全 文 ：第 30卷 第 1期
2011 年　2 月
华　中　农　业　大　学　学　报
Journal of H uazhong Ag ricultural Univ ersity
Vo l.30　No.1
Feb.2011 , 18 ～ 22
收稿日期:2010-03-25
基金项目:国家“ 973”计划“生物固氮作用的分子机理研究”(2010CB126500)
赵彩春 ,硕士研究生.研究方向:根瘤菌共生固氮体系分子机理.E-mail:zhaocaichun@163.com
通讯作者:李友国 ,博士 ,教授 ,博士生导师.研究方向:生物固氮 、农业环境微生物.E-mail:youguoli@mail.hzau.edu.cn
紫云英 2个转脂蛋白基因在共生
及重金属镉胁迫条件下的表达特征
赵彩春　李一星　陈大松　李友国
华中农业大学农业微生物学国家重点实验室 ,武汉 430070
摘要　采用实时荧光定量 PCR 技术 , 研究了紫云英共生表达的非特异性转脂蛋白编码基因 AsE246 和
AsIB259 在根瘤发育和固氮过程中的组织和时空表达特征 ,并初步考察了其在重金属镉胁迫条件下表达水平的
变化 。结果表明:2 个目标基因仅在紫云英根瘤中特异表达 , 并且均在接种华癸中慢生根瘤菌 7653R后 22 d 左
右表达量达到最高。在低浓度重金属镉胁迫条件下 , AsE246 和 AsIB259 在处理早期的表达量明显升高。在低
或高镉胁迫条件下 ,在处理中期其表达量均显著低于正常根瘤 ,在处理后期则维持在较低水平 , 表明它们参与紫
云英应对镉胁迫的应答机制。
关键词　紫云英;转脂蛋白基因;共生体;表达特性;实时荧光定量 PCR
中图分类号　S 154.38+1 　　文献标识码　A　　文章编号　1000-2421(2011)01-0018-05
　　LTP(lipid t ransfer protein)是广泛存在于植
物 、动物和微生物中的一类脂质转移蛋白 ,其共同特
征是含有 8个位点高度保守的半胱氨酸残基 。根据
蛋白特性 、相对分子质量和等电点等一些特征 ,可分
为 LTP1和 LTP2 2个家族[ 1-2] ,大多数植物的 LTP
属于 LTP1家族 。大量研究表明:LTP1在植物的
生长发育过程中可能具有多种功能 ,包括参与脂类
的转运[ 3] 、参与植物角质层和蜡质层的合成[ 4] 、增加
细胞壁的延展性[ 5] 、参与植物对病原菌的防御反
应[ 1] 、与植物抵抗非生物胁迫[ 6] 及花粉成熟[ 7] 有关
等。LTP s基因属于一个小的多基因家族 ,不同的
LT Ps基因编码相似的蛋白质 ,同一家族不同的成
员具有不同的表达模式 ,同时每个基因的表达模式
受植物的生长发育阶段 、解剖结构 、生物或非生物胁
迫的影响。水胁迫 、重金属处理 、寒冷 、干旱或病原
物侵染和盐胁迫等都会诱导 LTPs基因的表达 ,而
且个体的表达水平与植株的生长阶段 、组织类型及
作用因素有着密切关系[ 8] 。
前期研究中 ,通过抑制差减杂交技术 ,分离获得
了紫云英根瘤特异或增强表达的 13个新基因及其
全长 cDNA;序列分析表明 ,其中 2 个基因 AsE246
和 AsIB259 编码非特异性脂质转运蛋白 nsLTP1 ,
与多种植物的 LTP1 氨基酸序列具有较高的同源
性[ 9] 。吴梅等[ 10] 还发现在紫云英与华癸中慢生根
瘤菌共生体系中增强表达的结瘤素基因对共生固氮
具有重要作用 。因此 ,在根瘤中特异或增强表达的
LT P基因 ,很大可能也在豆科根瘤的共生固氮中具
有重要作用 ,然而目前人们对其具体功能及作用机
制的认识还远远不够 。本试验研究紫云英共生表达
的非特异性转脂蛋白编码基因 AsE 246和 AsIB259
在根瘤发育和固氮过程中的组织和时空表达特性 ,
探讨根瘤特异的转脂质蛋白基因是否参与非生物因
素重金属的胁迫应答 ,旨在为深入研究其在共生固
氮和胁迫应答中的功能及机制提供基础和依据。
1　材料与方法
1.1　共生体形成有关的菌株
华癸中慢生根瘤菌(Mesorhizobium huakui i
7653R)和摩西球囊霉(Glomus mosseae)均来自华中
农业大学农业微生物学国家重点实验室共生固氮课
题组保存的纯化菌株 。
1.2　根瘤等器官组织材料收集
按照文献[ 11]处理紫云英种子 ,采用双层盆钵
