全 文 ：连作对白肋烟根际土壤细菌群落多样性的影响*
陈冬梅1摇 柯文辉1,2摇 陈兰兰1,2摇 黄锦文1摇 吴文祥1,2摇 陈摇 婷1,2摇 张重义1,3摇 林文雄1,2**
( 1 福建农林大学农业生态研究所,福州350002;2福建农林大学生物农药与化学生物学教育部重点实验室,福州350002;
3 河南农业大学农学院, 郑州 450000)
摘摇 要摇 以种植白肋烟 1 年、2 年和 4 年的土壤为研究对象,采用末端限制性片段长度多态性
(T鄄RFLP)技术分析根际土壤细菌群落的动态变化.结果表明:白肋烟根际土壤细菌群落香农
指数和丰富度指数随着种植年限的增加呈现出先增后减的趋势,连作 4 年后细菌群落的多样
性水平显著降低,细菌群落结构较单一.随着种植年限的增加,根际土壤细菌群落与对照的相
似性指数逐渐降低.种植年限为 1 年、2 年的土壤和对照土壤中放线菌门放线菌纲是优势类
群,种植年限为 4 年的土壤中放线菌纲所占的比例下降,而厚壁菌门的芽孢杆菌纲成为优势
类群.白肋烟连作使根际鞘氨醇单胞菌属和链霉菌属等益生菌数量减少、蜡状芽孢杆菌等潜
在致病菌增加,破坏了烟草根际土壤微生物群落的平衡,使其微生态环境恶化.
关键词摇 连作摇 白肋烟摇 根际土壤摇 细菌群落摇 T鄄RFLP
文章编号摇 1001-9332(2010)07-1751-08摇 中图分类号摇 S572摇 文献标识码摇 A
Diversity of bacterial community in rhizosphere soils under effects of continuously planting
burley tobacco. CHEN Dong鄄mei1, KE Wen鄄hui1,2, CHEN Lan鄄lan1,2, HUANG Jin鄄wen1, WU
Wen鄄xiang1,2, CHEN Ting1,2, ZHANG Zhong鄄yi1,3, LIN Wen鄄xiong1,2 ( 1 Institute of Agroecology,
Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China; 2Ministry of Education Key La鄄
boratory of Biopesticide and Chemical Biology, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou
350002, China; 3College of Agronomy, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450000, Chi鄄
na) . 鄄Chin. J. Appl. Ecol. ,2010,21(7): 1751-1758.
Abstract: By using T鄄RFLP approach, this paper studied the dynamic changes of bacterial commu鄄
nity in the rhizosphere soils under continuously planting burley tobacco for 1, 2 and 4 years. With
the increasing of continuous planting years, the Shannon index and Margalef index of bacterial com鄄
munity in the rhizosphere soils decreased after an initial increase. After 4鄄year continuous planting,
the diversity of the bacterial community decreased significantly, and the community structure be鄄
came simple. The similarity coefficient of the bacterial community in the rhizosphere soils of contin鄄
uously planting burley tobacco for 1 and 2 years and of the control was decreased with increasing
year of continuous planting. Actinobacteria were predominant in the soils under 1 and 2 years con鄄
tinuous planting and in the control, but decreased in the soil continuously planted with burley tobac鄄
co for 4 years, in which, Bacilli of Firmicute was the dominant. It was suggested that continuously
planting burley tobacco could result in the decrease of beneficial microbes such as Sphingomonas
and Streptomyces while increase the species of pathogenic bacteria such as Bacillus cereus in rhizo鄄
sphere soil, which in return, could lead to the imbalance of bacterial community and deteriorate the
micro鄄ecological conditions in rhizosphere soil.
Key words: continuous planting; burley tobacco; rhizosphere soil; bacterial community; T鄄RFLP
approach.
*国家自然科学基金项目(30772729)、福建省生态学重点学科项目
(0608537)和福建省高校服务海西建设重点项目(0b08b006)资助.
**通讯作者. E鄄mail: wenxiong181@ 163. com
2009鄄09鄄31 收稿,2010鄄04鄄15 接受.
摇 摇 烟草是我国最重要的经济作物之一,属于茄科
(Solanaceae)、忌连作的作物,因其较高的经济效益
而被大量种植.囿于宜烟耕地面积的有限性和水源
条件的相对不足,烟草生产很难安排合理的水旱轮
作,在各大烟区烟草连作已是一种普遍现象[1] . 连
作造成烟草病虫害增多,产量与品质下降[2-4],如何
解决连作障碍是烟草生产中亟待解决的问题.
