全 文 ：中国农业科学 l卯5 , 28 ( 4 ): 14一 19
压妇 ,血 A创巨 lut 口 S沁如
外源共生基因对紫云英根瘤菌
共生效率的影响 *
张学贤 周俊初 李阜棣 陈华癸
(华中农业大学生物固氮研究室 , 武汉 4 3X() 70)
提要 将豌豆根瘤菌共生质粒 p J B S J 、 含紫云英根瘤菌共生墓因的重组质粒 p aR 1Z 5
及含首猎根瘤菌共生基因的重组质粒 p Rm又 2 6导入紫云英根瘤菌野生型菌株7 6 5 3R , 然
后对 3种转移接合子的共生固氮效率进行了比较全面的测定 . 结果表明 :转移接合子 7 6 5 3 R
(P J B S)IJ 的共生固氮能力较出发菌株7 6 5 3 日大幅度提高 , 而且表现出较高的竞争结瘤能力 ,
转移接合子7 6 5 3日(P Rm生 2 6 )在固氮酶活性 、 植物干重及结瘤数方 面亦显著高于对照菌
株7 6 5 3氏 转移接合子 7 6 5 3R (P日a Z , 5) 虽然在固氮酶活性及植物干重方面没有发现 显
著性差异 , 但结瘤数显著减少 。
关键词 紫云英根瘤菌 ; 共生基因 ; 共生效应 ; 接合转移
紫云英 (A st r叩 of us s认哪 L . ) 是我国南方广泛种植的一种稻田绿肥植物 。 能在紫云英上结瘤并进行共生固氮作用的紫云英根瘤菌是我国的一种重要 的共生 固氮资源 , 紫
云英根瘤菌在互接种族中独属一族 1] . 19 1年陈文新等 冈 采用数值分类和 D N A 杂交等
分子生物学鉴定方法 , 将其定名为 R h iz ob iu m 加 ak 而 C 二 多年来 , 我国学者在紫云英
根瘤菌的应用方面已进行了许多卓有成效的研究阁 , 但育种方法一直局限在 自然 选育及
诱变育种 。 1982 年块如飞 等叫 率先把根瘤菌共生质粒的转移应用于育种研究中 。 他们
通 过 导人外源共生质粒使受体根瘤菌的结瘤固氮能力大幅度提高 。 1983 年 B er iw n 等 网
研究证明导人外源共生质粒还可以提高根瘤菌的竞争结瘤能力 , 因此本研究将 3种不同
来源的外源共生质粒 (基因 )导人到紫云英根瘤菌野生 型菌株 7653 R中 ,以考察外源共生基
因对受体菌共生效率的影响 , 并探讨构建具有生产应用前景的优 良菌株的可能性 。
1 材料与方法
1
.
1 细菌菌株与培养条件
细菌菌株与质粒见表 1. 根瘤菌培养基 : 液体培养采用 T丫刁 , 固体培养采用 SM 闭 , 质
粒检测时采用 P IA 刀 , 大肠杆菌培养基采用 L B[ 叼 。 培养温度 : 根瘤菌 28 ℃ , 大肠杆菌
3充 。 抗生素使用浓度 : 四环素 (cT ) 15拜g/ d , 链霉素 ( S tr ) 3的尸g/ 耐 ,卡那霉素 (K m )父户g/ 成 。
,
.
2 植物结瘤试验
采用本室改进的双层钵进行 。 上层是塑料杯 , 内装粗砂 , 下层为装有 F a hr ae us 无氮
收稿日期 l卯 3一 12一 15
. 国家 “ 863’ 高技术研究发展计划 、 国际科学基金 (正 S )及 国家 自然科学基金资助项 目 .
4 期 张学贤等 : 外源共生基因对紫云英根瘤菌共生效率的影响 巧
植物营养液 1[ l] 的玻璃瓶 , 塑料杯插在玻璃瓶中 , 通过纱布条将营养液吸人沙土中 。 每瓶
种 4株紫云英 , 种 子表面消毒及催芽按常规方法进行 。 人工光照培养 , 每 天光照 14 小
时 , 光强为 4 5( X) 一 日叉刀 玩 , 温度巧 一 24 ℃ .
1
.
3 根瘤菌固氮酶活性测定
剪取待测植株的根系 , 去掉无瘤的部分后 , 置于 20I n l J/ 、 瓶 中 , 加盖橡皮塞 , 马 上抽气
为n l , 注人乙炔 五址 , 28 ℃反应 1一 2小时 , 用 日立 163 型气相色谱仪测定乙炔还原值 。
1
.
4 植株地上部分含氮且的测定
采用半微量凯氏定氮法 .
