全 文 ：华中农业大学学报
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13 ( l )
:l 一 8 , 19 9 月
A g 甲己c “ l艺脱 护口 l 厂, n 之护、 户 r战一歹
外源共生质粒 p BJ SJ I 导入紫云英根瘤菌
( R 瓜之ob 椒 nI h 。 。 无。 瓦 ) 中的稳定性 `
张学贤 周俊初 李阜棣
(华中农业 大学土化 系 , 武汉 4 3 0 0 7 0)
摘要 将碗豆根瘤菌共生质粒 p -BJ SJ I 导入紫云英根瘤菌 76 5 3 R 及其消除了共生质粒的
突变株 7 6 5 3 R + l 。 两种类型转移接合子在人工合成培养基上繁殖时 , p-BJ SJ I 能稳定存在 , 但
从它们在碗豆或紫云英上所结根瘤的分离物中 , 只有部分检测到 p J’B 5 IJ 。 以转座子 T n s 及首
蓓根瘤菌 n o d 基因为探针 , 对未检测 到 p J B SJ I 质粒的根瘤分离物 7 6 5 3 R A 9 及 7 6 5 3 R + I P a ,
进行 D N A 同源性分析 , 结果表明 pBJ S IJ 质粒并没 有全部丢失 , 很可能全部或部分整合到 了
受体紫云英根瘤菌的染色体中 。
关键词 紫云英根瘤菌 , 质粒稳定性 , 质粒 p BJ SJ I
中图法分类号 Q 9 39 . 1峨
在绝大多数快生型根瘤菌中 ,与共生固氮有关的基因都定位在质粒上 ,该质粒称共生
质粒 。 共生质粒在异源背景中的行为分析是研究共生质粒功能的一种重要手段 。 随着共
生质粒转移工作的普遍开展 ,许多研究者对共生质粒在异源背景中的稳定性进行了研究 。
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e vi C 等川将碗豆根瘤菌共生质粒 PJ B SJ I 导入三叶草根瘤菌 , 发现宿主植物能影响
PJ B SJ I 的稳定性 ,部分根瘤分离物 由于 p BJ S IJ 上缺失了 30 M D 的 D N A 区段而不能在碗
豆上结瘤 。 e h r is t e n 和 s e h u b e r t 仁2习将 p J B S J I 导入三叶草根瘤菌 T 3 7 菌株 ,得到三种类型
的转移接合子 , 它们在质粒图谱及共生表型上均存在较大差异 。 他们分析了 80 个转移接
合子在三叶草上所结的根瘤 ,发现其中 30 个根瘤的分离物丧 失了 PJ B SIJ 所具有的卡那
霉素抗性 。 王常霖等川将 p BJ SJ I 导人三叶草根瘤菌中 ,然后比较了 3 种不同三叶草品种
对 p J B SJ I 稳定性的影响 ,结果表明外源共生质粒的稳定性与植物品种也有一定的关系 。
紫云英根瘤菌 (R h ` : 。 b ` 。 m h 。 。 k 。 ` ; )是近年来才新定名的快生型根瘤菌川 。 为了增进
对其遗传特性的认识 , 我们将 p BJ SJ I 导入到 R . h 。 。 k 。 “ 野生型菌株 7 6 5 3 R 及其消除了共
生质粒的突变株 7 6 5 3R + 1 ,并对共生质粒间相互作用川的情况进行了初步研究 。 本文重
本文 1 9 9 3 一 。月一 24 收到
, 国家 “ 8 6 3 ” 高科技课题
第一作者 : 张学贤 , 男 , 1 9 6 6 年生 ,博士 。 工作单位 : 华中农业大学土化系 , 武汉 4 3 0 7 0
2 华中农业大学学报 第 13 卷
点报道 p J B SJ I 在 几 . 人。 。 无。 : :7 6 5 3R 及 7 6 5 3R + l 中的稳定性 。
1 材料与方法
1
.
