全 文 ：第 30卷　第 4期
1998年 7月
生物化学与生物物理学报
ACTA BIOCHIM ICA et BIOPHYSICA SINICA
Vo l. 30, No. 4
July, 1998
收稿日期: 1997— 10— 14　　接受日期: 1997— 12— 18
　* 国家攀登计划资助项目
　 * * 联系 人: Tel , 0086-21-64042090-2292; Fax , 0086-21-
64042385
紫云英根瘤菌糖基转移酶基因 exoA的
克隆及序列分析*
宫　锋　粟文英　周蓓芸　宋鸿遇* *
( 中国科学院上海植物生理研究所 , 上海 200032 )
摘要　　从可互补紫云英根瘤菌 (Rhizobium huakuii 107)胞外多糖合成缺陷变种 N A03和 NA10的 exoR′-11上亚
克隆获得 2. 0 kb的 Bgl I酶切片段 , 命名为 p JB-H701。 p JB-H701不仅可纠正变种 NA03和 N A10的胞外多糖缺
陷表型 , 而且使两变种诱导宿主植物结瘤固氮能力恢复到野生型水平。测定了 R . huakuii 107的糖基转移酶基因
exoA及其 5′端上游和 3′端下游的部分序列 , 全长 1 969 bp。序列分析表明 , R . huakuii 107 exoA基因全长为 984
bp, 与 Rhizobium meliloti的 exoA基因 DNA序列有 73. 1%的同源性。从核苷酸序列推测其蛋白分子量约为 35
kD。其蛋白质氨基酸序列与 R .meliloti exoA基因产物 ExoA具有 63. 1%的同源性。本文还克隆了有启动子活性
的 exoA基因的 5′上游调控区 , 构建了 exoA-lacZ转录融合子 , 对其表达进行了初步分析。
关键词　　 紫云英根瘤菌 ; 糖基转移酶基因 ; 胞外多糖 ; DN A序列
　　紫云英根瘤菌是我国特有的温带快生型菌种 ,
能分泌大量的胞外多糖 , 在宿主植物紫云英上形成
无定型根瘤 [1 ]。用转座子 Tn5诱变 , 从野生型 107
菌株中得到一批共生固氮性状改变的胞外多糖合成
缺陷变种 , 其中 , 变种 NA03和 NA10可诱导宿主
植物形成有效瘤 , 但固氮效率低于野生型 [2 ]。龙北
国等通过细菌遗传技术构建了嵌合质粒 exoR′, 研
究了 exoR′与各变种间的交叉互补 , 建立了 107菌
株 exo基因簇的连锁图谱 , 并证明 exoR′-11可校正
变种 NA03和 NA10的胞外多糖合成的缺陷 , 使两
个变种诱导宿主植物结瘤固氮的能力恢复到野生型
水平 [3, 4 ]。陈汉才等证实 R . melilot i的糖基转移酶
基因 exoA可以互补 R. huakuii 107的变种 NA03
和 NA10[ 5]。本文在 Southern杂交结果的基础上 ,
通过进一步的亚克隆、体内互补分析和启动子探测 ,
发现 R. huakuii 107菌株中糖基转移酶基因 exoA
位于 exoR′-11的一段 2. 0 kb的 Bgl I酶切片段内 ,
测定了此片段的 DNA序列 , 并对 exoA基因的阅
读框架和 5′上游启动子活性进行了分析。
材 料 和 方 法
1. 1　材料
1. 1. 1　菌株和质粒　　实验所用菌株和质粒见表 1。
1. 1. 2　主要药品来源　　限制性内切酶、 T4 DNA
连接酶购自 Bio-lab公司和华美生物工程公司 , 碱
性磷酸酯酶购自 Boehringer M annheim公司 , 琼脂
糖、抗生素购自 Sigma公司 , 低溶点琼脂糖购自
BRL公司 , Erase-a-Base试剂盒、 T7 DNA聚合酶
测序试剂盒、 Taq Track测序试剂盒 ( Deaza)购自
Promega公司 , [α-32 P]d ATP购自北京亚辉生物医
学工程公司 , [α-35 S ]d ATP购自 Amersham公司 ,
其他所用药品均为分析纯。
1. 2　方法
1. 2. 1　培养条件　　 E. coli于 37℃振荡培养。
SOB、 SOC、 LB培养基参照文献 [6]。根瘤菌于 28
℃培养 , 培养基为 BMM和 TY[7 ]。根据实验需要
添加不同抗生素 , 浓度如下: Ampici llin 100 mg /
L, Tet racycline 15 mg /L, Kanamycin 50 mg /L,
Rifampin 50 mg /L。
1. 2. 2　 DNA操作　　质粒 DNA的制备和纯化、
去磷酸化反应和连接反应、低熔点琼脂糖凝胶回收
