全 文 ：第 30卷　第 1期
1998年 1月
生物化学与生物物理学报
ACTA BIOCHIM ICA et BIOPHYSICA SINICA
Vo l. 30, No. 1
Jan., 1998
收稿日期: 1997- 04- 23　接受日期: 1997- 06- 08
* 国家攀登计划资助项目
紫云英根瘤菌 Exo-变种的生理遗传及胞外
多糖组分分析*
粟文英　宋鸿遇
( 中国科学院上海植物生理研究所 , 上海 200032 )
王克夷
( 中国科学院上海生物化学研究所 , 上海 200031 )
摘要　　从质粒 p JB11-B6的 8. 5 kb野生型 DN A片段中克隆到 5. 8 kb和 2. 6 kb的 DN A片段 , 其中 5. 8 kb的
片段能互补紫云英根瘤菌 107菌株的胞外多糖 ( EPS)缺陷型变种 NA06和 NA12, 2. 6 kb的片段只能互补变种
N A12。回接实验和电镜切片显示 , 这两个变种的根瘤与野生型显著不同 , 无固氮活性 , 根瘤内基本不含类菌体 ;
它们的 Exo+ 回复子的根瘤与野生型根瘤相似 , 多数细胞含有类菌体 , 但仍无固氮活性。 EPS含量及 Sephadex G-
75柱层析分析显示 , 菌株 107的 EPS主要由大分子量多糖组成 , 变种的 EPS则刚好相反 , 而回复子的 EPS在产
量及结构上均较变种有所恢复 , 但与菌株 107相比仍有较大差异。
关键词 　　 紫云英根瘤菌 ; exo基因 ; 胞外多糖 ; 电镜 ; 层析
　　根瘤菌与豆科植物之间相互作用 , 能形成具有
固氮活性的根瘤。一系列的研究表明 , 根瘤菌所分
泌的体表多糖 ,特别是酸性胞外多糖 ( EPS) , 在根
瘤的发育过程中起了重要作用 , 例如 R. melilot i的
EPS合成基因 exoB突变后 , 根瘤菌只能诱导宿主
根部形成假瘤 , 瘤内没有侵染线及类菌体 [1 ] ; 而
exoH突变后 , 只能形成空瘤 , 即根瘤菌滞留在侵
染线内 , 不能释放进入根皮层细胞 [2 ]。紫云英根瘤
菌 ( Rhizobium huakuii ) EPS 合成缺陷型变种
NA01, N A02及 NA04的研究也发现 ,胞外多糖的
缺乏使根瘤菌只能诱导宿主形成无固氮活性的小的
瘤状突起 (callus) , 其内没有侵染线及类菌体 [3 ]。本
文报道对紫云英根瘤菌 Exo-变种 NA06和 NA12
进一步的研究 , 我们克隆到能互补变种 NA06和
NA12的 5. 8 kb和 2. 6 kb DN A片段 ,通过对野生
型菌株 107、变种和回复子的多糖组分分析 , 回接
实验及电镜切片分析发现 , EPS对根瘤的生长发育
是必不可少的。 EPS的量和结构的变化 , 尤其是后
者 , 会影响侵染线的延伸、根瘤菌的释放等一系列
过程。
材 料 和 方 法
1. 1　材料
菌种和质粒 (表 1)。根瘤菌生长培养基为 TY,
产糖培养基为 BMM和 M培养基 , 培养温度为 28
°C; 大肠杆菌生长培养基为 LB, 培养温度为 37
°C[4 ]。抗生素及使用浓度: 利福平 ( Ri f ) , 50 mg /L;
卡那霉素 ( Km ) , 50 mg /L; 氨苄青霉素 ( Ap) , 100
mg /L; 四环素 ( Tc) , 15 mg /L。
1. 2　方法
1. 2. 1　质粒的接合转移　　参照 Simon等 [ 5]的方
法 , 助质粒为 pRK2013, 选择培养基为 BMM。
1. 2. 2　植物的结瘤分析　　参照 Ro lf等 [4 ]使用的
方法。植株固氮酶活性的测定采用乙炔还原法测
定 [6 ]。
1. 2. 3　胞外多糖含量的测定　　采用硫酸酚法和
改进的葡萄糖醛酸法测定 [7 ]。