连作障碍形成及加重发生的原因是复杂的,是
应 用 生 态 学 报摇 2010 年 7 月摇 第 21 卷摇 第 7 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
Chinese Journal of Applied Ecology, Jul. 2010,21(7): 1751-1758
根际土壤系统内部诸多因素综合作用的外在表现,
导致其发生的因素包括土壤理化性状劣变、土壤的
传染性病害和根际分泌物引起的自毒作用等[5-8] .
近年来,一些学者研究认为,根系分泌物对土壤生
物,特别是土传病害的病原生物的选择性促进并由
此导致土壤微生态系统失衡,是引发连作障碍的主
要因素[9-13] .一般来说,细菌在土壤微生物类群中占
主要部分,它在植物根系的微生态环境中对物质和
能量的转化起重要作用[14] .然而,造成烟草连作土壤
微生物区系特别是未培养微生物连续变化的研究还
鲜见报道.为此,本文从根际微生物微生态角度出发,
采用 T鄄RFLP技术研究烟草不同连作年限根际土壤
细菌群落动态变化,对于深入探讨烟草连作障碍发生
机理与消减技术有着重要的理论与实际意义.
1摇 材料与方法
1郾 1摇 供试材料
种植年限为 1 年和 3 年的白肋烟根际土壤和邻
近未种植烟草的对照土均采自湖北恩施烟草基地.
将不同种植年限的土壤继续种植白肋烟,形成盆栽
0 年(CK)、1 年、2 年和 4 年的种植体系,各重复 6
次.于白肋烟团棵期和成熟期,采用抖根法,每个处
理分别取 3 盆根际土壤,充分混匀后迅速保存于
-80 益超低温冰箱中,用于土壤 DNA的提取.
1郾 2摇 测定方法
采用末端限制性片段长度多态性( terminal re鄄
striction fragment length polymorphlsm,T鄄RFLP)技术
分析土壤细菌群落,具体方法如下:
1)土壤微生物 DNA 的提取与纯化摇 土壤微生
物总 DNA 的提取采用 SDS鄄高盐缓冲液抽提
法[15-16] . 1%琼脂糖凝胶电泳检测后,用 UNIQ鄄10 柱
式 DNA胶回收试剂盒(上海生物工程公司)回收纯
化,电泳检测后保存于-20 益备用.
2)细菌 16S rDNA 的扩增和酶切 摇 用带 FAM
荧光标记的细菌通用引物 8F鄄FAM(5爷鄄AGAGTTT鄄
GATCCTGGCTCAG鄄3爷)和 926R(5爷鄄CCGTCAATTC鄄
CTTTRAGTTT鄄3爷)扩增 16S rDNA片段. PCR扩增采
用 4 管平行,反应体系 25 滋l 包括:10 伊PCR Buffer
2郾 5 滋l (含 Mg2+),dNTP(25 滋mol·L-1) 2 滋l,引物
(10 滋mol·L-1 )各 0郾 8 滋l, rTaq 酶 0郾 15 滋l, BSA
2 滋l,模板 1 滋l.反应条件:94 益预变性 5 min;94 益
变性 1 min,49郾 5 益退火 45 s,72 益延伸 1 min,35 个
循环;最后 72 益延伸 3 min.取 5 滋l用 1%琼脂糖凝
胶进行电泳检测. 4 管混合后用 UNIQ鄄10 柱式 DNA
胶回收试剂盒回收.纯化后的 PCR产物用限制性内
切酶 Msp玉和 Hae芋分别进行酶切. Msp玉酶切体系
20 滋l包括:1 滋l Msp玉,2 滋l T伊Buffer,2 滋l BSA,5 滋l
ddH2O,10 滋l PCR 产物,37 益温浴 5 h. HaeIII 酶切
体系 30 滋l 包括:1滋l Msp玉,2 滋l H 伊Buffer,7 滋l
ddH2O,10 滋l PCR 产物,37 益温浴 5 h.
3)毛细管电泳与测序分析 摇 酶切产物脱盐后
与上样缓冲液和标准 Marker(GeneScan鄄500郾 1, Ap鄄
plied Biosystems)混合,96 益变性 4 min,迅速置于冰
上,然后在 ABI 自动测序分析仪(Model 3130 Ap鄄
plied Biosystems)上进行毛细管电泳.
