全 文 ：丛枝菌根真菌系统分类及群落研究技术进展*
刘永俊1,2 摇 冯虎元2**
( 1 西北民族大学生命科学与工程学院, 兰州 730030; 2 兰州大学生命科学学院, 干旱与草地农业生态教育部重点实验室, 兰
州 730000)
摘摇 要摇 丛枝菌根真菌(AMF)是自然生态系统重要的组成部分,能与植物根系形成互惠共生
体.传统的 AMF分类主要依赖于对土壤无性孢子的形态鉴定,具有一定的局限性.近年来基
于核酸分析的分子鉴定技术使 AMF 的分类更具科学性和准确性,补充和完善了基于孢子形
态鉴定所建立的分类系统. AMF群落研究依赖于 AMF的分类鉴定,主要包括孢子形态鉴定和
分子生物学分析两类研究法.本文综述了 AMF的分类系统和群落研究方法,着重介绍了近年
来应用较多的 AMF群落研究的分子生物学技术.作者认为,采取形态与分子相结合的办法将
有助于推动 AMF群落研究和 AMF自然分类系统的建立和完善.
关键词摇 丛枝菌根真菌摇 分类摇 孢子摇 分子技术摇 群落
文章编号摇 1001-9332(2010)06-1573-08摇 中图分类号摇 Q938. 1摇 文献标识码摇 A
Systematic classification and community research techniques of arbuscular mycorrhizal
fungi: A review. LIU Yong鄄jun1,2, FENG Hu鄄yuan2 ( 1College of Life Science and Engineering,
Northwest University for Nationalities, Lanzhou 730030, China; 2Ministry of Education Key Labora鄄
tory of Arid and Grassland Agroecology, School of Life Sciences, Lanzhou University, Lanzhou
730000, China) . 鄄Chin. J. Appl. Ecol. ,2010,21(6): 1573-1580.
Abstract: Arbuscular mycorrhizal fungi (AMF) are an important component of natural ecosystem,
being able to form symbiont with plant roots. The traditional AMF classification is mainly based on
the morphological identification of soil asexual spores, which has some limitations in the taxonomy of
AMF. Advanced molecular techniques make the classification of AMF more accurate and scientific,
and can improve the taxonomy of AMF established on the basis of morphological identification. The
community research of AMF is mainly based on species classification, and has two kinds of investi鄄
gation methods, i. e. , spores morphological identification and molecular analysis. This paper re鄄
viewed the research progress in the systematic classification and community research techniques of
AMF, with the focus on the molecular techniques in community analysis of AMF. It was considered
that using morphological and molecular methods together would redound to the accurate investigation
of AMF community, and also, facilitate the improvement of AMF taxonomy.
Key words: arbuscular mycorrhizal fungi; taxonomy; spore; molecular technique; community.
*国家自然科学基金项目(30870438,40930533)、教育部新世纪人才
计划 项 目 ( NCET鄄07鄄0390 ) 和 高 等 学 校 博 士 点 基 金 项 目
(20070730013)资助.
**通讯作者. E鄄mail: fenghy@ lzu. edu. cn
2009鄄10鄄14 收稿,2010鄄03鄄15 接受.
摇 摇 丛枝菌根真菌 ( arbuscular mycorrhizal fungi,
AMF)能与绝大部分植物的根系形成互惠共生体,
是与植物关系最密切的微生物之一,它对植物群落
乃至整个生态系统的重要作用越来越受科学家的关
注[1] . AMF是专性营养共生的土壤微生物,目前还
不能进行纯培养,这使得 AMF的种类鉴定及系统分
类等工作存在很大的困难,从而进一步影响了 AMF
群落组成及多样性等研究.虽然如此,经过一百多年
的发展,AMF 的研究已经取得一定的进展,包括
AMF种类鉴定、分类系统的建立以及群落多样性的
研究等.近年来,分子技术已广泛应用于 AMF 的种
类鉴定以及群落研究,这使得目前的 AMF分类系统
有较大的调整和改变,群落研究技术也日新月异;因
此,系统地总结目前 AMF分类系统和群落研究技术
的进展有助于今后我们更好地开展 AMF 基础研究
工作.