1. 2. 4　 DNA的酶切克隆及 Southern转移和同位
素杂交分析　　均参照 Sambrook等 [8 ]的方法。
1. 2. 5　胞外多糖的分离纯化　　用柱层析法 , 取
培养 5天的紫云英根瘤菌培养液 , 17 000 g离心 30
min, 取上清液旋转蒸发浓缩至浓度为 2 g /L待用。
用分子筛凝胶过滤柱 Sephadex G-75进行柱层析 ,
0. 2 mol /L的磷酸缓冲液 ( pH 8. 0)平衡洗脱 , 部分
收集 , 硫酸酚法和葡萄糖醛酸法测定。
Table 1　 The bacteria l str ains and pla smids used
in the experiments
St rains and plasmids
Relevant genotype
or phenotype
Sou rce of
reference
R.huaku ii 107
W ild type; Exo+ Nod+
Fix+ ; RifR
　龙北国等 [6]
N A06
Exo- Nod+ Fix- ; RifR
KmR
　龙北国等 [6]
N A12
Exo- Nod+ Fix- ; RifR,
KmR
　龙北国等 [6]
Plasmid
pRK415 Mob+ Inc P; TcR Keen et a l. [9]
pRK2013 Tra+ Inc P; KmR Simon et al . [5]
结 果
2. 1　可互补紫云英根瘤菌变种 NA06、 NA12的
DNA片段的亚克隆及物理图谱分析
紫云英根瘤菌野生型菌株 107能产生大量的
胞外多糖 , 在 BMM培养基上形成均一的、 含大量
粘液的光滑型 ( Exo+ )菌落 ; 用转座子 Tn5插入诱
变后 , 在 BMM 培养基上筛选到一系列粗糙型
( Exo- )菌落 , 根据其共生结瘤及固氮特点 , 分成 4
个类群 [6 ] , 其中变种 NA06及 NA12能诱导宿主紫
云英根部产生小的球形白色根瘤 , 没有固氮活性。
用质粒 pMN2从 Exo-变种 NA11中构建的带有菌
株 107胞外多糖 exo基因簇的质粒 R′-11, 能恢复
B类变种的多糖表型及结瘤能力 ; 对 R′-11进行亚
克隆得到的杂合质粒 pJB11-B6含 8. 5 kb的野生
型菌株 107的多糖基因片段 [3 ] , 该质粒也能互补变
种 NA06及 NA12。我们对质粒 p JB11-B6中的
8. 5 kb野生型 DNA片段作进一步酶切分析 , 其物
理图谱如图 1。再以 pRK415为载体 , 对此 8. 5 kb
片段作亚克隆 , 得到二个杂合质粒 (图 1) , 分别命
名为 pWS-6BP1和 pWS-6BP2, 其中外源片段大小
分别为 5. 8 kb和 2. 6 kb; 以 pRK2013为助质粒 ,
将这两个杂合质粒分别与变种 NA06和 NA12作
三亲本杂交 , 发现质粒 pWS-6BP1能互补 NA06
和 N A12, 在 BMM培养基上能回复变种的多糖表
型 , 而质粒 pWS-6BP2只能回复 NA12的多糖表
型。由此可见 , 变种 NA06和 NA12分别是由不同
的 exo基因位点突变引起的。
Fig. 1　 Map o f plasmid p JB11-B6
Res t riction en zyme si te are d esig nated B (B amHI) , E ( EcoRI)
and P ( Pst I) . The s olid blocks repres en t pRK415 polylinker re-
gions containing HindIII-Spha I-Pst I-X ba I-B amHI-Sma I-Kpn I-
　　　　 Sst I-Eco RI res t rict ion.