1
.
5 根瘤菌质粒的快速检测
采用修改的 cE k h a r dt 方法叹
2 结果
2 , 共生质粒 (基因 )的转移
p BJ 纽 具有 自我转移的能力 , 可 以用供 、 受体菌的二亲本杂交进行质粒转移 , 但 p BJ S IJ
表 1 细菌菌株与质粒
aT ble I aB 日比ir al s tar i斑 a n d pals m比
菌株与质粒
S t扭i飞 /P la` r n lds
有 关性状 ’ ) 来源及文献
R e le v a n t d坦几以。七t l cs oS l u ℃e o r er fe 庄泊巴
紫云英根瘤菌
( R h i: o b派。 m hu ak u i i )
76 53 R
7 653 R (P BJ S )IJ
76 53 R (P R a Z 15)
76 53 R (P R刀巧 L 26)
76 53 R (P L A F
,
R l )
7 65 3 R (P RK 4( ” )
7 65 3 R A Z
w ild ty pe N Od
+
F 议 + S t广
S t护 K m {
S t扩 T 己
S t r
r
T己
S t广 T己
S t广 T d
76 53 R 印BJ SJ I) 在紫 云英上所结根瘤 的分离物
助 lat e fro m a 以对 ul e fo l l 〕1 幻 b y 7 6 53 R (P BJ SJI )
。 n 几女r卯阎必 女川邸
[2」
本研究 (丁场s st 吟 )
本研究 (T 肠 s st 喻 )
本研究 (T h i s tS l功 )
本研究 ( T ihs st 喃产)
本研究 ( T litS st l劝 )
本研究 ( T l l is st 喃 )
豌豆根瘤菌
( R
.
1. 尹a ” 诬
~
b i帅 r “ ~
T o K 3
质杜 伊 la` n ” ds )
PBJ SJI
S t 护 K m r
PR压2 15
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豌豆根瘤菌共生质粒 K m ) S冲l b iot ic 口既面 d of
只月2况心州 l均界州 i
~
ib o var 厉~含萦云英根疙菌共 生基因 t 组质粗
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习 d二的11月 , I 阳扣幻在i
含首稽根瘤菌共生墓因 R即田山 ian t PI ~ d
co n面 in飞 s娜 b io t ic 罗 1长` o f 月伪泛勿占葱姗 柑 l i lo t i
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【3
【3
Km
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T r a l巧化r .
st 扩: 链霉素抗性 st le p ot m yd n
M o bi li az t io n ; T 以 卜 : 转移功能 `
4 期 张学贤等 : 外源共生基因对紫云英根瘤菌共生效率的影响 巧
植物营养液 l [1 ]的玻璃瓶 , 塑料杯插在玻璃瓶中 , 通过纱布条将营养液吸人沙土中 。 每瓶
种 4株紫云英 , 种 子表面消毒及催芽按常规方法进行 。 人工光照培养 , 每 天光照 14 小
时 , 光强为 4 5( X) 一 日叉刀 玩 , 温度巧 一 24 ℃ .
1
.
3 根瘤菌固氮酶活性测定
剪取待测植株的根系 , 去掉无瘤的部分后 , 置于 20I n l J/ 、 瓶 中 , 加盖橡皮塞 , 马 上抽气
为n l , 注人乙炔 五址 , 28 ℃反应 1一 2小时 , 用 日立 163 型气相色谱仪测定乙炔还原值 。
1
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4 植株地上部分含氮且的测定
采用半微量凯氏定氮法 .
1
.
5 根瘤菌质粒的快速检测
采用修改的 cE k h a r dt 方法叹
2 结果
2 , 共生质粒 (基因 )的转移
p BJ 纽 具有 自我转移的能力 , 可 以用供 、 受体菌的二亲本杂交进行质粒转移 , 但 p BJ S IJ
表 1 细菌菌株与质粒
aT ble I aB 日比ir al s tar i斑 a n d pals m比
菌株与质粒
S t扭i飞 /P la` r n lds
有 关性状 ’ ) 来源及文献
R e le v a n t d坦几以。七t l cs oS l u ℃e o r er fe 庄泊巴
紫云英根瘤菌
( R h i: o b派。 m hu ak u i i )
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7 653 R (P BJ S )IJ
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76 53 R 印BJ SJ I) 在紫 云英上所结根瘤 的分离物
助 lat e fro m a 以对 ul e fo l l 〕1 幻 b y 7 6 53 R (P BJ SJI )
。 n 几女r卯阎必 女川邸
[2」
本研究 (丁场s st 吟 )
本研究 (T 肠 s st 喻 )
本研究 (T h i s tS l功 )
本研究 ( T ihs st 喃产)
本研究 ( T litS st l劝 )
本研究 ( T l l is st 喃 )
豌豆根瘤菌
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.
