTZF-002、JTZF-003、JTZF-004、JTZF-005、
JTZF-006(栽培甘草内生真菌发酵液) ，以上各组浓
度皆为 2 mg /mL;第 10 组 A1、A2、A3、A4(青霉素) ，
分别稀释为 400 倍、200 倍、100 倍、50 倍;第 11 组 O
(无菌水组)。
将金黄色葡萄球菌和肺炎链球菌分别活化于
NA和血营养琼脂斜面试管培养基中，加入 3 mL 无
菌水中制成细菌混悬液，用微量移液枪吸取 100 μL
混悬液，打到 NA和血营养琼脂培养基表面，用三角
玻璃棒涂抹均匀。
将含有不同稀释倍数的青霉素及含各供试品的
圆形滤纸片(6 mm)用灭过菌的镊子分别贴于 NA
和血营养琼脂培养基表面，滤纸片上做好标记，各贴
3 片，每种供试品做 3 个重复，置于 37 ℃培养箱中
培养 48 h后，观察结果，测量抑菌圈直径。
将以上具有抑菌效果的供试液烘干后用无菌水
适当稀释，再在试管中作一系列 2 倍稀释，即 2、1、
0. 5、0. 25、0. 125、0. 0625、0. 0313、0. 0156、0. 0078、
0. 0039 mg /mL，使供试品浓度呈 2 倍递减，最后一
管不加供试品作对照，共 11 支试管。每一支试管做
3 个重复，置于 37 ℃培养箱中培养 48 h 后，观察最
低抑菌浓度(MIC)。
2. 8 数据处理 数据以 珋x ± s 表示，采用 SPSS
17. 0 统计软件进行分析。
3 结果
3. 1 具有抑菌作用的甘草内生细菌的初步筛选
见表 1、表 2。野生及栽培甘草内生细菌共 119 株，
经定性抑菌分析，对金黄色葡萄球菌有抑菌作用的
是 JTYB-001、JTYB-053、JTZB-001;对肺炎链球菌有
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抑菌作用的是 JTYB-001、JTZB-001。
表 1 野生及栽培甘草内生细菌对金黄色
葡萄球菌的抑菌圈值(珔x ± s)
供试菌 菌号 抑菌圈直径 /mm
金黄色葡萄球菌 JTYB-001 10. 2 ± 0. 5
JTYB-053 8. 8 ± 0. 1
JTZB-001 7. 6 ± 0. 3
表 2 野生及栽培甘草内生细菌对肺炎
链球菌的抑菌圈值(珔x ± s)
供试菌 菌号 抑菌圈直径 /mm
肺炎链球菌 JTYB-001 6. 8 ± 0. 4
JTZB-001 7. 0 ± 0. 5
3. 2 甘草有效成分及内生菌代谢产物对金黄色葡
萄球菌的抑菌作用 见表 3。野生及栽培甘草的多
糖类成分、内生真菌对金黄色葡萄球菌没有抑制作
用。
表 3 甘草有效成分及内生菌代谢产物对金
黄色葡萄球菌的抑菌圈值(珔x ± s)
供试菌 供试品
供试品
浓度
/(mg /mL)
滤纸片的
供试品
含量 /μL
抑菌圈
直径
/mm
金黄色葡萄球菌 YH 2 100 16. 9 ± 0. 3*
YZ 2 100 19. 4 ± 0. 6*
YD 2 100 6. 0 ± 0. 0
ZH 2 100 15. 6 ± 1. 8*
ZZ 2 100 18. 8 ± 1. 1*
ZD 2 100 6. 0 ± 0. 0
JTYB-001 2 100 9. 3 ± 2. 5*
JTYB-053 2 100 11. 4 ± 0. 8*
JTZB-001 2 100 10. 7 ± 0. 9*
A1 400 倍 100 11. 3 ± 1. 0*
A2 200 倍 100 15. 7 ± 1. 1*
A3 100 倍 100 20. 7 ± 2. 5*
A4 50 倍 100 31. 0 ± 1. 9*
O 0 100 6. 0 ± 0. 0
注:与无菌水组比较，* P ＜ 0. 05
结果表明，野生与栽培甘草的黄酮组、皂苷组及
内生细菌发酵液 JTYB-001、JTYB-053、JTZB-001 对
金黄色葡萄球菌均有抑制作用，与无菌水组比较有
显著性差异(P ＜ 0. 05)。
3. 3 甘草有效成分及内生菌代谢产物对肺炎链球
菌的抑菌作用 见表 4。野生及栽培甘草的多糖类
成分、内生真菌对肺炎链球菌没有抑制作用。
表 4 甘草有效成分及内生菌代谢产物对
肺炎链球菌的抑菌圈值(珔x ± s)
供试菌 供试品
供试品
浓度
/(mg /mL)
滤纸片的
供试品
含量 /μL
抑菌圈
直径
/mm
肺炎链球菌 YH 2 100 13. 5 ± 2. 3*
YZ 2 100 16. 8 ± 1. 6*
YD 2 100 6. 0 ± 0. 0
ZH 2 100 15. 0 ± 1. 9*
ZZ 2 100 17. 3 ± 0. 4*
ZD 2 100 6. 0 ± 0. 0
JTYB-001 2 100 10. 6 ± 2. 3*
JTZB-001 2 100 13. 9 ± 2. 8*