2. 2　质粒 pJB11-B6, pWS-6BP1和 pWS-6BP2
与 B类变种的结瘤互补分析
紫云英根瘤菌野生型菌株 107回接到宿主根部
一星期后 , 即能诱导宿主产生根瘤 , 五星期后 , 每
株紫云英根部有 10个左右长椭圆形的粉红色或绿
色根瘤 , 具有固氮活性。而 Exo-的变种 NA06和
NA12只能诱导宿主形成圆形白色的无效小根瘤
( Fix
-
) , 数目多出野生型菌株 107的 1 /3左右 , 而
且根瘤的产生时间推迟 5天左右。变种 NA06和
NA12的 Exo+ 回复子诱导宿主产生根瘤的时间及
根瘤的大小、数量都与 107的相似 , 但是这些根瘤
呈圆形白色 , 而且没有固氮活性。
光镜和电镜分析发现 , 菌株 107诱导紫云英产
生的根瘤内 , 大部分细胞都充满椭圆形的类菌体 ,
只有极少量淀粉颗粒分布在这些细胞的周边 , 在含
菌细胞及细胞间隙中有许多包着根瘤菌的侵染线 ;
类菌体形态规则 , 呈椭圆形和长椭圆形 (图 2a) , 类
菌体中含有大量水滴状的 PHB颗粒 , 显示类菌体
的碳代谢良好。变种 NA06和 NA12诱导产生的根
瘤中也有侵染线 , 然而与野生型根瘤菌 107不同的
是 , 根瘤菌多数停留在侵染线内 , 只有少数能释放
进入根皮层细胞内分化成类菌体 , 因此 , 根瘤的大
部分细胞都是不含类菌体的空细胞 , 只在靠近分生
组织的区域有少数细胞中含有少量类菌体 , 而且类
菌体周围有较多淀粉粒 ; 类菌体形态呈多样化 , 部
分类菌体膜不完整 , 类菌体中未发现 PHB颗粒 (图
2b )。而回复子的根瘤内大量细胞均含有类菌体 ,
它们的分布较菌株 107的类菌体稀疏 , 在细胞间隙
及细胞中均可见到包有根瘤菌的侵染线 ; 类菌体的
形态不规则 ,其中只有少量 PHB颗粒 , 部分类菌体
外膜不完整 , 开始有类菌体衰老及分解 (图 2c)。
2. 3　野生型菌株 107及其变种和回复子的胞外多
糖的含量和组成分析
分别用葡萄糖醛酸法和硫酸酚法检测野生型菌
株 107及其变种和回复子的胞外多糖含量 (表 2)。
48 　　生 物 化 学 与 生 物 物 理 学 报 第 30卷
Fig . 2　 Elec tron micro g raph o f nodules fo rmed by inocula tion o f Rhizobium huakuii
Nodules prepared for microscopy 5 w eek s af ter inoculation. a, Fix+ nodule formed by in oculation of parent st rain 107 sh ow ing
rod shaped bacteriods; b, Fix- nodule formed by inoculation of N A06 mutant; c, Fix- nodu le formed by inoculat ion of mutant
　 NA06 car rying i ts com plemen ting plasmid pJB11-B6. B, bacteriods; IT, infection th read; PHB, polyhyd rox ybutyrote;
S, s tarch. The bar = 5μm.