应 用 生 态 学 报摇 2010 年 6 月摇 第 21 卷摇 第 6 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
Chinese Journal of Applied Ecology, Jun. 2010,21(6): 1573-1580
1摇 AMF分类系统
从 Tulasne兄弟 1844 年第一次基于土壤孢子形
态特征描述 Glomus 属至今,许多学者在 AMF 的分
类研究上做了大量的工作[1] .常规的 AMF分类鉴定
主要是依赖于土壤中 AMF无性孢子的形态特征.在
此基础上,1990 年 Morton 和 Benny[2]提出球囊霉目
(Glomales)的分类系统;他们把 AMF 列为接合菌纲
(Zygomycetes)中的 1 个目,下设 2 亚目 3 科 6 属.这
一分类系统总结了以往的研究结果,并在 20 世纪
90 年代盛行.然而,有部分 AMF 种类很难划分到上
述这一分类系统中;因此,Morton 和 Redecker[3]于
2001 年利用分子和形态双重证据对旧的分类系统
进行了部分修正,增加了原囊霉科(Archaeosporace鄄
ae)和类球囊霉科(Paraglomaceae).
进入 21 世纪后,基于分子生物学的技术应用于
AMF的分类研究,使得目前的 AMF 分类系统更具
可靠性和科学性,并导致 AMF的分类系统发生突破
性的改变. 2001 年,德国 Sch俟茁ler等[4]对 69 种 AMF
的 18S rDNA序列进行分析,发现 AMF与接合菌门、
子囊菌门和担子菌门中的真菌具有共同的起源,据
此他们把 AMF的分类地位提升至门,并命名为球囊
菌门 ( Glomeromycota ),下设 1 个纲 (球囊霉纲
Glomeromycetes),4 个目(球囊霉目 Glomerales、 类
球囊霉目 Paraglomerales、原囊霉目 Archaeosporales、
多孢囊霉目 Diversisporales), 7 个科 (球囊霉科
Glomeraceae、类球囊霉科 Paraglomeraceae、原囊霉科
Archaeosporaceae、地管囊霉科 Geosiphonaceae、无梗
囊霉科 Acaulosporaceae、多孢囊霉科 Diversisporace鄄
ae、巨孢囊霉科 Gigasporaceae). 2004 年Walker等[5]
从分子、形态和细胞学特征上发现 Glomus scintillans
(现名为 Pacispora scintillans)与巨孢囊霉科亲缘关
系更近,因此提出多孢囊霉目下出现一个新的科,名
为 Gerdemanniaceae,后被更名为 Pacisporaceae[6] .
2007 年 Walker 等[7]又在原囊霉目中增加 1 个科
Ambisporaceae. 2009 年,Sch俟茁ler[8]对 AMF 的分类
系统进行了总结,共有 4 个目 13 个科 19 个属 214
个种(表 1). 其中,球囊霉科(Glomeraceae)是种类
最多的 1 个科,下设 1 属,包括 105 种;而多孢囊霉
目(Diversisporales)包括 8 个科,其中 Racocetraceae
和 Dentiscutataceae这两个新科包括 5 个属共 20 多
种.许多新科、新属的出现,将大大冲击 AMF群落多
样性的研究.
2摇 AMF的种质资源
AMF在地球上至少存在了 4郾 6 亿年之久[9],伴
随了植物的整个进化历程.目前报道的 AMF种类数
量 200 余种,而高等植物近 30 万种之多. 如此少量
的 AMF 是如何与数量庞大的植物产生共生体呢?