1 细菌菌株与培养条件
实验 中所使用的细菌菌株与质粒见表 1 。 根瘤菌培养基采用 TY 困与 Y M A 困 ,质粒检
测时用 P A 川 。 大肠杆菌培养基采用 L B困 。 培养温度 :根瘤菌 28 C ,大肠杆菌 37 C 。 抗生
素使用浓度 : 四环素 ( T C ) 2 0 件g · m l 一 ` ,链霉素 ( s t r ) 3 0 0 林 g · m l 一 ` ,卡那霉素 ( K m ) 5 0 尽 g ·
m l一 l 。
表 l 供试细菌菌株与质粒
T a b l e 1 B a e一e r i a s l r a i n s a n d P l a s m i d s u s e d i n t h i s s t u d y
菌 株与质粒
5 t r a i n s a n d P l a s m i d s
有关性状 来源
R e l e v a n t e h a r a e t e r i s t i e s S
O U r C e S
紫云英根瘤菌 五 . 几。 。 、 。 `。
7 6 5 3 R
7 6 5 3 R + 1
7 6 5 3R ( p J B S J I )
7 6 5 3R + l ( p J B S J I )
7 6 5 3A 9
7 6 5 3R + I P a
5 t o r e i n O U r L a b
。
5 t o l e i fl O U r L a b
.
刁曰ǐ J习ō |月亡dùó口5厂.Lfes|L
野生型 N 。 d + , F : x +
7 6 5 3 R 消除共 生质粒突变株 , N od -
K m
r
K m 了
76 53 R ( p J B SJ )I 在紫 云英上所结根瘤的分离物
7 6 5 3 R + l ( p J B S川 在碗豆上所结根瘤的分离物
碗豆根瘤菌
R
·
l尸9 . 仍 乙几 。胡 r . m b v . 不’ 乞e e a e
T 8 3 K 3 含共 生质粒 p J B S J I , N o d + , F sx + 仁5 ]
根癌农杆菌
A 夕沪 o b a c乙e r 毛u 切 t u m ef a c书日几 s
G M I9 02 3
G M I9 02 3 ( p J B S J I )
s t r 『 、 r , f 『无质粒菌株
5 t r
『 、 r i f r
、
K m r T h
l s s u t d y
质粒 p l a s m l d
月ǐ iJ二曰户nrLes
P J B S J I
p R m S L 2 6
P K a n Z
碗豆根瘤菌共生质粒 ,含 T n s
载体 p L A F R I 上克隆有首蓓根瘤菌的结瘤基因 ,
其 中 5 . 7 K b E e o R I 片段含 n o d n A B亡
载体 p B R 3 2 2 上克 隆有 T n s 的
3
.
5 K b 的 H i n d 一 片段 5 t o r e i n o u r L a b .
1
.
2 D N A 操作技术
根瘤 菌大质粒 的快速检测采用修改 的 E ck h ar dt 方法川 。 大肠杆菌质粒的提取及
S o u t h e r n 杂交参考文献 [ 8」进行 。
本研究中所使用的探针有 T n s 探针及 on d 探针 。 T n s 探针采用质粒 p K an Z 中 .3 5 k b
2 华中农业大学学报 第 1 3卷
点报道 p J BS J I 在 几 . 人。 。 无。 : : 7 6 3 5R 及 7 6 3 5R + l 中的稳定性 。
1 材料与方法
1
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1 细菌菌株与培养条件
实验 中所使用的细菌菌株与质粒见表 1 。 根瘤菌培养基采用 T Y 困与 Y M A困 ,质粒检
测时用 P A 川 。 大肠杆菌培养基采用 L B困 。 培养温度 :根瘤菌 28 C ,大肠杆菌 37 C 。 抗生
素使用浓度 : 四环素 ( T C ) 2 0 件g · m l 一 ` ,链霉素 ( s t r ) 3 0 0 林 g · m l 一 ` ,卡那霉素 ( K m ) 5 0 尽 g ·
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表 l 供试细菌菌株与质粒
T a b l e 1 B a e一e r i a s l r a i n s a n d P l a s m i d s u s e d i n t h i s s t u d y
菌 株与质粒
5 t r a i n s a n d P l a s m i d s
有关性状 来源
R e l e v a n t e h a r a e t e r i s t i e s S
O U r C e S
紫云英根瘤菌 五 . 几。 。 、 。 `。
7 6 5 3 R
7 6 5 3 R + 1
7 6 5 3R ( p J B S J I )
7 6 5 3R + l ( p J B S J I )
7 6 5 3A 9
7 6 5 3R + I P a
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野生型 N 。 d + , F : x +
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76 53 R ( p J B SJ )I 在紫 云英上所结根瘤的分离物
7 6 5 3 R + l ( p J B S川 在碗豆上所结根瘤的分离物
碗豆根瘤菌
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根癌农杆菌
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s t r 『 、 r , f 『无质粒菌株
5 t r
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质粒 p l a s m l d
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P K a n Z
碗豆根瘤菌共生质粒 ,含 T n s
载体 p L A F R I 上克隆有首蓓根瘤菌的结瘤基因 ,
其 中 5 . 7 K b E e o R I 片段含 n o d n A B亡
载体 p B R 3 2 2 上克 隆有 T n s 的
3
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5 K b 的 H i n d 一 片段 5 t o r e i n o u r L a b .