1郾 3摇 数据分析
毛细管电泳的结果采用 GeneMarker V1郾 2 软件
分析,分析参数参照 Soft Genetic Application Note Ju鄄
ly, 2006. 细菌序列的长度与 Ribosomal Database
Project II数据库进行对比,找出 T鄄RFs 所对应的细
菌类群 ( http: / / wdcm. nig. ac. jp / RDP / trflp / # pro鄄
gram).每个 T鄄RF的丰度百分比(Ap)按照公式 Ap =
ni / N伊100 计算,其中 ni 代表每个可分辨的 T鄄RF 的
峰面积,N代表所有 T鄄RF 峰面积的总和. 种群多样
性指数[17] 用 BIO鄄DAP 软件计算. 依据公式 Cs =
2NA+B / (NA+NB)计算样品之间 Sorenson[18-19]的相似
系数,其中 NA+B指两样品共有的条带数目, NA、NB
指两样品各自包含的条带数目.
2摇 结果与分析
2郾 1摇 白肋烟不同种植年限根际土壤细菌群落Msp玉
和 Hae芋酶切的 T鄄RFLP图谱分析
将 PCR产物分别用限制性切酶Msp玉、Hae芋进
行酶切,毛细管电泳后采用 GeneMarker V1郾 2 软件
对测序进行处理(图 1,图 2),从中可以看出,不同
种植年限白肋烟根际细菌群落在团棵期和成熟期均
存在明显差异.
2郾 2摇 白肋烟不同种植年限根际土壤细菌群落结构
多样性变化
白肋烟不同种植年限根际土壤细菌群落的香农
指数在不同生育时期均比对照显著增加,随着连作
年限的增加,团棵期和成熟期根际土壤细菌群落香
农指数变化趋势分别为 2 年>4 年>1 年>对照和 1
年>2 年>4 年>对照(表 1).
团棵期根际土壤细菌群落的丰富度指数均小于
对照,变化趋势为 4 年<2 年<1 年<对照,种植 4 年
的根际土壤细菌群落的丰富度指数比对照降低了
31郾 5% ;在成熟期随着连作年限的增加根际土壤细
2571 应摇 用摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 21 卷
图 1摇 不同种植年限白肋烟根际土壤细菌群落 Msp玉酶切的 T鄄RFLP图谱
Fig. 1摇 T鄄FRLP profiles digested by Msp玉 of the bacterial community in the rhizosphere soil mediated by replanted burley tobacco in
cropping sequence for different years.
R:团棵期 Resettling period; M:成熟期 Mature period郾 1、2、4 为种植年 1, 2 and 4 stood for cropping years. 下同 The same below.
菌群落丰富度指数变化趋势为 2 年>1 年>对照>4
年,种植 4 年的根际土壤细菌群落的丰富度指数比
对照降低了 31郾 1% . 可见,植烟土壤根际细菌多样
性水平随种植年限的增加呈先增加后减少的趋势.
2郾 3摇 白肋烟不同种植年限根际土壤细菌群落结构
相似性
从白肋烟不同种植年限团棵期和成熟期土壤细
表 1摇 白肋烟连作根际土壤细菌群落多样性指数变化
Tab. 1摇 Changes in diversity index of bacterial community
in rhizosphere soil under continuously cropping burley to鄄
bacco
处理
Treatment
香农指数
Shannon index
团棵期
Resettling
period
成熟期
Mature
period
丰富度指数
Margalef index
团棵期
Resettling
period
成熟期
Mature
period
对照 CK 2郾 61d 2郾 57c 8郾 25a 7郾 56c
1 年 One鄄year 2郾 85c 3郾 30a 8郾 17a 9郾 12b
2 年 Two鄄year 3郾 21a 3郾 07b 7郾 60b 10郾 15a
4 年 Four鄄year 2郾 94b 2郾 99b 5郾 65c 5郾 21d
同列不同小写字母表示差异显著(P<0郾 05) Different small letters in
the same column indicated significant difference at 0郾 05 level.
菌群落结构相似性系数分析(表 2)可知,与对照土
壤的根际细菌群落结构相似性比较,随着种植年限
的增加相似性系数逐渐下降,表明随着种植年限的
增加,根际土壤的细菌群落逐渐发生变化,群落功能
差异变大.同一种植年限团棵期与成熟期之间的根
际土壤细菌群落相似系数均较大,说明彼此之间的
差异性较小,群落结构较相似. 从表 2 还可看出,种
植 4 年的根际土壤细菌群落与 CK、1 年、2 年的相似
系数均小于 0郾 5,说明种植 4 年后白肋烟根际土壤
细菌群落发生了较大变化.