A1 400 倍 100 13. 8 ± 1. 5*
A2 200 倍 100 19. 2 ± 1. 5*
A3 100 倍 100 22. 2 ± 2. 1*
A4 50 倍 100 28. 4 ± 2. 4*
O 0 100 6. 0 ± 0. 0
注:与无菌水组比较，* P ＜ 0. 05
结果表明，野生与栽培甘草的黄酮组、皂苷组及
JTYB-001、JTZB-001 对肺炎链球菌均有抑制作用，
与无菌水组比较有显著性差异(P ＜ 0. 05)。
3. 4 甘草有效成分及有效内生菌对金黄色葡萄球
菌的 MIC测定 见表 5。
3. 5 甘草有效成分及有效内生菌对肺炎链球菌的
MIC测定 见表 6。
4 讨论
体外抑菌实验是研究抑菌作用的方法之一，能
够准确定量的得出供试品的抑菌强度，不受内环境
等多种因素的干扰，且重现性好。本实验在前期对
甘草内生菌分离纯化工作的基础上得到 132 株内生
菌，由于菌株较多，无法全部进行发酵获取代谢产物
进行抑菌实验，因此采用 2 次抑菌实验，筛选出具有
明显抑菌作用的 3 株内生细菌与甘草有效成分黄
酮、皂苷进行抑菌作用比较。结果表明 3 株内生细
菌，JTYB-001、JTZB-001 和 JTYB-053 对金黄色葡萄
球菌均有抑制作用，与无菌水组比较有显著性差异
(P ＜ 0. 05) ;JTYB-001 和 JTZB-001 对肺炎链球菌均
有抑制作用，与无菌水组比较有显著性差异(P ＜
0. 05) ;初步判定 JTYB-001、JTZB-001 分别为野生和
栽培甘草的优势菌种，对金黄色葡萄球菌和肺炎链
球菌均有抑制作用。野生及栽培甘草的多糖类成
分、内生真菌对金黄色葡萄球菌和肺炎链球菌均无
抑制作用。本实验供试品的各组浓度皆为2mg /
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表 5 甘草有效成分及有效内生菌对金黄色葡萄球菌的 MIC测定结果(48 h)
供试菌 浓度/(mg /mL) YH YZ ZH ZZ JTYB-001 JTYB-053 JTZB-001
金黄色葡萄球菌 2 － － － － － － －
1 － － － － + － +
0. 5 － － － － + + +
0. 25 － － － － + + +
0. 125 － － － － + + +
0. 0625 － － － － + + +
0. 0313 + － + － + + +
0. 0156 + + + + + + +
0. 0078 + + + + + + +
0. 0039 + + + + + + +
0 + + + + + + +
注:“ +”表示有细菌生长，“ －”表示无细菌生长
表 6 甘草有效成分及有效内生菌对肺炎链球菌的 MIC测定结果(48 h)
供试菌 浓度/(mg /mL) YH YZ ZH ZZ JTYB-001 JTZB-001
肺炎链球菌 2 － － － － － －
1 － － － － + +
0. 5 － － － － + +
0. 25 － － － － + +
0. 125 － － － － + +
0. 0625 － － － － + +
0. 0313 + － + － + +
0. 0156 + + + + + +
0. 0078 + + + + + +
0. 0039 + + + + + +
0 + + + + + +
注:“ +”表示有细菌生长，“ －”表示无细菌生长
mL，但在实验中发现 JTYB-053 最低浓度为 1 mg /
mL时也能抑制金黄色葡萄球菌的生长，说明该菌种
针对金黄色葡萄球菌的抑菌活性较为明显。有关
JTYB-001、JTZB-001 和 JTYB-053 与甘草有效成分
的相关性有待进一步研究。
参 考 文 献
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草内生菌的分离和鉴定［J］. 微生物学通报，2007，34
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［3］魏景超． 真菌鉴定手册［M］. 上海:上海科技出版社，
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［5］冯薇，王文全，赵平然 . 栽培年限和采收期对甘草总皂
苷、总黄酮含量的影响［J］. 中药材，2008，31 (2) :184-
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［6］丛媛媛，热娜·卡斯木，帕丽达·阿不力孜，等．新疆胀
果甘草多糖的提取及其体外抗氧化活性［J］. 中药材，
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