重要的原因可能要归咎于 AMF 不具有严格的宿主
专一性[10],然而现在越来越多的研究证明 AMF 与
宿主之间具有选择偏好性[11-12],这在一定意义上说
明不同种植物根系的 AMF群落是具有差异的.假如
AMF的宿主专一性是一种普遍存在的现象,那么可
以推测还有许多难以培养和鉴定的 AMF 新种等待
我们去发现,或者是我们没有把在生理、功能上具有
显著差异的一些 AMF 种类区分开来[10] . Bever
等[11]以 1 hm2面积的农田撂荒地为样地,经过长达
5 年时间的调查研究,发现的 AMF 种类从第一年的
1 1种上升至第五年的37种,其中三分之一为从未
表 1摇 最新 AMF分类列表[8]
Tab. 1摇 Updated classification list of AMF[8]
目 Order 科 Family 属 Genus 种数 Species number
Glomerales Glomeraceae Glomus 105
Diversisporales Gigasporaceae Gigaspora 9
Scutellosporaceae Scutellospora 10
Racocetraceae Racocetra & Cetraspora 9 & 5
Dentiscutataceae Dentiscutata & Fuscutata & Quatunica 7 & 4 & 1
Acaulosporaceae Acaulospora & Kuklospora 34 & 2
Entrophosporaceae Entrophospora 2
Pacisporaceae Pacispora 7
Diversisporaceae Diversispora & Otospora 4 & 1
Paraglomerales Paraglomeraceae Paraglomus 3
Archaeosporales Geosiphonaceae Geosiphon 1
Ambisporaceae Ambispora 8
Archaeosporaceae Archaeospora & Intraspora 1 & 1
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描述过的新种.如此多的 AMF 新种未被揭示,表明
AMF的真正种类数量可能要比我们目前已知的多
得多;甚至有人提出在任何一个生态系统中,AMF
的种类数量可能与该系统中植物的种类数量相
当[13] .我们可以预见,随着 AMF 研究的深入,特别
是对不同生态系统、不同宿主的 AMF群落长期的研
究将会进一步探明 AMF种类数量这一问题,届时现
有的 AMF分类系统也将会面临全面的修正和挑战.
3摇 AMF的群落研究
针对 AMF的研究历史至少有 100 多年,但迄今
为止我们对这种广泛存在的真菌还未有比较详细的
了解,对它在自然生态系统中的分布情况更是所知
甚少[1] . AMF在不同生态系统、不同宿主和不同时
空阶段的群落组成到底是种什么样的情况,这个问
题一直是菌根学界所关心的命题,人们希望通过对
AMF群落的广泛研究去探究 AMF 在自然界中的真
实情况以及其对生态系统的重要作用. 目前,AMF
群落的研究方法多种多样,但主要包括孢子形态鉴
定、免疫化学法、脂肪酸法以及基于 DNA 分析的分
子生物学法[14] . 其中,孢子形态鉴定和分子生物学
法是两种常见的 AMF群落研究方法;这两类研究法
各具优缺点,但相对来说,目前分子生物学法更广泛
地应用于 AMF的群落研究.
3郾 1摇 传统形态学方法
AMF群落的研究,很长一段时间都是依赖于对
土壤中无性孢子的分离鉴定与孢子计数. 这种方法
主要包括以下几个步骤[15]:1)收集有代表性的土壤
样品(在野外,大部分的 AMF 孢子存在于表层土壤
中(0 ~ 30 cm),但也有部分种类的 AMF 孢子在深
层的土壤中存在,甚至在 50 ~ 70 cm 土壤中仍然具
有很高的 AMF多样性,并且是与表层土壤中完全不
同的 AMF种类[16]);2)利用湿筛法和蔗糖密度梯度
离心法分离土壤中的孢子;3)在体视镜下对分离得
到的孢子混合物进行归类整理,将外形相似的孢子
归为一类;4)对每一类孢子进行观察鉴定并计数
(孢子的鉴定可参考最新的一些分类标准和信息;
国际丛枝菌根真菌保藏中心 ( INVAM; http: / / in鄄
vam. caf. wvu. edu)和波兰的 Janusz Blaszkowski( ht鄄
tp: / / www. agro. ar. szczecin. pl / ~ jblaszkowski)在这
方面做了大量的工作,他们对 AMF不同种属的孢子
特征等作了详细的描述,对 AMF孢子分类鉴定具有
非常重要的参考价值).