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2 D N A 操作技术
根瘤 菌大质粒 的快速检测采用修改 的 E ck h ar dt 方法川 。 大肠杆菌质粒的提取及
S o u t h e r n 杂交参考文献 [ 8」进行 。
本研究中所使用的探针有 T n s 探针及 on d 探针 。 T n s 探针采用质粒 p K an Z 中 .3 5 k b
2 华中农业大学学报 第 1 3卷
点报道 pJB S J I在 几 .人。 。 无。 : : 7 6 5 3R 及 7 6 5 3R + l 中的稳定性 。
1 材料与方法
1
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1 细菌菌株与培养条件
实验 中所使用的细菌菌株与质粒见表 1 。 根瘤菌培养基采用 T Y 困与 Y MA 困 ,质粒检
测时用 P A 川 。 大肠杆菌培养基采用 L B困 。 培养温度 :根瘤菌 28 C ,大肠杆菌 37 C 。 抗生
素使用浓度 : 四环素 ( T C ) 2 0 件g · m l 一 ` ,链霉素 ( s t r ) 3 0 0 林 g · m l 一 ` ,卡那霉素 ( K m ) 5 0 尽 g ·
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表 l 供试细菌菌株与质粒
T a b l e 1 B a e一e r i a s l r a i n s a n d P l a s m i d s u s e d i n t h i s s t u d y
菌 株与质粒
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有关性状 来源
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紫云英根瘤菌 五 . 几。 。 、 。 `。
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7 6 5 3 R + 1
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76 53 R ( p J B SJ )I 在紫 云英上所结根瘤的分离物
7 6 5 3 R + l ( p J B S川 在碗豆上所结根瘤的分离物
碗豆根瘤菌
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2 D N A 操作技术
根瘤 菌大质粒 的快速检测采用修改 的 E ck h ar dt 方法川 。 大肠杆菌质粒的提取及
S o u t h e r n 杂交参考文献 [ 8」进行 。
本研究中所使用的探针有 T n s 探针及 on d 探针 。 T n s 探针采用质粒 p K an Z 中 .3 5 k b
2华中农业大学学报 第 1 3卷
点报道 p J B S J I 在 几 . 人。 。 无。 : : 7 6 5 3R 及 7 6 5 3R + l 中的稳定性 。
1 材料与方法
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1 细菌菌株与培养条件
实验 中所使用的细菌菌株与质粒见表 1 。 根瘤菌培养基采用 T Y困与 Y MA困 ,质粒检
测时用 P A 川 。 大肠杆菌培养基采用 L B困 。 培养温度 :根瘤菌 28 C ,大肠杆菌 37 C 。 抗生
素使用浓度 : 四环素 ( T C ) 2 0 件g · m l 一 ` ,链霉素 ( s t r ) 3 0 0 林 g · m l 一 ` ,卡那霉素 ( K m ) 5 0 尽 g ·
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表 l 供试细菌菌株与质粒
T a b l e 1 B a e一e r i a s l r a i n s a n d P l a s m i d s u s e d i n t h i s s t u d y
菌 株与质粒
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有关性状 来源
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紫云英根瘤菌 五 . 几。 。 、 。 `。
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7 6 5 3 R + 1
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7 6 5 3 R + l ( p J B S川 在碗豆上所结根瘤的分离物
碗豆根瘤菌
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T 8 3 K 3 含共 生质粒 p J B S J I , N o d + , F sx + 仁5 ]
根癌农杆菌
A 夕沪 o b a c乙e r 毛u 切 t u m ef a c书日几 s
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根瘤 菌大质粒 的快速检测采用修改 的 E ck h ar dt 方法川 。 大肠杆菌质粒的提取及
S o u t h e r n 杂交参考文献 [ 8」进行 。