DOI :10.13300/j.cnki.hnlkxb.2011.01.016
　第 1 期 赵彩春 等:紫云英 2 个转脂蛋白基因在共生及重金属镉胁迫条件下的表达特征 　
法种植紫云英 ,并浇灌 Fahraeus 无氮营养液 ,紫云
英植株长出第 1片真叶时向试验组接种华癸中慢生
根瘤菌 7653R ,对照组不接菌 ,每组每个取材点不低
于 3个重复。在接种根瘤菌后根瘤发育不同时期收
取紫云英根瘤 、去瘤根 、茎和叶等器官组织材料。
1.3　菌根组织材料收集
在盆栽钵的下层装入灭菌砂土混合物(等质量
砂土混合)至 70%的高度 ,平铺 1层 AM 真菌接种
剂 ,再覆盖灭菌土 ,种入发芽的紫云英 ,每盆栽 4株 ,
分 2个组:对照组和处理组 ,对照组加全磷营养液 ,
试验组加无磷营养液 。每处理各 3个重复。恒温室
培养 ,温度 20 ～ 28 ℃,每天 12 h 光照 ,并浇适量蒸
馏水 。第 7周收取紫云英根段 ,通过染色确定其菌
根真菌的侵染。
1.4　重金属镉胁迫试验
紫云英植株接种华癸中慢生根瘤菌 4 d后 ,浇
灌含不同浓度镉离子的无氮营养液 , 2个处理组分
别为 9 、45 μmol/L ,不含镉离子为对照组 ,每组不低
于 3个重复。按接种根瘤菌后根瘤发育不同时期收
取紫云英根瘤 、去瘤根 、茎和叶等器官组织材料。
1.5　总 RNA抽提和 cDNA合成
按照 Invit rog en 公司试剂盒说明书用 T rizol法
抽提各材料总 RNA ,并用 Dnase Ⅰ消化处理 RNA ,
排除基因组 DNA 干扰后 ,紫外分光光度计检测浓
度及纯度。整个操作过程中所用试剂为 RNase
f ree ,所用耗材均用 0.1%的 DEPC 水处理烘干后使
用。取3 μL 总 RNA ,按照反转录试剂盒(Fementas
公司)提供的操作程序反转录合成第 1链 cDNA ,并
且 PCR扩增保守基因泛素序列上游引物 5′ATG
CAG ATC T T T TG T GAA GAC 3 下游引物:5′
ACC ACC ACG GAA GAC GGA G 3′以验证 cD-
NA 合成是否成功。
1.6　目标基因的组织和时空表达检测
按照在 NCBI 数据库中登记的紫云英 AsE246
(DQ199648)基因序列设计上游引物 5′CCCAAG-
CAAAGAA TAAATAG3′和下 游引 物 5′CAC-
CACTTCACGGCAACT3′;按照紫云英 AsIB259
(DQ199649)基因序列设计上游引物 5′TCTT TCT-
GCTGCTG TTGC3′和下游引物 3′CGGAGCAG-
TAGAG TGAGC5′。以 18S rRNA 为内参基因
(AF3595597)设计上下游引物:5′GTA TGG TCG-
CAAGGCTGAAAC3′及 5′TTAGCAGGCTGAG-
G TCTCGT3′。基于上述各组总 RNA样品 ,以反转
录合成的第 1链 cDNA 为模板 ,采用 SYBER Green
荧光染料实时定量 PCR方法检测该基因在紫云英
的器官组织表达和根瘤发育固氮过程中的时空表达
动态 。同时 ,采用相同方法初步检测 2个基因在菌
根共生体中的表达特征。
1.7　镉胁迫条件下的目标基因表达检测
以 SYBER Green 荧光染料实时定量 PCR 方
法 ,检测目标基因在 9 、45 μmo l/L 镉浓度胁迫条件
下 ,在紫云英共生根瘤中的表达变化。操作方法和
引物同本文“1.5”和“1.6” 。
2　结果与分析
2.1　盆栽试验 、总 RNA抽提及其质量控制结果
紫云英与华癸中慢生根瘤菌 7653R互作形成
固氮根瘤 ,接种根瘤菌的紫云英植株生长良好 ,未接
种的紫云英植株矮小发黄 。同时 ,紫云英可与丛枝
菌根真菌互作形成菌根共生体 ,接种菌根真菌的紫
云英植株长势良好 , 根段 TB 染色显示侵染成功
(图 1)。
　A:形成正常固氮根瘤 Formation of normal ni t rogen-fixin g nodules;B:对照组 ,不形成结瘤 Negative cont rol , n on nodules form ed;
C:菌根感染 TB染色鉴定 Iden tif icat ion of mycorrhi zal infection w ith T B staining.