2郾 4摇 白肋烟不同种植年限根际土壤细菌群落组成
从表 3 可以看出,供试土样共检测到细菌类群
12 个门,包括 20 纲. 随着白肋烟种植年限的增加,
土壤中所涵盖的细菌类群总纲数减少,变化趋势为
1 年(17 个)>2 年(16 个)>4 年(8 个).在种植 1 年
和 2 年的土壤中存在,对照土和种植 4 年的土壤中
未见的纲有柔膜菌纲、 拟杆菌纲. 在对照土
以及种植1年和2年的土壤中存在,在种植4年的
35717 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 陈冬梅等: 连作对白肋烟根际土壤细菌群落多样性的影响摇 摇 摇 摇 摇
图 2摇 不同种植年限白肋烟根际土壤细菌群落 HAE芋酶切的 T鄄RFLP图谱
Fig. 2摇 T鄄FRLP profiles digested by HAE芋 of the bacterial community in the rhizosphere soil mediated by replanted burley tobacco in
cropping sequence for different years.
土壤中却没有的纲有 啄鄄变形菌纲、黄杆菌纲、鞘脂
杆菌纲和热微菌纲. 可见,随着连作年限的增加,根
际土壤中细菌群落结构逐渐趋于单一.
种植 1 年、2 年的土壤和对照土中放线菌纲在
整个细菌群落中处于重要地位,所占的丰度比例分
别为 24郾 47% 、24郾 42%和 23郾 81% ,种植 4 年的土壤
放线菌纲所占的比例下降到 11郾 43% (表 3). 放线
菌次生代谢产物中的生物活性物质对一些病原菌会
产生拮抗作用[20],因此放线菌纲数量的减少会加剧
对植物的不利影响.随着连作年限的增加,厚壁菌门
的芽孢杆菌纲在根际土壤细菌群落中所占的丰度增
加,在种植 4 年的土壤中厚壁菌门的芽孢杆菌纲大
幅上升,所占比例达到 25郾 71% .
2郾 5摇 白肋烟种植年限为 1 年和 4 年的根际土壤细
菌群落 T鄄RFs片段分析
从白肋烟种植 1 年和 4 年的成熟期根际土壤细
表 2摇 白肋烟连作根际土壤细菌群落的相似性系数
Tab. 2摇 Similarity coefficient of microbial community in rhizosphere soil under continuously cropping burley tobacco
处理 CK鄄R CK鄄M 1鄄R 1鄄M 2鄄R 2鄄M 4鄄R 4鄄M
CK鄄R 1
CK鄄M 0郾 757 1
1鄄R 0郾 649 0郾 633 1
1鄄M 0郾 512 0郾 554 0郾 591 1
2鄄R 0郾 526 0郾 542 0郾 560 0郾 595 1
2鄄M 0郾 500 0郾 485 0郾 481 0郾 550 0郾 615 1
4鄄R 0郾 431 0郾 451 0郾 443 0郾 486 0郾 475 0郾 481 1
4鄄M 0郾 453 0郾 425 0郾 413 0郾 451 0郾 419 0郾 449 0郾 510 1
R:团棵期 Resettling period; M:成熟期 Mature period郾 1、2、4 为种植年限 1,2 and 4 stood for cropping years.