DNA方法、α-互补现象的检测、大肠杆菌感受态细
胞的制备及转化、 M13噬菌体感染方法、复制型及
Table 1　 Strains and plamids
Relevant characteris tics Sou rce / Reference
St rains
R .huaku ii
　 107 wi ld type, RifR [2 ]
　 NA03 Tn5-induced Exo-, Nod+ Fix* , RifRKmR [2 ]
　 NA10 Tn5-induced Exo-, Nod+ Fix* , RifRKmR [2 ]
R .melilot i
　 SU47 wi ld type Vincent 1941
　 Rm 1021 SU47 SmR [7 ]
　 Rm 7031 Rm1021 exoA31∷ Tn5 [7 ]
E . col i
　 DH5α supE44Δla cU169Υ80lacZΔM 15 Labaratory collection
hsd R17 rec A1 endA 1 gyrA 96 thi-1 relA 1
　X L1-blue supE44 hsd R17recAl euA end Al gyrA46 thi Labaratory collection
rel Allac F′[p ro AB+ lacIqlac ZΔM15Tn10( tetR) ]
Plasmids
　 pBluescript KS ApR, s equencing vector Sho rt 1988
　 pBluescript SK ApR, s equencing vector Sho rt 1988
　 pM P220 TcR, p romoter-probe plasmid [8 ]
　 p JB-H7 12. 5 k b Hind III f rag men t of exoR′-11 th is w ork
cloned in pRK415, TcR
　 p JB-H701 2. 0 k b B gl I f ragment cloned in pRK415 th is w ork
　 p JB-H7011 1213 bp Bg l I-X ho I f rag men t cloned in pM P220 th is w ork
　 PJB-H7013 1112 bp Sac II-B gl I f rag men t cloned in pM P220 th is w ork
Ph ag es
　 M13mp18 /19 ApR, s equencing vector Messing 1983
单链 DNA的抽提均按文献 [6]所述进行 ; 限制性内
切酶反应按厂家说明书进行。
1. 2. 3　单向缺失克隆的构建　　采用 Promega公
司的 Erase-a-Base试剂盒 , 按厂家说明书进行。
1. 2. 4　测序引物的合成　　测序引物为 17 mer寡
聚核苷酸 , 在 Beckman Olig o 1000 DN A合成仪上
合成。
1. 2. 5　 DNA序列测定及 Tn5插入位点的精确定
位　　采用 Sanger的双脱氧终止法 , 测序反应按
厂家说明书进行。手动测序电泳采用 Bio-Rad的
Sequi-GenII核酸测序电泳系统。以 Tn5臂末端 85
bp～ 102 bp的 5′-AGTT ATCAT GAACGT TA-3′
为引物进行插入位点的精确定位。
1. 2. 6　 exoA-lacZ转录融合子的构建　　参照文
献 [8 ] , 以 pM P220为载体。
1. 2. 7　β -半乳糖苷酶活性测定　　参照文献 [6] ,
略有改动。
结 果
2. 1　R. huakuii 107 exoA基因的克隆
exoR′-11可互补变种 NA03和 NA10[ 3] , 表明
exoR′-11上带有与两个变种突变位点对应的野生
型基因。 exoR′-11携带了约 35 kb的 R. huakuii
107的野生型基因 [4 ]。在 Southern杂交的基础上
(结果未列出 ) , 以 pRK415为载体亚克隆了 exoR′-
11的 HindIII酶切片段 , 得到的杂合质粒 p JB-H7
可互补变种 NA03和 NA10。再以 pMP220为载体
进一步亚克隆了 p JB-H7的 2. 0 kb的 Bgl I酶切片
段 , 得到杂合质粒 p JB-H701, 见图 1。经三亲本杂
交验证 , 接合子 NA03( p JB-H701)和 NA10( p JB-