图 1　紫云英与华癸中慢生根瘤菌 7653R以及菌根真菌互作的植物盆栽及根段 TB染色试验
Fig.1　The pot plant experiments for Astragalus sinicus interating withMesorhizobium
huakuii 7653R and Glomus mosseae respectively
19
　　 华 中 农 业 大 学 学 报 第 30 卷　
　　按照常规的 T rizol抽提方法 ,制备预先收集保
存的不同组织材料的总 RNA ,经 Dnase Ⅰ , 37 ℃、
5 min消化处理基因组 DNA 后 ,用紫外分光光度计
检测浓度和纯度 , D260 nm/D280 nm ≈1.9 ,表明其纯度
高 ,满足后续 RT-PCR的质量要求。进一步反转录
合成 cDNA 模板 ,PCR扩增组成型表达的泛素参照
基因 ,条带清晰 ,说明反转录成功。这些操作和检测
充分保障了制备 RNA 和反转录 cDNA 的质量和可
靠性 。
2.2　目标基因在器官组织中的表达特征
以紫云英根瘤 、去瘤根 、茎和叶组织的总 RNA
为模板 ,利用设计的特异性引物 ,通过 RT-PCR ,分
别扩增 AsE246和 AsIB259目标基因。电泳检测结
果显示:2个基因仅在根瘤中表达 ,获得了预期大小
的特异性条带 。 AsE246 的扩增片段为 121 bp ,
AsIB259的扩增片段为 141 bp 。进一步采用实时
定量 PCR ,检测分析目标基因在紫云英根瘤等组织
器官中的表达水平(图 2),结果表明 2 个基因属于
根瘤特异性表达的共生固氮基因 ,在根 、茎和叶中均
不表达。
N:根瘤 Nodule;R:根 Root;S:茎 S tem;L:叶 Leaves;
　误差线为标准差 ,英文字母表示用Duncan s多重比较法做统计
学分析后 ,在 P=0.05水平上的差异显著性 , 下同。 T he bars re-
p resent standard deviation , the let ters sh ow the signif icance dif fer-
ence at the level of P=0.05 wi th the Duncan s mul tiple compari-
s on method , the same as below.