4571 应摇 用摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 21 卷
表 3摇 白肋烟连作根际土壤细菌差异片段的比较
Tab. 3摇 Comparison of different microbial T鄄RF fragments in rhizosphere soil under continuously cropping burley tobacco
门 Phylum 纲 Class 所占比例 Percentage (% )
对照 CK 1 年 One鄄year 2 年 Two鄄year 4 年 Four鄄year
变形菌门 Proteobacteria 琢鄄变形菌纲 Alpha Proteobacteria 19郾 05 15郾 96 15郾 12 17郾 14
茁鄄变形菌纲 Beta Proteobacteria 4郾 76 8郾 51 4郾 65 17郾 14
着鄄变形菌纲 Epsilon Proteobacter 4郾 76 0 0 0
酌鄄变形菌纲 Gamma Proteobacteria 9郾 52 8郾 51 8郾 30 11郾 43
啄鄄变形菌纲 Delta Proteobacteria 2郾 38 2郾 13 3郾 49 0
厚壁菌门 Firmicutes 芽孢杆菌纲 Bacilli 4郾 76 11郾 70 12郾 63 25郾 71
梭菌纲 Clostridia 4郾 76 4郾 26 3郾 49 11郾 43
柔膜菌纲 Mollicutes 0 2郾 13 3郾 49 0
放线菌门 Actinobacteria 放线菌纲 Actinobacteria 23郾 81 24郾 47 24郾 42 11郾 43
螺旋体门 Spirochaetes 螺旋体纲 Spirochaetes 4郾 76 2郾 13 4郾 65 2郾 86
拟杆菌门 Bacteroidetes 黄杆菌纲 Flavobacteria 4郾 77 8郾 51 6郾 98 0
鞘脂杆菌纲 Sphingobacteria 11郾 90 4郾 26 6郾 98 0
拟杆菌纲 Bacteroidetes 0 1郾 06 1郾 16 0
栖热菌门 Thermus 异球菌纲 Deinococcus 0 2郾 13 0 0
梭杆菌门 Fusobacteria 梭杆菌纲 Fusobacteria 0 1郾 06 0 0
纤维杆菌门 Fibrobacteres 纤维杆菌纲 Fibrobacteres 0 0 1郾 16 0
浮霉菌门 Planctomycetes 浮霉菌纲 Planctomycetacia 0 0 1郾 16 0
硝化螺旋菌门 Nitrospirae 硝化螺旋菌纲 Nitrospira 2郾 38 1郾 06 1郾 16 2郾 86
热微菌门 Thermomicrobia 热微菌纲 Thermomicrobia 2郾 39 1郾 06 1郾 16 0
广古菌门 Euryarchaeota 甲烷杆菌纲 Methanobacteria 0 1郾 06 0 0
表 4摇 白肋烟种植 1 年和 4 年根际土壤细菌的共有片段
Tab. 4摇 Same T鄄RFs fragments in rhizosphere soil mediated by replanted burley tobacco in the cropping sequence for one
and four years
片段长度
Fragment length (bp)
Msp玉 Hae芋
Msp玉 Ap(% )
1 年
One鄄year
4 年
Four鄄year
对应菌种[25]
Candidate species
分类
Classification
73 224 1郾 15 0郾 55 产气真杆菌 Eubacterium aerofaciens 厚壁菌门梭菌纲 Clostridia, Firmicutes
80 205 0郾 60 1郾 93 钩端螺菌 Leptospirillum 硝化螺旋菌门硝化螺旋菌纲 Nitrospira, Nitrospirae
88 227 1郾 39 0郾 64 米氏西蒙斯氏菌 Simonsiella muelleri 变形菌门 茁鄄变形菌纲 Beta Proteobacteria, Pro鄄teobacteria
125 221 0郾 99 1郾 00 慢生根瘤菌 Mesorhizobium loti 变形菌门 琢鄄变形菌纲 Alpha Poteobacteria, Pro鄄teobacteria
145 192 1郾 53 0郾 65 氯盐红螺菌 Halorhodospira halochloris 变形菌门 酌鄄变形菌纲 Gamma Proteobacteria, Pro鄄teobacteria
148 293 15郾 60 2郾 75 马阔里类孢芽孢杆 Paenibacillus macquar鄄iensis 厚壁菌门 芽孢杆菌纲 Bacilli, Firmicutes
150 193 8郾 90 0郾 79 浮游产卟啉杆菌 Porphyrobacter neustonen鄄sis
变形菌门 琢鄄变形菌纲 Alpha Proteobacteria, Pro鄄
teobacteria
150 193 温浴产卟啉杆菌 Porphyrobacter tepidarius 变形菌门 琢鄄变形菌纲 Alpha Proteobacteria, Pro鄄teobacteria