H701)的胞外多糖表型均恢复到野生型水平。
320 　　生 物 化 学 与 生 物 物 理 学 报 第 30卷
Fig. 1　 Th e subcloning and phy sical map of the 2. 0 kb
B gl I f ragment invo lv ed in EPS synthesis
The su bclon ed f rag men ts us ed in t rans crip tional fusion are als o
show n. Symbols: (→ and × ) presence or absence respectiv ely
of β-galactosidas e activi ty ass ociated wi th th es e f ragments wh en
fus ed to lac Z in the di rection of th e arrow. (→ ) putat ive cod-
ing region and th e di rection of t ranscription. Res t riction si tes:
B, B amHI; Bg, B gl I; E, EcoRI; H, Hind III; P, Pst I; Sa,
Sal I; SI, Sac I; SII, Sac II; X , X bo I.
　　利用 Tn5定位突变技术 , 在 p JB-H701的 2. 0
kb片段内插入 Tn5, 得到质粒 p JB-H701∷ Tn5。
通过三亲本杂交 , 将 p JB-H701∷ Tn5转至变种
NA03和 NA10中 , 接合子的胞外多糖表型没有恢
复。
2. 2　异源互补分析
陈汉才等已经证明 , R. melilot i的 exoA基因
可互补 R. huakui i 107的胞外多糖缺陷变种 NA03
和 NA10[5 ]。通过三亲本杂交 , 我们把 p JB-H701导
入 Rm7031(exoA∷ Tn5) , 发现 p JB-H701也可校
正 Rm7031的胞外多糖缺陷表型。可见 , R. huakuii
107 exoA基因与 R. meliloti的 exoA基因编码的蛋
白在功能上是可以相互替代的。
2. 3　R. huakuii 107 exoA基因的序列测定
通过体内遗传互补分析和启动子探测 , 我们推
测 R. huakuii 107的 exoA基因定位于 exoR′-11的
一段 2. 0 kb的 Bgl I酶切片段内。按材料和方法所
述我们从正反两个方向测定了这一片段的 DNA序
列。在测序中我们用 7-deaza-dGTP代替 dGTP, 以
防止 GC压缩 ( GC compression)。经测定 , 此片段
全长为 1969 bp, 全序列见图 2。
将该序列用 PCGENE程序进行分析 , 表明这
段 DNA序列中存在一个主要的开放阅读框架
( O RF)。从第 886位的 ATG起始 , 终止于第 1870
位的 TGA。在此起始密码子 A TG前 7个核苷酸存
在一个可能的核糖体结合位点 ( RBS)。探测此 ORF
为 R. huakuii 107的 exo A基因。此 ORF编码一个
328个氨基酸的蛋白质 , 分子量约为 35 kD, 见图
2。它与 R. meliloti的 ExoA蛋白 [9 ] ( 38 kD)大小相
似。蛋白质的疏水性特征分析显示 , R.huakuii 107
的 ExoA蛋白是一种穿膜蛋白 , 它至少有三个典型
的穿膜疏水区 , 见图 3。
Tn5插入位点精确定位结果显示 , 变种 NA03
的 Tn5插在 1491 bp处 , 变种 NA10的 Tn5插在
1714 bp处 , 均位于推测的 exoA基因的 ORF内 ,
见图 2。由此可见 , N A03和 NA10的 Exo-表型是
因为 Tn5插入导致 exoA基因失活引起的。
321第 4期 宫　锋等: 紫云英根瘤菌糖基转移酶基因 exoA的克隆及序列分析
Fig . 2　 Nucleo tide and deduced amino acid sequences of R . huakuii e xoA gene
Th e arrrowh eads repres en t th e sequenced and mapped posit ions of the di fferen t Tn 5 ins er tions in the tw o m utan ts
described in the tex t.