结果发现 , 变种 NA06和 NA12胞外多糖中的葡萄
糖醛酸含量只有野生型菌株 1 0 7的 6 . 1 8% 和
7. 09% , 而回复子能恢复到菌株 107胞外多糖的约
20%～ 30%水平。而变种 NA06和 NA12胞外多糖
中的己糖含量也只有菌株 107胞外多糖的 2. 25%
和 3. 05% , 回复子则能恢复到菌株 107胞外多糖
的 20%～ 30%的水平。
Table 2　 Com pa rison o f EPS contents of Rhizobium huakuii
g roup B Exo- m utants and their
Exo+ transconjugants
St rain
Colony
appearance
E PS con tenta
Hexose /%
Uronic
acid /%
Plan t grow th
response
Rh107 Muc+ 100 　 100　 Fix+
NA06 Muc- 2. 3± 0. 14 6. 2± 0. 4 Fix-
NA12 Muc- 3. 1± 0. 23 7. 1± 0. 5 Fix-
NA06
( p JB11-B6)
Muc+ 20. 8± 1. 30 27. 2± 1. 3 Fix-
NA12
( p JB11-B6)
Muc+ 24. 9± 1. 60 23. 2± 0. 5 Fix-
NA06
( pWS-6BP1)
Muc+ 26. 5± 1. 50 24. 8± 1. 6 Fix-
NA12
( pWS-6BP1)
Muc+ 32. 9± 1. 20 27. 6± 1. 3 Fix-
NA06
( pWS-6BP2)
Muc- 4. 4± 1. 00 6. 1± 0. 2 Fix-
NA12
( pWS-6BP2)
Muc+ 10. 7± 1. 10 21. 5± 1. 1 Fix-
　　 a The 100% of EPS is equal to per ml cul tu re supernan t contain-
ing 1 550μg h exos e and 532μg u ronic acid , respectiv ely. Sym bols:
+ and - refer to ni t rogen fixation and no ni t rogen fixation resp ec-
tively. Th e percentages of EPS conten ts are average resu lt s of 4
times experimen ts.
　　 Sephadex G-75凝胶柱层析分析野生型菌株
107及变种和回复子的胞外多糖发现 , 菌株 107的
胞外多糖洗脱过程中出现两组峰 (图 3a) , 一组峰
的洗脱体积与分子量为 49 kD的葡聚糖标定物相
似 , 说明其分子量近似于 49 kD, 另一组峰的洗脱
体积稍小于分子量为 6 kD的葡聚糖标定物 , 大小
分子量多糖的峰面积比约为 1∶ 0. 13, 说明此酸性
胞外多糖主要由大分子量多糖组成 ; 这两组峰都分
别由数个峰组成 , 说明野生型胞外多糖的组分很复
杂。而各个峰的己糖与葡萄糖醛酸比例均有较大差
异 , 显示各个峰多糖除了分子量上的差异外 , 结构
上也不尽相同。
变种 NA06和 NA12胞外多糖组分较菌株 107
的简单 , 洗脱过程中各有三个单峰出现 (图 3b,
3d ) , 其中大小分子量两个峰的洗脱体积与菌株
107胞外多糖的两组峰的洗脱体积相似 , 说明这两
种多糖的分子量与菌株 107的两个多糖组分的分
子量相似。但两个变种胞外多糖的己糖与葡萄糖醛
酸比例与野生型菌株 107的完全不同 , 提示它们在
结构上存在差异。在这两个糖组分之间还有一中等
分子量的糖组分出现 , 大中小三个峰的峰面积比分
别为 1∶ 1∶ 7. 7 ( N A06) 和 1∶ 1. 4∶ 7. 5
( N A12) , 说明变种的胞外多糖主要由小分子量的
多糖组成 ; 两个变种之间除大分子量多糖的己糖与
葡萄糖醛酸比例相似外 , 另两种分子量多糖的比例
完全不同 , 这也提示变种 NA06和 NA12所失活的
exo基因是不同的。
回复子 NA06 ( p JB11-B6)和 NA12 ( pJB11-
B6)的胞外多糖在与变种相似的洗脱体积处也出现
三个峰 (图 3c, 3e) , 峰面积比分别为 1∶ 0. 67∶
2. 4和 1∶ 1. 3∶ 3. 3。与变种的胞外多糖相比 ,
大中两种分子量多糖含量增加了 , 小分子量多糖含
量则大大减少了 , 因而在组成上更接近野生型
49第 1期 粟文英等: 紫云英根瘤菌 Exo-变种的生理遗传及胞外多糖组分分析
EPS, 尽管它们仍未达到野生型 EPS的水平。而野
生型胞外多糖和回复子胞外多糖的己糖与葡萄糖醛
酸比例也有较大差异。结果提示 , 尽管两个菌株回
复了野生型多糖表型 , 而且胞外多糖在组成上也较
变种有所恢复 , 但在结构上仍与野生型胞外多糖存
在较大差异 , 因而 , 在回接实验中 , 尽管回复子诱
导宿主紫云英根部产生与野生型相似的根瘤 , 这些
根瘤仍未恢复固氮活性。
Fig . 3　 Sephadex G-75 co lumn chromatog raphy of EPS
a, Rh107; b, N A06, Exo- mutant of Rh107; c, N A06 ( p JB11-B6) , Exo+ t ransconjugant; d, NA12, Exo- mu tant of Rh107; e,
N A12 ( pWS-6BP2) , Ex o+ transconjugant. Th e column ( 2 cm × 95 cm) w as equilibrated and elu ted wi th 0. 2 mol /L phosph ate
buf fer (pH 8. 0) . Fractions 4 ml w ere collected and assayed for total hexose (· ) and uronic acid ( ) . To tal hexose applied to
column was about 8 g /L Glc equivalen t fo r ( a) , 6 g /L for ( b) , ( c) , ( d) and ( e) . Th e E PS conten ts are av erages of 4 times experi-
　　　　　　 men ts.