150 227 食芳鞘氨醇单胞菌 Sphingomonas aromati鄄civorans
变形菌门 琢鄄变形菌纲 Alpha Proteobacteria, Pro鄄
teobacteria
150 227 荚膜鞘氨醇单胞菌 Sphingomonas capsula鄄ta
变形菌门 琢鄄变形菌纲 Alpha Proteobacteria, Pro鄄
teobacteria
150 227 鞘氨醇单胞菌 Sphingomonas stygia 变形菌门 琢鄄变形菌纲 Alpha Proteobacteria, Pro鄄teobacteria
150 227 地下鞘氨醇单胞菌 Sphingomonas subterra鄄nean
变形菌门 琢鄄变形菌纲 Alpha Proteobacteria, Pro鄄
teobacteria
150 227 矢野 口 鞘 氨 醇 单 胞 菌 Sphingomonasyanoikuyae
变形菌门 琢鄄变形菌纲 Alpha Proteobacteria, Pro鄄
teobacteria
161 227 1郾 16 0郾 77 阿美尼亚链霉菌 Streptomyces armeniacus 放线菌门放线菌纲 Actinobacteria, Actinobacteria
161 227 布鲁链霉菌 Streptomyces bluensis 放线菌门放线菌纲 Actinobacteria, Actinobacteria
161 227 马书链霉菌 Streptomyces mashuensis 放线菌门放线菌纲 Actinobacteria, Actinobacteria
161 227 热淀粉梅链霉菌 Streptomyces thermodia鄄staticus 放线菌门放线菌纲 Actinobacteria, Actinobacteria
55717 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 陈冬梅等: 连作对白肋烟根际土壤细菌群落多样性的影响摇 摇 摇 摇 摇
菌群落共有的 T鄄RFs 片段可看出(表 4),2 种土壤
样品中相同的有效片段有 8 个,其中包括清理土壤
有毒物质最有效的微生物类群之一变形菌门 琢鄄变
形菌纲的鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas),它可以
降解芳香族化合物[21],促进作物抵抗多种病原
菌[22-23],其片段(150 和 227)在 Msp玉酶切图谱中
占土样细菌群落中峰面积比例从种植 1 年的
8郾 90%降低到种植 4 年的 0郾 79% ;对土壤中有机物
矿化起积极作用、能产生抗生素的放线菌门放线菌
纲的链霉菌属 ( Streptomyces) [24],其片段 (161 和
227)在 Msp玉酶切图谱中占土样细菌群落中峰面积比
例从种植1年的1郾 16%降低到种植4年的0郾 77%;潜
在的致病菌硝化螺旋菌门硝化螺旋菌纲的钩端螺菌
(Leptospirillum),其片段(80 和 205)在 Msp玉酶切图谱
中占土样细菌群落中峰面积比例从种植 1 年的
0郾 60%增加到种植4年的1郾 93% .由此可见,随着种
表 5摇 种植 4年白肋烟根际土壤细菌特有的 T鄄RFs片段(与种植 1年对比)
Tab. 5摇 Unique T鄄RFs fragments in rhizosphere soil mediated by replanted burley tobacco in the cropping sequence for four
years compared with that for one year
片段长度
Fragment length (bp)
Msp玉 Hae芋
对应菌种[25]
Candidate species
分类
Classification
73 216 产气真杆菌 Eubacterium aerofaciens 厚壁菌门梭菌纲 Clostridia, Firmicutes
88 206 动物奈瑟氏球菌 Neisseria animalis 变形菌门 茁鄄变形菌纲 Beta Proteobacteria, Proteobacteria
88 206 长瑟氏球菌 Neisseria elongata 变形菌门 茁鄄变形菌纲 Beta Proteobacteria, Proteobacteria
125 222 根瘤菌属 Rhizobium 变形菌门 琢鄄变形菌纲 Alpha Proteobacteria, Proteobacteria
125 260 螺旋杆菌属 Heliobacterium gestii 厚壁菌门梭菌纲 Clostridia, Firmicutes
136 209 芽孢杆菌属 Bacillus stearothermphilus 厚壁菌门芽孢杆菌纲 Bacilli, Firmicutes
136 233 热溶芽孢杆菌 Bacillus caldolyticus 厚壁菌门芽孢杆菌纲 Bacilli, Firmicutes
136 233 热速芽孢杆菌 Bacillus caldovelox 厚壁菌门芽孢杆菌纲 Bacilli, Firmicutes
138 216 柱状真杆菌 Eubacterium cylindroids 厚壁菌门梭菌纲 Clostridia, Firmicutes
145 232 金黄微杆菌 Microbacterium aurum 放线菌门放线菌纲 Actinobacteria, Actinobacteria