Fig . 3　 Hydrophobility plo t o f ExoA
Th e most probable poten tial integral m emb rane s egments are heavily
shaded , and th e possible in tegral mem bran e seg men ts are ligh ty
sh ad ed ( stippled) .
2. 4　 G+ C百分含量及密码子使用频率分析
R. huakuii 107的 exo A基因 G+ C百分含量为
64. 9%。在密码子的利用上 , 其三联密码子的第三
位碱基倾向于利用 GC, 百分含量达到 81. 9%。
2. 5　 R. huakuii 107 exoA基因与 R .melilot i exoA
基因的同源性比较
利用 PCGEN E程序 , 我们比较了 R. huakuii
107 exoA基因和 R. melilot i exoA基因 [ 9]的 DNA
序列。 R .huakui i 107 exoA基因与 R. melilot i exoA
基因的 DNA序列同源性很高 , 达到 71. 1% 。我们
还把 R. huakuii 107 exoA基因可能编码的蛋白质
氨基酸序列与 R. meliloti ExoA氨基酸序列进行了
比较 , 见图 4, 它们的同源性达到 63. 1% 。
322 　　生 物 化 学 与 生 物 物 理 学 报 第 30卷
Fig. 4　 Aligment o f R . huakuii (Rh ) ExoA and R .meliloti (Rm ) ExoA
protein sequences
Amino acid identi ty is indicated b y a bar(|) .
2. 6　exoA基因 5′上游启动子活性分析
pMP220是一 个启 动子探 测质粒 , 带有
pM P220的菌株在含有 X-gal的平板上为白色。当
含有启动子的片段以正确的方向克隆到 pM P220
的多克隆位点中时使其呈蓝色。我们以 pM P220为
载体构建 exoA基因的转录融合子 , 见图 1。 pJB-
H7011包含 exoA基因的 5′上游区和一小部分结构
基因 , p JB-H7013只包含 exoA的结构基因。分别
测定两质粒在大肠杆菌和紫云英根瘤菌中的 β -半乳
糖苷酶活性 , 表明 pJB-H7011含 exoA基因的启动
子 , 该启动子可以在大肠杆菌中表达 , 但启动子活
性比在紫云英根瘤菌中低。
讨 论
通过 Southern杂交、互补分析和启动子探测 ,
从 exoR′-11上克隆到可互补 R.huakuii 107 Exo-变
种 NA03和 NA10的 exoA基因。它与 R. melilot i
exoA基因的同源性很高 , 其核苷酸序列同源性为
73. 1% , 蛋白氨基酸序列同源性为 63. 1%。异源互
补实验的结果显示二者在功能上可以相互替代 , 暗
示 R. huakuii 107 exo A与 R. melilot i exoA编码的
同工蛋白在各自的菌体中起着相似的作用。已经发
现 , R. melilot i exoA编码糖基转移酶 , 在 EPSa合
成过程中 , 催化将第一个葡萄糖残基添加到延伸中
的糖链亚单位中间体上 [10 ]。
启动子分析结果表明 , 在 R. huakuii 107 exoA
基因 5′上游存在一个启动子 PexoA控制 exoA的表
达。在 R. meliloti中 , exoA上游也存在一启动子 ,
但较弱 , 它的转录主要受 exoH上游一强启动子的
控制 , 推测 exoA上游的弱启动子仅在精细调节时
起作用 [9 ]。 R. huakuii 107 exoA的转录是否与此类
似及启动子的精确定位都有待于进一步研究。
R. huakuii 107的 Exo-Nod+ Fix±变种 NA03和
NA10可诱导宿主植物紫云英结有效根瘤 , 只是固
氮活性较亲本菌低 , 为野生型的 52% ～ 75% [ 2 ]。两
个变种产生的胞外多糖量为野生型的 3%～ 6% [5 ]。
而恢复子 N A03( p JB-H701)和 NA10( pJB-H701)的
固氮活性和胞外多糖量均达到野生型水平。在 R.