对于野外采集的样品,由于孢子数量相对较少、
孢子的病变或感染、孢子的不同发育阶段等因素严
重影响了孢子的准确鉴定,因此,对 AMF 孢子进行
扩繁是非常必要的,这不仅可以增加孢子的数量,而
且可以得到便于鉴定的新生孢子.然而,扩繁策略也
并不能完全准确地反映野外样品中的 AMF 群落组
成,有时候在原初接种物中存在的 AMF种类在盆栽
扩繁后却没有再出现,也就是说有某种因素抑制了
这类 AMF 的萌发与繁殖,这些因素可能包括 AMF
的宿主特异性、季节性或者其他一些非生物因
素[11,17] .
无论是直接利用野外样品还是通过扩繁培养来
进行 AMF群落研究都非常耗时耗力,同时该方法对
研究者的 AMF 分类学知识要求很高;虽然说 AMF
分类学知识很容易理解和学习,但是却很难掌握,很
大程度上依赖鉴定者的个人经验. 此外,孢子作为
AMF的一种繁殖幸存体,土壤中孢子的群落与植物
根系中 AMF 定殖情况大多时候是不一致的;例如
Liu等[18]在对黄土高原人工柠条林的 AMF 群落进
行研究时发现,Scutellospora calospora 孢子在土壤中
丰度很高,但该种 AMF 却未在柠条根系中定殖. 因
此,基于孢子形态的传统方法不能够准确地反映
AMF群落组成的变化及其在植物根系中的定殖情
况,该方法具有一定的局限性[19-20] .
3郾 2摇 分子生物学方法
目前,许多新的技术在 AMF群落研究中得到大
量的应用,其中基于核酸分析的分子生物学技术被
认为是很有前途的一种分析方法[21-22] .这种方法直
接以样品中提取的核酸为模板,利用特异性引物对
特定基因区域进行扩增,通过结合其他的分子标记
技术或直接克隆测序进行 AMF群落结构分析,这在
很大程度上避免了基于孢子培养和形态鉴定以及其
他生化方法的局限性[19,22-23] .
3郾 2郾 1 AMF rDNA基因与特异性扩增引物摇 目前应
用于 AMF群落研究的分子技术主要是基于对 AMF
rDNA基因的序列分析,这种技术在 AMF 分子鉴定
及群落研究等方面均取得很大的成功[22-24] . rDNA
基因不仅含有高度保守区域,还含有变异区域; 高
度保守区域便于设计扩增引物,而通过对变异区域
的碱基突变分析可以在不同分类水平上对 AMF 进
行区分[22] .因此,在对 AMF 进行群落研究时,rDNA
基因是非常理想的目标基因. Simon 等[21]最早从事
这方面工作,他们通过设计特异性引物成功地从
Glomus intraradices 和 Gigaspora margarita 孢子样品
以及 Glomus vesiculiferum 侵染的韭菜根样中扩增出
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AMF 18S rDNA 部分基因片段. 迄今为止,针对于
AMF rDNA基因已经发展出许多对引物(图 1),主
要包括对 rDNA 编码区(5郾 8S rDNA,18S rDNA,28S
rDNA)和内转录间隔区( Internal transcribed space,
ITS)部分片段的特异性扩增[22] .