145 323 海球菌属 Marinobacter 变形菌门 酌鄄变形菌纲 Gamma Proteobacteria, Proteobacteria
147 206 硫杆菌属 Thiobacillus halophilus 变形菌门 茁鄄变形菌纲 Beta Proteobacteria, Proteobacteria
147 229 硫氨素芽孢杆菌 Aneurinibacillus aneurinilyticus 厚壁菌门芽孢杆菌纲 Bacilli, Firmicutes
147 232 无害利斯特菌 Listeria innocua 厚壁菌门芽孢杆菌纲 Bacilli, Firmicutes
147 232 伊氏利斯特氏菌伦敦亚种 Listeria ivanovii subsp郾 ivanovii 厚壁菌门芽孢杆菌纲 Bacilli, Firmicutes
147 232 单核细胞增生利斯特菌 Listeria monocytogenes 厚壁菌门芽孢杆菌纲 Bacilli, Firmicutes
147 232 利斯特菌属 Listeria monocytogenes 厚壁菌门芽孢杆菌纲 Bacilli, Firmicutes
147 232 利斯特菌属 Listeria seeligeri 厚壁菌门芽孢杆菌纲 Bacilli, Firmicutes
147 233 梭形气芽孢杆菌 Baillus fusiformis 厚壁菌门芽孢杆菌纲 Bacilli, Firmicutes
147 260 嗜盐红螺菌属 Halorhodospira halophila 变形菌门 酌鄄变形菌纲 Gamma Proteobacteria, Proteobacteria
147 311 蜡状芽孢杆菌 Bacillus cereus 厚壁菌门芽孢杆菌纲 Bacilli, Firmicutes
147 311 芽孢杆菌 Bacillus mycoides 厚壁菌门芽孢杆菌纲 Bacilli, Firmicutes
147 311 芽孢杆菌 Bacillus pseudomycoides 厚壁菌门芽孢杆菌纲 Bacilli, Firmicutes
147 311 芽孢杆菌 Bacillus sp郾 Str郾 Termite isolateiv 厚壁菌门芽孢杆菌纲 Bacilli, Firmicutes
147 311 芽孢杆菌 Bacillus thuringiensis 厚壁菌门芽孢杆菌纲 Bacilli, Firmicutes
148 233 洛氏利斯特氏菌 Listeria grayi 厚壁菌门芽孢杆菌纲 Bacilli, Firmicutes
150 193 长赤细菌 Erythromonas ursincola 变形菌门 琢鄄变形菌纲 Alpha Proteobacteria, Proteobacteria
150 236 解淀粉类芽孢杆菌 Paenibacillus amylolyticus 厚壁菌门芽孢杆菌纲 Bacilli, Firmicutes
161 221 树状微杆菌 Microbacterium arborescens 放线菌门放线菌纲 Actinobacteria, Actinobacteria
165 229 壤霉菌 Agromyces mediolanus 放线菌门放线菌纲 Actinobacteria, Actinobacteria
165 229 里拉微球菌 Micrococcus lylae 放线菌门放线菌纲 Actinobacteria, Actinobacteria
165 229 布氏密螺旋体 Treponema bryantii 螺旋体门螺旋体纲 Spirochaetes, Spirochaetes
210 258 热苯脱硫肠杆菌 Desulfotomaculum thermobenzoicum 厚壁菌门梭菌纲 Clostridia, Firmicutes
434 222 海红菌 Rhodobium marinum 变形菌门 琢鄄变形菌纲 Alpha Proteobacteria, Proteobacteria
488 198 无色菌属 Achromatium 变形菌门 酌鄄变形菌纲 Gamma Proteobacteria, Proteobacteria
488 198 食酸菌属 Acidororax 变形菌门 酌鄄变形菌纲 Gamma Proteobacteria, Proteobacteria
492 202 红育菌属 Rhodoferax antarcticus 变形菌门 茁鄄变形菌纲 Beta Proteobacteria, Proteobacteria
492 221 除氯菌 Dechlorisoma suilla 变形菌门 茁鄄变形菌纲 Beta Proteobacteria, Proteobacteria
492 221 草螺菌属 Herbaspirillum 变形菌门 茁鄄变形菌纲 Beta Proteobacteria, Proteobacteria
492 221 亚硝化单细胞菌属 Nitrosomonas 变形菌门 茁鄄变形菌纲 Beta Proteobacteria, Proteobacteria
6571 应摇 用摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 21 卷
植年限的增加,根际细菌群落中益生菌减少、病原菌
增加,烟草根际微生态细菌群落的功能受到破坏.