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含首稽根瘤菌共生墓因 R即田山 ian t PI ~ d
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M o bi li az t io n ; T 以 卜 : 转移功能 `
4 期 张学贤等 : 外源共生基因对紫云英根瘤菌共生效率的影响
转移接合子 76 5R 3(P JB J SI )在人工培养条件下 , PJ B l5 能稳定存在 , 而 经过紫云英共
生之后 , p BJ SIJ 表现出不稳定的遗传特性 。 该结果 已另文论述`4 ]。
2 4 转移接合子 7反好R印J B5 lj x ) 共生效应的测定
2 4 1 共生固氮能力的测定 转移接合子 765 3R ( p BJ 5l )在 紫云 英 上 形成有效根瘤 ,
共生固氮能力的测定表明 : 76 53 R 口BJ 5l )所结根瘤的 固氮酶活性较原菌株 7653 R 增加
94 %
, 而且在 : 二 .0 01 水平达到极显著 。 接种 765 3R 印BJ 组 ) 的植株地上部分干重亦较 7 653 R
增加 12 % (见表 2) 。
从 转移接合子 7653 R 印BJ l5 ) 在紫 云英上所结的根瘤中分离根瘤菌 。 选择含 p」B SIJ
的根瘤分离物 7653 R 2A 作重复验证实验 。 结果表明 : 7653 R 2A 所结根瘤的 固氮酶活性
较 765 3R 增加 76 名% , 而且在 : = .0 01 水平达到极显著 。 接种 7653 R人 的植株 地上部分
干重及含氮量也高于接种 765 3R 植株 (见表 2) 。
表 2 转移接合子 , e分 R恤 BI 幻 D共生效应的测定
T妞bk 2 5如山沁itC P or pe rt 此 of lt a l芍 co nj 叫塑nL t 765 3 R 印BJ 组 )
接种物
玩以刘胡匕
乙炔还原活性
A ce t贝姗 阎 u。月 碱 ivi yt
(拜四 l · g一 , · h 一 l)
地上部分干重
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(% )
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76 5 3 RA 2 25
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2 .4 2 竞争结瘤能力的测定 从 765 3R (P BJ 5l )及 7653 R 所结根瘤 中各随机挑选 50 个 。
将根瘤压碎汁在 YM A + Km 平板上划线 。 结果表明 : 所有 7653R甲BJ S卫 )形成的根瘤均
能检出 Km犷根瘤菌 ,而 765 3R 形成的根瘤均不能检出 K m ) 根瘤菌 。 因此 K l n r 可以作为
测定 765 3R (PBJ l5 ) 占瘤率的标记 。
将 76 53 R (P JB l5 )及 76 53R 以细菌数 :1 1的 比例混合均匀 , 然后接种紫云英植物 , 从所
结根瘤中随机挑选 50 个 , 将根瘤压碎汁涂 YM A十 K n l 平板 , 结果从其中 40 个根瘤中分离
出 K m r 根瘤菌 。 因此 7653 R印J B l5 ) 的占瘤率为 80 % , 而 7653 R 的 占瘤率为 20 % 。 可见
转移接合子 7653 R印BJ SIJ ) 的竞争结瘤能力也高于原菌株 7653 R 。
2 5 转移接合子 7反分R勿R az l匀及 765 3 R印R m SL 均 共生效应的测定
重组质粒 p R aZ 巧及 p R r 6 L 26 的载体质粒是 p L AF R I
。 在盆栽条件下 比较转移接
合子 765 3R 伽LAF R )I 与 7653 R 的共生 固氮能力
, 结果表明 : 载体 p LAF R I 对 76 53 R 的共
生固氮效率没有影响 。 转移接合子 7653 R 中R az 巧 ) 与 7653 R 相 比 , 在固氮酶活性及接
种植株地上部分干重方面没有显著差异 , 但结瘤数量减少 。 转移接合子 7653R (P R mS L 26)
不但在固氮酶活性及接种植株地上部分干重方面显著高于 7653 R , 而且结瘤数量显著增
多 (见表 3) 。 重复验证仍得到类似结果 (数据未列 ) 。
中 国 农 业 科 学 28 卷
表 3
aT bel 3
转移接合子 7已35 R 印R aZ 均和 7 e 妇R印R . 6 U均 的共生效率
S帅 bio cit por ep rjt 此 o f it a n双刀 nj 刊笋 n st 7653 R (P R a Z I习 a记 7 653R (P R r 6 L 2 )6
接种物