对于 AMF群落研究来说,我们所需要的是能够
特异性扩增所有 AMF种类,但不能扩增宿主植物和
其他真菌 DNA的引物对. 1998 年,Helgason 等[25]设
计了一个 AMF 特异性引物 AM1,并且利用 AM1 /
NS31 这一对引物进行了 AMF 群落分析;其中 NS31
是真核通用引物,而 AM1 是只能特异性扩增 AMF
18S rDNA 的引物(图 1). AM1 / NS31 是近十年来
AMF群落研究中使用最多的引物对之一,利用这对
引物同时结合其他的分子技术已对各种各样生态系
统中的 AMF 群落进行了广泛研究[18,20,23,25-28] . 然
而,随着研究的深入,特别是许多新的 AMF 种类的
发现以及 rDNA序列的测定,AM1 的局限性开始显
露.首先,AM1 并不能扩增所有科属的 AMF[26];其
次,AM1 能够扩增出部分非 AMF 真菌甚至植物基
因组的 rDNA序列[18] .为了增加引物对 AMF的涵盖
范围,Santos等[29]在 AM1 的基础上设计了一个混合
引物(AM1、AM2 和 AM3),能够扩增以往 AM1 匹配
较差的 Glomus group B 和 Diversisporaceae. 除了
AM1 / NS31 以外,针对于 rDNA 的不同区域(包 括
ITS、5郾 8S、18S、28S)以及其他功能基因区域已经设
计并应用了多对引物[22],许多新的引物也正不断地
被设计和应用. 2008 年,英国 York 大学的 Lee 等[30]
设计了一对应用于 AMF 群落研究的新引物:
AML1 / AML2(图 1); 这对引物具有更高的特异性,
能覆盖除 Archaeospora trappei 以外的所有已知
AMF. 最近,Kr俟ger等[31]也设计了4个能扩增所有
图 1摇 rDNA和引物定位示意图
Fig. 1摇 Details of rDNA genes and location of primers.
IGS: 基因内间区 Intergenic space;ITS: 基因内转录间隔区 Internal
transcribed space; NS31 / AM1、 AML1 / AML2、 SSUmAf / LSUmAr 和
SSUmCf / LSUmBr 为 引 物 NS31 / AM1, AML1 / AML2, SSUmAf /
LSUmAr and SSUmCf / LSUmBr are primers. 参考 Reddy等[22] ,Helgas鄄
on等[25] , Lee 等[30] 和 Kr俟ger 等[31] 绘制 Adapted from Reddy et
al. [22] , Helgason et al. [25] , Lee et al. [30] and Kr俟ger et al. [31]
AMF的混合引物(图 1);每一个混合引物分别由 2
~ 5 个单独的引物按等摩尔比混合而成,其中两个
正向混合引物(SSUmAf,SSUmCf)位于 18S 区域,两
个反向混合引物(LSUmAr,LSUmBr)位于 28S 区域,
因此,这几套引物涵盖了部分的 18S、28S 以及所有
的 ITS和 5郾 8S rDNA区域,具有更高的分辨率.
3郾 2郾 2 聚合酶链反应(PCR) 摇 PCR 技术使我们可
以通过对 AMF样品(孢子、土样、根样)中提取的核
酸进行有效的目的片断扩增,这种技术在对 AMF检
测、鉴定以及群落研究中具有很大的应用价值. 然
而,在实际应用中,特别是从根际土壤、根样中提取
的 DNA样品,经常含有一些抑制扩增的物质(例如
腐殖质、多酚类化合物)从而导致扩增效果不理
想[32] .针对这种情况,目前已经发展了许多策略来
减弱这种抑制效果,例如用交联聚乙烯比咯烷酮
(polyvinyl polypropylene,PVPP)对核酸样品进行纯
化,加入脱脂奶粉,对样品进行稀释以及采用 Nes鄄
ted鄄PCR策略等[33-34] .另外,值得注意的是,在 PCR
过程中,有些模板会被优先退火和扩增,也就是说不
同模板在同样的扩增体系中扩增效率会有所差异.
此外,不同 DNA聚合酶的扩增效率和错误掺入率也
是不尽相同的,具有高保真度的 Pfu DNA 聚合酶在
AMF研究中是使用最多的一种聚合酶,但是也有些
人认为 Taq DNA 聚合酶的错误掺入率不足以影响
最后的研究结果[35] .
近年来,一种新的 PCR 技术,实时荧光定量
PCR(quantitative real鄄time PCR,qRT鄄PCR)开始应用
于 AMF的研究. Alkan等[36]利用 qRT鄄PCR对 G. in鄄
traradices在植物根系中的定殖情况进行研究,发现
该技术是一种非常迅速、灵敏并可定量测定 AMF在
植物根系中定殖情况的方法.虽然 qRT鄄PCR 技术目
前未被用于 AMF的群落研究,但该技术目前已经成
功地应用于其他微生物群落结构研究[37-38];因此,
qRT鄄PCR技术今后很有可能成为 AMF 群落研究中
的一种有力工具.