图 2　目标基因 AsE246 及 AsIB259
组织表达的定量 PCR检测分析
Fig.2　The tissue-expression pattern analyses for target
genes AsE246 and AsIB259 by using quantitative PCR
2.3　目标基因在根瘤发育和固氮过程中的表达动态
首先依据 RNA浓度将紫云英不同时期根瘤及
各器官 cDNA 调节到一致浓度 ,然后取部分 cDNA
稀释为 5个浓度梯度 ,以 18S rRNA为内参基因 ,制
作荧光定量相对标准曲线 ,以优化实时定量 PCR反
应条件。根据获得的最适条件分别进行 2个目标基
因在各样品中表达水平的荧光定量分析。结果显
示:接种华癸中慢生根瘤菌 7653R 后 , AsE246 在
22 d左右表达量相对最高 ,表达量较其他时期高出
近 20倍 ,早期到中期呈现上升趋势 ,中期至晚期呈
下降趋势(图 3)。 AsIB259 的表达总体趋势与
AsE 246相似 ,亦呈现中期表达量相对较高的趋势 ,
但整体表达量差异不及 AsE246 明显 ,大部分表达
量差异小于 2倍(图 4)。
图 3　AsE246在根瘤发育固氮过程中的动态表达
Fig.3　The dynamic expression pattern of AsE246 during
nodule development and nitrogen fixation process
图 4　AsIB259 在根瘤发育固氮过程中
的动态表达(相对表达量)
Fig.4　The dynamic expression pattern of AsIB259
in nodule development and nitrogen fixation process
2.4　目标基因在菌根共生体的表达检测
由于紫云英还可与菌根真菌共生形成菌根共生
体 ,考虑到根瘤和菌根 2种共生体形成过程中可能
存在宿主参与 、共生诱导表达的相同基因 ,检测了目
标基因在菌根中的表达状况 。首先使用试验组菌
根 、茎叶及对照组根 cDNA 为模板 , PCR扩增泛素
以验证反转录 cDNA 模板的可靠性;同时将根瘤
cDNA 作为阳性对照 ,以排除 PCR 条件的影响;再
分别使用 AsE246和 AsIB259特异引物进行 RT-
PCR , PCR产物结果显示 ,在紫云英与丛枝菌根真
菌互作形成的菌根共生体中没有检测到这 2个基因
的表达 ,进一步说明目标基因是共生根瘤中特异表
达的功能基因 ,与共生固氮作用关系密切。
2.5　目标基因应对重金属镉胁迫条件下的表达变化
　　以 2种不同浓度镉处理下不同时期的根瘤总
RNA 为模板 ,分别进行 AsE246 、AsIB 259 的荧光
定量检测分析 ,结果(图 5)显示:接种根瘤菌后第 9
20
　第 1 期 赵彩春 等:紫云英 2 个转脂蛋白基因在共生及重金属镉胁迫条件下的表达特征 　
天 ,即镉胁迫后第 5 天 , AsE246在 9 μmol/ L 低浓
度镉处理时表达量较对照组明显升高 , 在 45
μmol/L高浓度镉处理时表达量与对照组接近 。在
接种根瘤菌后第 24天 ,即镉胁迫后第 20天 ,不管低
浓度还是高浓度镉胁迫下 ,其表达量与对照比较均
显著下降;在接种根瘤菌后第 33天 ,即胁迫后第 29
天 ,低浓度镉处理下 AsE246的表达仍然处于相对
较高的水平 ,而在高浓度镉处理时 ,其表达量下降至
与对照组接近。对照组中 AsE246的时空表达特征
与图3结果完全吻合。但在高浓度镉胁迫时 ,该基因
的表达量在整个根瘤发育和固氮过程都很低(图 5)。
图 5　AsE246在镉胁迫条件下
不同时期根瘤中表达的定量分析
Fig.5　Quantitative analysis of AsE246 expression in
nodules of different terms under cadmium stress conditions
　　总体上 ,在镉胁迫条件下 AsIB259 在不同时期
根瘤中的表达特征与 AsE 246 相似。由图 6可见 ,
没有添加镉胁迫的对照组中 , AsIB259 表达趋势与
图 4结果吻合;接种根瘤菌后第 9天 , AsIB259在低
浓度镉处理组中的表达量明显升高 ,高浓度镉处理
组中的表达量也有所上升;接种根瘤菌后第 24天 ,
AsIB259在镉处理组中的表达量均显著低于正常对
照组;但是在接种根瘤菌后第 33天 ,低浓度镉处理
组中的 AsIB 259表达仍然处于相对较高水平 ,高浓
度镉处理时 ,其表达量下降 ,且低于无胁迫对照水平
(图 6)。
图 6　AsIB259 在镉胁迫条件下不同
时期根瘤中表达的定量分析
Fig.6　Quantitative analysis of AsIB259 expression in
nodules of different terms under cadmium stress conditions
3　讨　论
AsE 246和 AsIB259的组织空间表达的定量检
测结果显示:它们只在根瘤中特异 、高效表达 ,而在
紫云英茎叶等组织和去瘤根中不表达 ,在菌根共生
体中亦不表达 ,直接说明了其基因表达具有严格的
组织器官特异性 ,从一个侧面说明了这 2个基因与
根瘤发育和固氮功能有关;AsE246 和 AsIB 259 在
根瘤中的时空动态表达特征基本相似 ,均在接种根
瘤菌后第 22天左右表达量达到最高 ,此时正是紫云
英成熟根瘤固氮的旺盛时期。但这 2个基因在接菌
第 40天之后表达水平明显下降 ,而此阶段的根瘤开
始进入衰老 ,固氮能力开始减弱 。再次说明这 2 个
转脂蛋白基因与紫云英根瘤的共生固氮密切相关 。
值得注意的是 , AsIB 259在早期(第 9 天)具有一个
相对较高的表达水平 ,我们推测该基因可能还与根
瘤菌早期感染和根瘤形成有关 。
近年来 ,许多研究报道 L TP 参与植物应对环
