全 文 ：中国食用 菌 仑乃扭 LE U F NGIO P C匆I NA Vo l . x x, No . ,
松口蘑菌丝原生质体分离条件的研究
曾荣鉴 马爱民
(上海市农业科学陀食用菌研究所 1 12 0 0 6》
原质生体数目x; s、ml
摘 要
本丈比较 了不 同酶浓度 、 渗透压稳定剂 、 醉解遥度 、
薛解时间、 醉解系炕 pH位和苗丝生理状 况等因素时松口 蘑
菌丝原生质体分离的影响 。 实脸结果衣明 , 1 克菌丝采 用
2 %单一容壁腾L YWA L L ZYME 以 。 . 6M 甘 露酵作渗连压
稳定剂 , PH 6 . 6 , 3 0℃下薛解 4 小时 , 可得到 x o 7m/ l原生
质体 。
关键词 松口蘑 溶壁条件 尿生质体
松 口蘑 (犷r i心h o l o 川 a o a t s川。 k 。 ) 菌肉肥厚 ,
香气浓郁 , 风味绝佳 , 素被视为菇中珍品 。
本文报道了松口蘑菌丝原生质体的分离条件 ,
为通过生物技术开发菌根菌遗传资像提供初步的基
础 。
材 料 与 方 法
(一 ) 材料 : 1 . 菌株 : 松口蘑菌株由本所菌种
保藏中心 (S I E F ) 提供。
2
. 培养基 : 菌丝培养基 P D Y : 马 铃薯 2。% ,
葡萄糖2 。 0% , 醉母粉。 。 2% , pH值自然。 原生 质
体培养基M Y G : 麦芽糖 i 。克 , 萄韧搪 4克 , 醉母
粉 4克 , 甘礴醉。 . 6M , 燕馏水1 0 00皿 1, 固体加凉
脂粉 15 克。
3
. 酶制荆 . 溶壁酶L YW A L L ZY M E (广东徽
生物研究所生产 ) 。
4
. 渗透压稳定剂 : 分析纯甘露醇 , 旅精 , K以 , ’
M g S O 一
。
(二 ) 方法: 1 .菌丝培养: 松口蘑菌丝经玻璃
研磨器磨成碎段 , 均匀接入 PD Y培养基 中 , 2 5℃
恒温培养。
2
. 酶液配制 . 称取所需浓度的酶 (W / V ) 用
渗透压稳定剂溶解 , 经。 . 45 卜。 孔径的细菌滤膜 过
滤除菌使用 。
3
. 不同p H值渗透压稳定剂配制 : 用 I N H C I和
I N N a O H调制 , p H S一 3 C型酸度计测定 。
4
. 原生质体分离 : 过滤松 口蘑 菌 丝 , 离 心 洗
涤 , 用滤纸吸千水分后加酶液在所需温度下酶解 ,
经脱脂棉过滤 , 除去残余菌丝体 , Z 0 00rP m离心 10
分钟收集原生质体。
5
. 原生质体计数 : 血球计数板计数 , 放大倍数
为 1 5 X 4 0 .
结 果
(一 ) 苗浓度对原生质体分离的影晌 : 适宜的
工具酶及浓度是菌丝细胞壁溶解 、 原生质体分离的
关键 。 在试验的溶壁酶浓度中 , 2 . 0%可达到较好的
原生质体分离效果 。 1 . 5% 以下原生质体分离 效 果 ·
较差 , 2 · 5%及 3 . 0% 的浓度其原生质体分离效果每
2
.
0%没有明显的差异 (图一 ) 。
夕勺_ /刁 /
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` . ` 夕 J 办 J 寸 夕户
田 - 、 跳浓度对原生质体分禽的影响
。 。 l免盆蔺丝 3。七蜂解 4 小时结果 , 分列以。 . 毛M
甘落璐和M`6 0 。作渗进压越定耐`
(二 ) 幼班压粗定荆对原生康体分禽的形晌 :
渗透压稳定荆对原生质体的分离有重要影响 。 表一
的结果表明 , 松口蘑菌丝在有机物作渗透压稳定刘
时脱壁效果显奢好于无机盐 , 以甘露醇作渗透压稳
定剂时 , 1克湿菌丝可获得 1 . 2 S x 1 0 7 / m l 原生质体 ,
而 M g S O ` 作渗透压稳定剂时原生质体相对很少 。 ,
表一 、 渗透压稳定剂对原生质体分离的影响
渗透压稳定剂
原生质体数目
甘摇醇 蔗 糖 K CI 蜿 50 `
1
.