3郾 2郾 3 PCR产物的分离技术摇 从根样或者土样中提
取的 AMF,其 DNA是多种 AMF种类的混合基因组,
当我们利用 PCR 对 DNA 样品进行扩增后,得到的
PCR产物是大小相近但序列各异的多种目的片断
的混合物;因此,需要对这些混合的 DNA 片断进行
分离.对 PCR产物的分离可以通过克隆筛选和电泳
等技术来实现.
PCR产物可以直接进行转化克隆,然后利用限
制性内切酶对阳性克隆进行筛选,对于典型的具有
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限制性片段长度多态性( restriction fragment length
polymorphism,RFLP)的类群进行测序,从而可以达
到对混合 PCR产物的分离分辨效果.目前利用这种
技术已经在 AMF 群落研究中得到了广泛的应
用[10,12,20,25-26,28,39] .然而,利用 RFLP 来分析 AMF 群
落结构的方法比较繁琐,需要对大量的克隆库进行
筛选(例如 Husband 等[39]筛选了 1300 多个克隆;
Vandenkoornhuyse等[12]筛选了 2001 个克隆). 近年
来,在 RFLP分析基础之上发展了一种新的分析方
法,叫做末端限制性片段长度多态性( terminal re鄄
striction fragment length polymorphisms,T鄄RFLP). T鄄
RFLP是一种高灵敏、重复性好的分子技术,最早由
Liu等[40]引入微生物群落研究领域,适合对大批量
的样品进行分析比较. T鄄RFLP 的主要技术流程
是[40-41]: 利用 5忆末端荧光标记的特异性引物对样
品 DNA 进行扩增,扩增产物纯化后进行限制性酶
切,酶切产物直接上测序仪进行测序,T鄄RF(标记的
酶切片断)片段大小以及信号差异可以利用电脑软
件显示出来,最后通过对 T鄄RF 片段大小及其相应
的峰值分析来反映样品中的群落结构.从创立至今,
T鄄RFLP技术在微生物生态学研究中一直受到很高
的评价[42-44],并已在 AMF 群落研究中得到大量的
应用[41,45],但是该技术也存在一定的技术缺陷,容
易产生虚假的结果[46] .此外,进行 T鄄RFLP分析需要
一套昂贵的测序仪及分析软件系统,许多研究者并
不具备这样的条件,这在一定程度上也限制了该方
法的广泛应用. 总的来说,RFLP 和 T鄄RFLP 都是基
于限制性酶切片段长度多态性的分析方法,在使用
时需注意限制性内切酶的选择,最好选择几套内切
酶和 DNA区段的组合来进行分析[43-44] .
在变性梯度、温度梯度或者依据不同 DNA序列
具有不同的单链分子构象从而具有不同的迁移率等
原理可以把大小相同但序列组成不同的 DNA 片段
在凝胶电泳中进行分离,这 3 种分离技术分别称为
变性梯度凝胶电泳( denaturing gradient gel electro鄄
phoresis,DGGE)、温度梯度凝胶电泳 ( temperature
gradient gel electrophoresis, TGGE)和单链构象多态
性( single strand conformation polymorphism,SSCP).
其中,DGGE 是目前应用于微生物群落研究最广泛
的一种技术,它是利用化学变性对大小相同但序列
不同的 DNA 片段进行分离. DGGE 技术于 1993 年
开始应用于环境微生物的群落研究[47],从 1997 年
开始广泛地应用于 AMF 群落研究[18,23,27,48-50] .
TGGE和 DGGE原理类似,只不过是利用 DNA 片段
的温度变性特征来达到分离目的. 理论上,DGGE /
TGGE图谱中的每一条带,都是具有唯一序列组成
的 DNA 条带,代表了一个种类;但是在实际的应用
过程中,单一条带也可能是几种相近 DNA序列的混
合物[23] . SSCP是与上述两种梯度凝胶电泳完全不
同的技术,它是利用 DNA单链的构象差异来分离大
小相同但序列不同的 DNA 片段. SSCP 能够灵敏地
对只有几个碱基差异的 DNA 片段进行分离,因此,
在 AMF 群落研究中经常被用作为测序前对大量
DNA序列样品的分离筛选以及对 AMF 群落的监
控[51-53] .