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:c 在 “ = a ol 水平差异显著 is gn if can t d迁er etn 忱 at 0 01 le代 I
3 讨论
本研究将豌豆根瘤菌共生质粒 p BJ SJ I 导人紫云英根瘤菌野生 型菌株 7653 R 之后 , 植
物盆栽结瘤实验表明转移接合子 7653 R (P JB 5l ) 不但结瘤固氮能力较出发菌株 7653 R 显
著提高 , 而且表现出较高的竞争结瘤能力 , 从而具有潜在的应用价值 。 该结果表 明通过导
人异源共生质粒 (基因 )的方法是可以提高根瘤菌的共生固氮效率的 。
自 or 年代以来 , 国内外的研究者进行了很多共生基因的转移工作 , 但其 目的多数在
于研究外源共生基因的表达 , 很少涉及到导人的外源共生基因对受体菌共生固氮效率的
影 响 , 即两套共生基因间的相互作用 。 对于在育种工作 中能否 有效地利用共生基因间的
相互作用来改变根瘤菌的共持特性还知之甚少 。 从本研究及笔者以前的工作阁 来看 , 根
瘤菌共生基因间的相互作用是多方面的 , 向受体根瘤菌中导人外源共生基因 , 既可以产生
正效应 ,也可以产生负效应 ,或者没有显著性影响 。 因此在针对特定根瘤菌的共生性状进行
遗传改造时 , 导人足够多的不同来源的大片段共生基因 , 从中选出有价值的遗传组合是 一
条值得更进一步探索的技术途径 。
参 考 文 献
陈华癸 .草籽绿肥 根瘤细 菌和人工接种 . 新科学 . 19 52 ,:3 3 一 38
张学贤 ,等 .紫云英根瘤菌与豌豆根瘤菌共生质粒间的相互作用 . 华中农业大学学报 . 1姚 , 1 (:2) 17 5一 181
张学贤 ,等 . 导人外源共 生基 因对大豆根瘤菌共生效率的影响 . 农业生物技术进展与展望 . 中国科技大学出版社 ,
l卯3 : 13 3一 14 1
张学贤 ,等 .外源共生质粒 p BJ SIJ 在紫云英根瘤菌 (R hi 勿 ib u o hu ak iu o中的稳定 性 . 华中农业大学学报 . 1贷洲 , 1义:1) 1一 8
张忠明 , 等 . 紫云英根瘤菌基因文库的构建及含完整结瘤基因的重组质粒 p R` 2 15 的分离 . 生物工程学报 .
19 1
,
7 ( 3): 2 1 3一 2 19
王常霖 , 赫 茨 . 转座子 T ns 一mo b 对菜豆根瘤菌共生基因的诱变 、 车拜; 和初步定位 . 遗传学报 . 19 88 , l又:1) 25 一 3
B伦丹 in N J , d 日 . N a ut 间 v iar a it o n in R h oz biu m p】a , ” id s b M o l划衍 G即 de cs o f ht e aB 沈州 a 一 p俪 t
如 t的币 o n , P u h ler A . ( d . ) 即 ir .笋 一 v曰雌 致的 in H d dd b雌 N ew Y o kr oT ky o . l贝妇: 1 13一 l扮
4期 张学贤等 : 外 源共生基因对紫云英根瘤菌共 生效率的影响 19
8 伪 . H K 声 目 . n 田旧 d川由俄 d该对b u it o n , . l o gy an d u曲az 6 o n o f 月g m 护如 s 血如s 一而 , b必 另叨 b io感 ln 卜 i加 g日 1
F恤 iot o Re 笼 . tI如 io Q加 a, G . F . H o n g (曰 . ) 印 d n笋一 、州吨 . 1卯去月匆 一朽 5
9 口曰 w X , et 日 . R h伽 biu m h u ak 诚 甲 . n o v . 面 aI edt for m ht e or o t n o d u les o f 才口 m卯匆 s 坛厄 c US, nI t . 二 S》、 E晚 tC断 0 1·
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成份云n 76 53 R . T ar 理弧 o nj gu a n t 7 65 3R ( PR n 6 12 6) 批 a】犯 脚详 ir o r to 7 65 3 R i n in tr og e . 义记 a e it柱yt .
由阅 t dr y we ig ht a dn 报川 ul e num be r . T ar cns onj gu a nt 765 3 R 印R a Z I匀 几m袄月 les 以刃 ul es hat n 765 3R
.
Ke y ow
r d s : R厉 z o bium h姚沃诚 ; Sym 肠 iOt e g e以罚 Sym肠 iOt e e if d e理 y: C onj gu a it v e 加俏血 r
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