melilot i中 , 已经发现两种在功能上可相互替代的
EPS: EPSa和 EPSb, 只有当细菌不能产生 EPSa
时 , EPSb才产生。 R. huakuii 107 exoA基因变种
NA03和 NA10能诱导有部分固氮能力的根瘤形
成 , 可能有类似的机制起作用。也可能是因为少量
的 EPS已足够引起细菌对植物的感染 [5 ]。尽管高效
的感染需要足够量的 EPS。
我们已经报道了 R . huakuii 107 exoU基因可
校正 Exo-Ndv-Fix-类变种为 Exo+ Nod+ Fix+ [ 11 ]。本
文克隆的 R. huakuii 107的 exoA基因可互补 Exo-
Nod+ Fix* 变种使之恢复为 Exo+ Nod+ Fix+ 。 R.
huakuii Exo-变种在宿主紫云英上有 Ndv- Fix- ,
Nod
+
Fix
- , Nod
+
Fix
* , Nod
-四种表型 , 据目前国
际研究现状 , 这种现象只有紫云英共生体存在。因
此研究紫云英根瘤菌胞外多糖有着非常重要的意
义。
参 考 文 献
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3　龙北国 , 华　征 ,郭一松 , 宋鸿遇 ( Long B G, Hua Z, Guo Y S,
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323第 4期 宫　锋等: 紫云英根瘤菌糖基转移酶基因 exoA的克隆及序列分析
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4　黄建斌 ,王江海 , 华　征 ,宋鸿遇 ( Huang J B, Wang J H, Hua
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Cloning and Sequencing of Rhizobium huakuii exoA
Gene Encoding a Glucosyl-transferase
GONG Feng , SU Wen-Ying, ZHOU Bei-Yun and SON G Hong-Yu*
( Insti tute of Plan t Physiology, the Ch inese Acad emy of Sciences, Shangha i 200032, China )
ABSTRACT　　 From exoR′-11 which could complement tw o Exo- mutants of R.huakuii 107: N A03 and
N A10, a 2. 0 kb Bgl I f ragment w as subcloned in pRK415. The resul ted plasmid pJB-H701 could resto re
the Exo
-
phenotype of N A03 and N A10. The complete nucleo tide sequence of the f ragment w as deter-
mined, w hich contains the st ructural g enes o f a glucosy l-t ransferase, as well as the 5′-and 3′-f lanking re-
gions. An open reading frame of 984 base pairs was identified as R. huakui i exoA gene. The MW of ExoA,
as deduced from the nucleo tide sequence, w as estima ted as 35 kD. Comparison of the nucleo tide sequences
revealed a high simi lari ty betw een exoA genes of R. huakuii and R. meliloti . The deduced amino acid se-
quence of R. huakuii Exo A also show ed a high simila ri ty wi th that of R. meliloti Exo A. Furthermo re, the
exoA-lacZ transcription fusion gene w as const ructed and the expression of exoA-lacZ was analy zed.
KEY WORDS　　Rhizobium huakuii ; g lucosyl-t ransferase gene; EPS; DN A sequence; gene fusion
Receiv ed: October 14, 1997　　 Accepted: December 18, 1997
* Corresponding auth or: Tel, 0086-21-64042090- 2292; Fax, 0086-21-64042385
324 　　生 物 化 学 与 生 物 物 理 学 报 第 30卷