3郾 2郾 4 DNA序列测定与系统发育分析 摇 通过特定
的分子技术对混合的 PCR 产物进行分离后可以部
分地反映样品中的 AMF群落结构,但单纯利用分子
标记的遗传多样性来代表 AMF 群落多样性具有一
定的缺陷.其一,由于 AMF 具有种内 rDNA 异质性,
即对同一 AMF 菌种(株) rDNA 特定区段进行 PCR
扩增都可能产生多种 DNA 序列[54-55];其二,在 PCR
过程中,由于引物特异性及其他的原因可能会产生
一些非 AMF 的序列和嵌合序列 ( chimeric se鄄
quence) [18];其三,所有的分子技术均具有一定的缺
陷性;因此,通过各种分子技术分离出来的 PCR 产
物,应该进行 DNA 序列的测定和系统发育分析,只
有这样才能最大限度地反映 AMF群落的真实情况.
值得一提的是,目前有部分研究者在研究经费充足
的情况下,通过构建克隆文库并对所有克隆进行测
序[56],或者直接利用 PCR产物进行 454 测序[57],从
而不通过分子标记方法来进行 PCR产物筛选,这种
策略可以更准确地反映样品中 AMF 群落结构的真
实情况. AMF 的系统发育分析可参考德国 Sch俟茁ler
研究组构建的模式系统发育树[8],选用一些不同科
属的 AMF代表菌种的 DNA 序列作为参考序列,可
以很好地将我们新获取的 DNA 序列进行系统发育
分析,从而便于划分 AMF分子种(例如文献[58]).
4摇 结摇 摇 语
AMF分类系统的建立对群落研究具有非常重
要的作用,在揭示群落结构方面具有不可替代的功
能.目前 AMF 的系统分类工作已经取得很大的进
展,但随着研究的深入,特别是对不同生态系统、不
同宿主、不同时空阶段等的 AMF 群落研究,将反过
来促进 AMF 分类系统的补充和完善. AMF 作为自
然生态系统的重要组成部分,它在生态系统中的作
用毋容置疑,而对 AMF群落的全面研究将有助于我
77516 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 刘永俊等: 丛枝菌根真菌系统分类及群落研究技术进展摇 摇 摇 摇 摇
们了解这种特殊的共生微生物,进一步阐明其生态
功能.在 AMF 群落研究中,基于土壤孢子的传统形
态学方法不能够准确地反映群落组成的变化及其在
植物根系中的侵染情况,但是这种方法可以使我们
获得 AMF菌株,从而为菌根技术的应用提供优质的
种质资源.分子技术在一定程度上能够较快速且准
确地反映 AMF 的群落结构,但该方法过分地依赖
PCR技术和 DNA序列分析,特异性引物以及分子标
记方法的局限性都很容易使 AMF 群落研究得出许
多片面的结论;另外,单纯地利用分子技术进行
AMF群落研究并不能获得 AMF 菌株(只能得到分
子种),不利于发现 AMF 新种以及进一步的应用研
究.目前大部分的 AMF群落研究都是采用成本较高
的分子技术,而往往忽视对土壤孢子的分离鉴定,最
终结果将是大量的 DNA序列堆积,但分离鉴定的菌
株却寥寥无几.这种现象不利于我们探明和合理利
用 AMF的种质资源,对 AMF 分类系统的完善也作
用甚微,毕竟 AMF的系统分类工作需要孢子形态鉴
定和分子鉴定双重证据. 因此,从长远角度来看,采
取形态与分子相结合的办法进行 AMF 群落研究不
仅有助于完善 AMF 分类系统,而且能够增强 AMF
研究的可持续性.
参考文献
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作者简介摇 刘永俊,男,1979 年生,博士研究生,讲师. 主要
从事菌根生物学、微生物生态学研究. E鄄mail: liuyj863 @
gmail. com
责任编辑摇 肖摇 红
0851 应摇 用摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 21 卷