本研究中所使用的探针有 T n s 探针及 on d 探针 。 T n s 探针采用质粒 p K an Z 中 .3 5 k b
2 华中农业大学学报 第 31 卷
点报道 p JB S JI在 几 . 人。 。 无。 : : 7 6 5 3R 及 7 6 5 3R + l 中的稳定性 。
1 材料与方法
1
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1 细菌菌株与培养条件
实验 中所使用的细菌菌株与质粒见表 1。 根瘤菌培养基采用 T Y 困与 Y MA 困 ,质粒检
测时用 P A 川 。 大肠杆菌培养基采用 L B困 。 培养温度 :根瘤菌 28 C ,大肠杆菌 37 C 。 抗生
素使用浓度 : 四环素 ( T C ) 2 0 件g · m l 一 ` ,链霉素 ( s t r ) 3 0 0 林 g · m l 一 ` ,卡那霉素 ( K m ) 5 0 尽 g ·
m l一 l 。
表 l 供试细菌菌株与质粒
T a b l e 1 B a e一e r i a s l r a i n s a n d P l a s m i d s u s e d i n t h i s s t u d y
菌 株与质粒
5 t r a i n s a n d P l a s m i d s
有关性状 来源
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紫云英根瘤菌 五 . 几。 。 、 。 `。
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野生型 N 。 d + , F : x +
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76 53 R ( p J B SJ )I 在紫 云英上所结根瘤的分离物
7 6 5 3 R + l ( p J B S川 在碗豆上所结根瘤的分离物
碗豆根瘤菌
R
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l尸9 . 仍 乙几 。胡 r . m b v . 不’ 乞e e a e
T 8 3 K 3 含共 生质粒 p J B S J I , N o d + , F sx + 仁5 ]
根癌农杆菌
A 夕沪 o b a c乙e r 毛u 切 t u m ef a c书日几 s
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质粒 p l a s m l d
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碗豆根瘤菌共生质粒 ,含 T n s
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其 中 5 . 7 K b E e o R I 片段含 n o d n A B亡
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5 K b 的 H i n d 一 片段 5 t o r e i n o u r L a b .
1
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2 D N A 操作技术
根瘤 菌大质粒 的快速检测采用修改 的 E ck h ar dt 方法川 。 大肠杆菌质粒的提取及
S o u t h e r n 杂交参考文献 [ 8」进行 。
本研究中所使用的探针有 T n s 探针及 on d 探针 。 T n s 探针采用质粒 p K an Z 中 .3 5 k b
第 1期 张学贤等 :外源共生质粒 p JB J SI 导入紫云英根瘤菌中的稳定性
现杂交带 ,而作为对照的受体菌 76 53 R + 1 无杂交带 ( 图 6 ) , 这一结果表 明 T sn 没有从
PJ B SJ I 上转移到基因组的其它位置 。
总之 , 上述 T sn 探 针及 on d 基因探针杂交分析的结果 初步证明 , 在检测不到质粒
p J Bt IJ 的根瘤分离物中 , p J B S IJ 并没有全部丢失 , 而是全部或部分整合到了受体紫云英
根瘤菌的染色体 中 。
3 讨 论
一些研究报告 〔`一 3 〕指出 ,宿主植物会影响非互接种族根瘤菌共生质粒的稳定性 。 即功
能不相容性 ( f u n C t i o n a l i n 。 。 m p a t i b il i t y ) , 其主要表现为外源共生质粒的丢失或共生基因
区段的部分缺失 。 本研究发现豌豆根瘤菌的共生质粒 PJ B SJ I 在两种紫云英根瘤菌的转移
接合子 中经人工培养基上繁殖时能稳定存在 , 但它们在紫云英或豌豆上所结根瘤的分离
物中 , 只有部分检测到 p BJ S IJ 。 本研究结果表明 p J B S IJ 的正常和非正常宿主植物都能影
响 p J B S IJ 在紫云英根瘤菌中的稳定性 。 经过 D N A 同源性分析初步证明这种不稳定性表
现在 PJ B SJ I 全部或部分整合到染色体上去了 。 本研究结果还表明紫云英根瘤菌具有某些
与其它快生型根瘤菌不同的遗传特性 ,至于宿主植物是怎样影响外源共生质粒的稳定性 ,
以及 PJ B S IJ 在染色体上整合的方式及部位尚需进一步深入研究 。
参 考 文 献
D Jo r d j e v i e M A
,
Z u r k o w s k i W
,
R o l f e B G
.