讨 论
　　在根瘤菌与宿主的共生固氮体系中 , 酸性胞外
多糖 ( EPS)对根瘤侵染线的形成及延伸起了重要作
用。 Stacey等 [ 10]的研究提示 , EPS可能是构成不定
型根瘤侵染线基质的重要组成成分。对 R. legumi-
nosarum trifol ii Exo
-变种的研究发现 , EPS的缺
失会阻碍根瘤菌从侵染线释放的过程。对紫云英根
瘤菌 EPS缺陷型 ( Exo- )变种 NA01, N A02和
NA04的研究也发现 , EPS缺失后 , 变种只能诱导
宿主根部形成瘤状小突起 , 不能形成根瘤 , 电镜切
片未发现其中有侵染线 [ 3]。我们对紫云英根瘤菌
Exo
-变种 NA06, N A12及其回复子的研究发现 ,
EPS缺失还会阻碍根瘤菌从侵染线释放进入根皮
层细胞的过程 ; EPS组分的初步分析发现 , 与野生
型菌株 107的 EPS相比 , 变种的 EPS中大分子量
的多糖极少 , 主要由小分子量多糖组成 , 而且还多
出一个中等分子量的组分 , 提示 Tn5的插入可能
破坏了 EPS合成过程中的某一个糖基转移酶 , 多
出的组分可能是 EPS合成的中间产物。
不久前 , Bat tisti 等 [11 ]对苜 蓿根瘤 菌 R.
melilot i菌株 Su47的大小两种分子量的 EPS作了
进一步的研究 , 结果发现 , 被丙酮酸和琥珀酸高度
取代的四聚体的小分子量 EPS能恢复 EPS缺陷型
变种 exoA, exoB, exo F, exoH的根瘤入侵能力 ,
使之诱导宿主产生具有固氮活性的根瘤。此外还发
现 , R. melilot i菌株 Su47的一类 EPS缺陷型变种
能产生一种高分子量的 EPSb ( EPSII) , 其结构异
50 　　生 物 化 学 与 生 物 物 理 学 报 第 30卷
于野生型的 EPS, 但是它能取代后者在根瘤入侵中
的作用。这些实验结果提示 , 在共生固氮过程中 ,
根瘤菌 EPS分子量的大小并不是它起作用的关键 ,
它的三维立体结构可能在其中起了重要作用。为了
进一步了解紫云英根瘤菌 EPS中与结瘤固氮有关
的多糖组分及其作用方式 , 我们拟将野生型胞外多
糖各组分作进一步的纯化和结构分析 , 并在回接实
验中分别加入这些纯化的多糖 , 以期找到有效的多
糖组分。目前 , 这一实验正在进行当中。
胞外多糖的产生是受到严格调控的 , 不适当的
调控或是过量的 EPS都会影响到侵染线的发育和
根瘤菌的释放过程 [4 ]。将紫云英根瘤菌野生型菌株
107的 exo基因片段克隆到载体上 , 再接合转移到
变种中去 , 由于基因产物的互补关系 , 可以使 EPS
得到部分恢复 , 但是 , 杂合质粒中的 exo基因不再
与其他的 exo基因处于同一严格调控下 , 因此 , 这
些回复子所产生的 EPS不但在量上 , 而且在组分
上都与野生型菌株所产生的 EPS存在差异。所以 ,
尽管这些菌株回复了多糖表型 , 组成上也较变种更
接近菌株 107, 它们仍不能恢复根瘤菌与宿主正常
的共生固氮关系。
另外 , 在对根瘤菌 R. legum insorum 的研究中
发现 [12 ] , 碳代谢的障碍同样会影响到根瘤类菌体的
固氮功能 , 在正常的碳代谢情况下 , 类菌体中有大
量 PHB颗粒 ; 碳代谢障碍时 ,类菌体中缺少此类颗
粒。研究还发现根瘤菌的 exo基因与碳代谢的基因
dct在同一个大质粒上 , 相互之间可能有着紧密的
联系 [13 ]。 Reed等 [14 ]的实验结果也提示 EPS缺陷型
变种可能同时影响了类菌体的碳代谢或氮代谢途
径。在实验中发现 , 野生型菌株 107的 Fix+瘤内 ,
类菌体含有大量代表正常碳代谢的 PHB颗粒 , 而
变种 NA06及 NA12的类菌体中未发现此类颗粒 ,
各回复子诱导产生的根瘤中 , 只有少数类菌体含有
少量的 PHB颗粒 , 而且类菌体的衰老及分解早于
菌株 107, 提示变种 NA06和 NA12 exo基因的突
变可能同时影响了其他与共生固氮过程有关的基
因 , 从而阻碍了类菌体的正常碳代谢过程 , 导致类
菌体的分化异常 , 并影响其固氮功能的发挥 , 这也
可能是 B类变种的回复子虽然能诱导宿主产生正
常大小的根瘤 , 但仍不能恢复其固氮活性的原因。