境胁迫 ,具有防御功能 。陈大松等[ 6] 研究了紫云英
共生固氮基因在铵胁迫及盐胁迫下的表达 ,结果表
明 AsE246在 NaCl胁迫下 ,其转录量上升 ,高于无
胁迫正对照的水平。本研究中的镉胁迫试验结果显
示 ,在低浓度镉胁迫条件下 ,在处理早期目标基因的
表达量明显升高。然而在高 、低浓度镉处理组中期
目标基因的表达水平显著低于正常根瘤 ,并一直维
持在较低水平 。我们推测在这种情况下 ,紫云英根
瘤的固氮作用将受到抑制和显著影响[ 12] ,事实上在
后期对共生固氮表型的观察中确实可见 ,在高浓度
镉处理组中的紫云英地上部分长势明显区别于正常
对照组。在低浓度镉胁迫时 ,紫云英植株感应到环
境刺激 ,启动胁迫应答 , AsE246 表达量明显升高 。
然而 ,高浓度的镉胁迫处理时 ,目标基因在整个根瘤
发育和固氮过程中被强烈抑制 ,表达水平一直很低 。
基于这些结果 ,我们认为重金属镉对于根瘤共生固
氮的抑制作用 ,可能是抑制了该过程中重要功能基
因的表达水平 ,如 nsLTP1编码的基因 ,进而影响根
瘤的固氮能力 。
本研究结果表明 AsE246和 AsIB259是紫云英
与华癸中慢生根瘤菌 7653R共生特异表达的功能
基因 ,参与紫云英根瘤发育和固氮 ,而且还与应答镉
胁迫环境因素有关。但是要揭示和阐明此类 LTP
的具体功能和调控机制 、如何启动应对不利环境因
素的防御应答 ,还需要后续深入全面的分子 、蛋白水
平和生理生化等层面的研究。
21
　　 华 中 农 业 大 学 学 报 第 30 卷　
参 考 文 献
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Astragalus sinicus under symbiosis and heavy metal cadmium stress conditions
ZHAO Cai-chun　LI Yi-xing　CHEN Da-song　LI You-guo
S tate Key Laboratory of A gricul tural Microbiology , Huazhong
Agricultural Univ ersity ,Wuhan 430070 , China
Abstract　AsE246 and AsIB259 w ere tw o ro ot nodule-specific expressed nodulin genes encoding
nsLTP1 (non-specific lipid t ransfer pro tein 1).The temporal-spat ial expression cha racteristics of tw o
ta rg et genes during roo t nodule development and ni t ro gen f ix ation process w ere invest igated wi th real-
time quant itat ive PCR.Meanwhile , the dynamic changes of expression level o f target g enes under heavy
metal cadmium stress condit ion were also exam ined.The results show ed that tw o targe t genes w ere
st rictly expressed in symbiotic o rg an-roo t nodules , and reached the peak level at about 22 day s af ter ino c-
ulation of Mesorhizobium huakui i 7653R.It w as also found that the expression levels of AsE246 and
AsIB259 we re significant ly increased during the early stage as a re sponse to low-level-cadmium stress.
However , ei ther at low- o r high-level-cadmium stress condi tions , thei r expression we re significant ly sup-
pressed during the interim stage of Cd2+ st re ss treatment comparied w ith tho se in normal nodules , and
cont inued to maintain a relative low er level unti l the final stage.These indicated the tw o nsL TP1 genes
could play a fundamental ro le in the response mechanism of A.sinicus to cadmium stress.In this w ork ,
some convincing data w ere obtained to confi rm that AsE246 and AsIB 259 w ere specific expressed
nsL TP1 genes in A.sinicus roo t nodules.
Key words　Astragalus sinicus;lipid t ransfer pro tein encoding gene;symbiont;expression pat te rn;
real-time qPCR
(责任编辑:张志钰)
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