P l a s m i d s a n d s t a b i l i t y o f s y m b io t i e P r o P e r t i e s o f R 无乙之 。 b 之. 价 艺r 乙f o l l卜 J ·
B a e t e r i o l
.
1 9 8 2
,
1 5 1 : 5 6 0 ~ 5 6 8
C h r i s t e n s e n A H
,
S e h u b e r t K R
.
Id e n r i f i e a t i o n o f a R h ` 之o b艺“ m t r 汀0 1书乙 P l a s m i d e o d i n g f o r n i t r o g e n f i x a r i o n g e n e s
a n d l t s j n t e r a e r i o n w i t h P J B S J I
,
a R h 乞之 o b 志. 爪 l e 夕 u 网 2 0 砚胡 了“ m P l a s m id . J . B a e t e r i o l . 19 8 3 , 1 5 6 : 59 2 一 59 9
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.
B e r i n g e r J E H i r s e h P R
.
H o s t P l a n r e f f e e t s i n h y b r id s o f R h 艺z o b ` . 扔 l e 夕“ 价 i 介。 犯 了“ m b io v a r 进,乞e e a e a n d
艺r 艺f o l艺卜 J . G e n
.
M i e r
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,
19 8 6
.
1 3 2 : 2 0 6 3一 2 0 7 0
C h e n w X
,
L i G 5
.
Q i Y L
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.
J
.
S y s t
.
B a e t e r i o l
,
19 9 1
.
4 1 : 2 7 5一 2 8 0
张忠 明 , 陈华癸 , 李阜棣等 . 紫云英根瘤菌基因文库的构建及含完整结瘤基因的重组质粒 p R a lz s 的分离 . 生物工
程学报 . 19 9 一 7 ( 3 ) : 2 13一 2 19
张学贤 . 周俊初 . 张忠 明等 . 紫云英根瘤菌与豌 豆根瘤菌共生质粒间 的相互 作用 . 华中农业大学学 报 . 19 9 2 , 1
( 2 ) : 17 5一 1 8 1
王常霖 , 赫茨 . 转座子 T sn 一m ob 对菜豆根瘤菌共生基因的诱变 、 转移和初步定位 . 遗传学报 . 198 8 . 15( 1 ) : 25 一 3
M a n i a r i s T
.
F r i r
一
c h E F
,
S a m b r o o k J
.
M
o l e e u l a r e l o n 一n g : a l a b o r a t o r y m a n u a l
.
N e w Y o r k : C o l d S P r 一n g H a r b o r
L a b o r a t o r y
.
1 9 8 2
.
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8 华中农业大学学报 第 3 1卷
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p 一a s m ld 一 e u r e d i n n o d m u t a n t s t r a i n 7 6 5 3 R + 1 . T h e a l i e n p l a s m i d p J B S J I i n b o t h k i n d s o f
t r a n s e o n j u g a n t s r e m a i n e d s t a b l e d u r i n g f r e q u e n t t r a n s f e r o n e u l t u r a l m e d i a
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T h e s e r e s u lt s i n d i e a t e d t h a t t h e h o s t P l a n t a l s o e x e r t e d a n i n f l u e n e e
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