参 考 文 献
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51第 1期 粟文英等: 紫云英根瘤菌 Exo-变种的生理遗传及胞外多糖组分分析
Analysis of the Exo
-
Mutant of Rhizobium huakuii and Their
Exopolysaccharide Component
SU Wen-Ying and SON G Hong-Yu
( Shanghai Inst itu te of Plant Ph ysiology , the Chinese Academy of Sciences , Shanghai 200032, Ch ina )
WANG Ke-Yi
( Shanghai Inst itute of Biochemist ry , the Chinese Academy of Science, Shanghai 200031, Ch ina )
ABSTRACT　　We have subcloned tw o plasmids, pWS-6BP1 and pWS-6BP2, f rom the 8. 5 kb DN A frag-
ment of plasmid p JB11-B6. The plasmid o f pW S-6BP1, w ith a 5. 8 kb DN A fragment , can complement the
exopo lysaccharide-deficient mutant N A06 and N A12 of Rhizobium huakuii st rain 107, but the plasmid
pWS-6BP2, w ith a 2. 6 kb DN A fragment can only complement N A12. The ef fective nodules formed by
the wi ld type st rain 107 ( Rh 107) contain lo ts of bacteriods; the inef fectiv e nodules fo rmed by the mutants
N A06 and N A12 contain few bacteroids. Although the nodule fo rmed by Exo
+
transconjugants a re inef fec-
tiv e, the bacteria can be successfully released into the cells and fo rm lo ts of bacteroids. The Rh107 pro-
duces acidic exopolysaccha rides ( EPS) o f high molecula r w eight ( HMW ) in larg e amount wi th only small
amount o f low molecular w eigh t ( LMW ) fo rms. EPS secreted by mutants N A06 and N A12 are just the
o ther w ay round wi th LMW in higher amount than HMW ones. They also produce an EPS wi th mo lecula r
w eight in betw een. The EPS secreted by the Exo
+
t ransconjugants is mo re like the EPS of Rh107 than that
o f mutants, although their component and st ructure are sti ll dif ferent f rom tha t o f Rh107.
KEY WORDS　　Rhizobium huakuii ; exo gene; EPS; elect ron microscope; chromato graphy
52 　　生 物 化 学 与 生 物 物 理 学 报 第 30卷