摇 摇 为进一步与种植 1 年的白肋烟成熟期根际土壤
细菌群落对比,将种植 4年的白肋烟成熟期根际土壤
细菌群落中特有的 T鄄RFs片段列于表5,从中可见,种
植 4年的成熟期根际土壤特有细菌包括 4 个门 7 个
纲,分别为变形菌门(琢鄄变形菌纲、茁鄄变形菌纲、酌鄄变
形菌纲)、厚壁菌门(芽孢杆菌纲、梭菌纲)、放线菌门
(放线菌纲)和螺旋菌门(螺旋菌纲).根际土壤细菌
群落中含有与固氮有关的根瘤菌和草螺菌属,与降解
酚酸类有关的微杆菌属等,还存在大量潜在的致病菌
包括瑟氏球菌(88和 206)、螺旋杆菌属(125 和 260)、
利斯特菌(147 和 232,148 和 233)、蜡状芽孢杆菌
(147和 311)、树状微杆菌(161和 221)和布氏密螺旋
体(165和 229)等,其中蜡状芽孢杆菌[3]为烟草剑叶
病的致病菌.
3摇 讨摇 摇 论
T鄄RFLP 技术是一种快速、敏感的用于研究微生
物群落结构动态的方法,其分析优点明显[26] .本文采
用 T鄄RFLP分子技术研究白肋烟连作对根际土壤细
菌群落的影响,突破了传统方法由于可培养微生物有
限,造成大量有益信息丢失的缺憾,更能全面详细地
了解土壤微生物群落结构组成等方面的差异.同时,
本研究采用双酶切的方法,通过叠加靶基因位点,使
待鉴定种属在数据库中的匹配度提高,避免了单酶切
方法带来的误差.
植烟土壤细菌群落香农指数和丰富度指数随着
种植年限的增加呈先增后减的趋势,说明烟株生长产
生的分泌物在低浓度下对细菌群落有促进效应,但种
植 4年的土壤细菌群落多样性水平急剧下降,细菌群
落较单一.吴凤芝等[11]研究表明连作黄瓜土壤微生
物群落多样性指数、丰富度随着种植年限的增加而降
低;李春格等[27]发现在收获期大豆正茬和迎茬处理
的土体微生物多样性高于连作 4 年和 8 年.其研究结
果与本试验基本一致.相似性指数结果表明,随着种
植年限的增加根际土壤之间细菌群落功能会逐渐发
生演替,推测烟草根际土壤细菌群落的变化可能与根
系分泌物在土壤中的积累有关.
烟草连作 4年后,土壤根际分泌物积累到一定浓
度,一方面极大降低了细菌群落结构多样性水平,另
一方面某些特定的微生物群落得到富集,特别是病原
菌,如诸多已被报道的致病菌,其中蜡状芽孢杆菌为
烟草剑叶病致病菌,此病菌会分泌大量有毒分泌物,
干扰植株的氮素代谢,同时伴随着缺钙、镁、钾、磷等
症状,病株常表现不同程度矮化,此症状与烟草连作
外观形态长势表现极吻合.连作导致细菌群落多样性
水平下降和致病菌的增加绝不是偶然现象,而是与连
作及连作产生分泌物密切相关[5,28-29];同时根际微生
物种群与植物的健康状况也有着密切关系[30] .连作
破坏了烟草根际土壤细菌群落的平衡,使烟草的生存
微环境不断恶化,影响了原来生活在土壤中有利于营
养元素转化和能量传递并能促进植物生长的化能细
菌的生存和繁殖,加剧了烟草病害的发生,这一系列
连锁效应严重影响了烟草生产,造成连作障碍.
本研究对不同种植年限(0年、1年、2年、4年)烟
草根际土壤细菌群落的变化规律进行研究,探讨了细
菌群落的演替规律,但对于真菌群落的变化规律,以
及微生物与烟株之间如何互作还需进一步研究.同时
本试验采用的连作年限最多为 4 年,对于种植年限更
长的植烟土壤微生物群落的变化规律如何还有待进
一步揭示.
致谢摇 湖北省烟草科学研究所 /中国烟草白肋烟试验站王毅
在试验取样中给予大力帮助,谨表谢意!
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作者简介摇 陈冬梅,女,1973年生,副教授.主要从事耕作学与
作物化感连作障碍研究,发表论文 10 篇. E鄄mail: dongmeifj@
163. com
责任编辑摇 肖摇 红
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