2 5 义 1 0 , 0 . 8 05 义 10 , 0 . 02 , 10 7 0 . 0 1 , 10 7
(个加 l )
1 克湿菌丝 、 s0 ℃ 、 2 . 。%溶壁璐 、 p l通6 . 5睁解 4
小 时结果 , 各渗透压 稳定均为。 . 6M 。
(三 ) P H值对原生质体分离的影晌 : 酶 液 缓
冲液的 p H值主要影响酶及渗透压稳定剂的活 性 。 ,
试验结果表明 , 以甘露作渗透压稳定剂时 , p H S . e
为最好脱壁条件 , K C I为渗透压稳定剂时脱壁效果
较差 , 但仍表现出一定的趋势 , 以 p H S~ 5 . 5偏 酸 「
为好 (图二 ) 。
第 1 1卷 第 3期 中网食用成 ED B I比爪 V脚卿 甲一 CH IN A
口. 口. . . . . 州. . . . . . . . . . . . . . . 曰. . 口. , . .
k e l
原生质体数目x甘之日1
『 尔5 `办 ` 少
图二 pH值对原生质体分离的影响
(四 ) 菌丝生理状况对原生质体分离的影响 :
不同培养天数影响菌丝细胞壁的生理状况 。 试验表
明 , 用 P D Y培养 10 天的菌丝适于分离原生 质 体 ,
而培养 5 天较幼嫩的松 口蘑菌丝却不适于分离原生
质体 , 菌丝培养超过 15 天 , 原生质体的释放明显减
少 (表二 ) 。
表二 菌丝生理状况对原生质体分离的影响
菌 龄 (天 ) 1 0 13 15
原生质体数目
(个 /m l ) 5 x 1 0 5 1
.
2 5 火 1 0 6 0 . 8 x 10 6 5 x 1 0 5
。 . 1克湿菌丝 、 30 ℃ 、 2 . 。%容壁酶 、 p H 6 . 5 的甘露醉
作稳渗刘 , 薛解 ` 小时结果。
(五 ) 醉解时间对原生质体分离的影响 : 松 口
蘑菌丝酶解 30 ~ 60 分钟后观察到释放原生质体 , 在
4 ~ 5 小时达到最大值 , 酶解 6 小时未见原生质体
明显增加 , 8 小时后原生质体逐渐减少 。
(六 ) 醉解沮度对原生质体分离的影响 : 试验
作 2 0 ℃ 、 2 5℃ 、 50℃ 、 35℃四种处理 , 酶解 4小时
的结果表明 , 30 七最适于松口蘑菌丝释 放 原 生 质
体 , 与一般栽培食用菌相同。
(七 ) 松口落原生质体观寮及再生 : 在显微镜
下观察 , 松口蘑原生质体直径约 2 ~ 10 协m , 比 香
菇和平菇原生质体稍大 。 将精制的原生质体直接涂
在平板固体再生培养基上和在掖体再生培养基 里再
生 , 25 ℃恒温培养。 显微镜下观察到液体再生培养
基里的球形原生质体直接产生一个或多个芽曹 , 长
成菌丝 , 在固体培养基上 , 原生质体先发育成芽状
细胞 , 然后这些细胞再生芽管 , 长成菌丝 , 10 ~ 12
天再生出肉眼可见菌落 。 经统计 , 原生质体再生率
只有 2 . 4 x 10 一 ` 。松口蘑原生质体的再生条件正在进
一步研究中。
计 论
M as axn i
, 人 , (1 9 82) 曾报道用纤维素 酶 、
发酵酶和葡萄昔酸酶等三种混合酶分离松口蘑原生
质体 , 但对原生质体分离的数量及渗透压稳定剂 、
p H值等条件对原生质体分离的影响没有报道 。 本
文较详细地对松 口蘑原生质体分离的条 件 作 了 研
究 , 结果表明 , 松 口蘑原生质休比一般栽培食用菌
难于分离 , 平菇及香菇用 0 . 1克菌丝 1 . 5 %溶壁酶就
可分离到 1。 ? / m l以上原生质体 , 而松 口蘑则需 1 克
菌丝 2 . 0%溶壁酶的条件下才有可能达到 1 0 7 / m l 。
一般认为 , 无机盐作渗透压稳定剂对丝状真菌原生
质体分离较为有效 , 但我们的研究发现松口蘑原生
质休的分离对渗透压稳定剂和酶解系统的 p H 值非
常敏感 , 有机试剂作渗透压 稳 定 剂 以 及 近 中性
( p H 6
.
5) 的酶解系统是松口蘑原生质体分离的最
适条件。 本研究通过分析这些特殊条件 , 成功地用
单一国产溶壁酶分离到 1 0 7 / m l 以上原生质体 。 松
口蘑原生质体分离的这些特殊条件需求可能与菌根
菌特殊的细胞壁结构密切相关 。
今考文献略
C O N D I T IO N S F O R I S O L A T IO N O F P R O T O P L A S T S F RO M
M Y C E L I A O F T 天 I C H O L O M 月 M 月T S U T月K E
Z e n g Ro n g l la
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M a Aim in
( Ed i b le F u n g i R e se a r e h I n s t i tu t e
,
Sh a o g h a i A ca d e m y o f A g r ie u lt ur a l S c ie n e e s
,
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a n g il a i
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2 0 1 10 6)
AB S T RAC T
P r o t o p l a s t 15 i m p o r t a n t m a t e r i a l f o r t h e s t u d y o f g e n e t i e a n d b r e e di n g o f e d ib l e f u n g i
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T h e e f f e e t s o f d i f f e r e n t o s m o t i e s t a b i l i z e r
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P r e l im i n a r y e x p e r im e n t s r e v e a l e d t h a t 10了加 1 p r o t o p l a s t s e a n b e o b t a i n e d a t 3 0℃
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,
P H 6
.
5 , o
.
6M
m a n n i t o l a s o s m o t i e s t a b主l i z e r .
Ke y w o r d s T r iC` o l o m a m a t` 。 t a k e e o n d i t i o n o f w a l l d e g r a d a t i o n p r o t o P l a s t