全 文 ：拼 考 遨 粗
第 0 4卷 第 巧期 CH I E NE SC SI E NCE U BL L E T I Nl男 5年 8 月
紫云英根瘤菌 no d D 基因的克隆及核
昔酸序列
沈思师 金润之
(中国科学院上海植物生理研究所 , 上海 加田3 2 )
关键词 紫云英根瘤菌 脚口基因克隆 彼砚刀核普酸序列
豆科植物紫云英 ( sA t ar ga lus 、 in cu 、 )是生长于我国南方地区的重要绿肥 之一 紫云英根
瘤菌 ( R h iz ob iu , hu o ku i 即 R . as t ar g al o是革蓝氏阴性细菌 , 感染豆科植物紫云英后形成有效
的固氮根瘤 .
决定根瘤菌在宿主植物引起根瘤的基因称结瘤基因 ( on d 和 on l基因 ) , on d 和 on l 基因的
诱变将导致根瘤菌不能或延迟在 宿主植物上结瘤 . 这些基 因包括共 同结瘤基因 on dA B C,
on d I J
. 宿主专一性结瘤基因 ( hs )n on d E只 on d G, no dH
,
on dQ等及 与结 瘤有关的一些 on l 基
因 . 所有这些基 因的表达受结瘤调节基因 。 d D 的正控制 . on dD 的产物 N o d D 蛋 白在植物
信号分子黄酮类物质的存在下专一性的结合于 on d 基因启动子 区的保守性序列 (结瘤 盒 on d
bo x) 而激活结瘤基 因 1[, 2] .
我们以 ’争标记的 Rm on dD AB C D N A 作探针从紫云英根瘤菌 159 基因文库中分离到 与
R m n掀 D A B C 同源 的克隆并测定 了 on dD 基因及 on d b o x 的核昔 酸序列 . 我们 的实验还表
明紫云英根瘤菌 159 中存在有 2个拷贝的 on dD 基因 .
1 材料和方法
L l 菌株和质粒
紫云英根瘤菌 159 是野生型菌株 . 大肠杆菌 E co il JM 101 , 载体 M 13m p l s , M 13m p gl 购
自Ne w E n g la dn iB 。 饭bs
.
p R m 31 是带完整的 R m no dD BA C 的重组质粒
.
p R mS L 42 是带完整的 R m no dA B 及部分的 no d C , no dD 基因的重组质粒 .
L Z 酶和试剂
限制性 内切酶 及 .-T D N A 连接酶购 自华 美生 物 公 司
.
D N A 测 序试 剂 盒 购 自美 国
P r o me g
a 公司 .
1 3 D N A 制备
质粒 D N A 的制备按 M a in at is 等人 3[] 的方法 进行 , 紫云英 根瘤菌总 D N A 的制备按
W l ls o n 阅 的方法进行 .
L 4 杂交试验
S o ut he m 转移 、 缺 口 翻译 、 D N A 杂交按 M a正at is 等人的方法进行 二 探针 D N A 用 : 一午
d A作 标记 , 其放射性的强度为 7 x l0 7 in/ i n · 陀 .
1哭川一 1 1一 2 收稿 , 1卯 5 一 0 3一 24 收修改稿
14 1 0科 学 通 报 第 4 0卷
L D SN A 序列测定
将各酶解片段分别克隆到 M l皿p s l及 M 13 mp g l载体 , 按 M an iat is 等人的方法转染挑取
白噬菌斑 , 纯化后制备单链 D N A , 以 A BI 公司出品的 307 A D N A 分析仪测定核昔酸序列 .
2 结果和讨论
2
.
1 紫云英根瘤菌 159 结瘤基因克隆的分离
我们以 ’争 标记 的 2 . 3 k b R m n o dD月B C D N (A 来源于质粒 PR mS 4L 2 的 B a m妇 l一 H idn l l l的酶解物 , 含部分 on dD , 全部 no dA B 及部分 no d o 作探针 , 经原位杂交从紫云英根瘤菌 159 基
因文库中分离到 1株与探针 D N A 有阳性反应的克隆 p R a N 10 8 . 进一步的分子滤膜杂交表
明 P R a N 10 8 D N A 的 E c o R I 酶解物 (含 9 , 14 , 6 k b 3 个片段 )中的 9 k b 能与探针 D N A 杂
交 . 为便于分析将 上述 能 与探针 D N A 杂 交 的 9 k b 片段 经 升D N A 连 接酶 的 作 用 连 接
到 p B R 32 5构建成重组质粒 p S J l l2 . 经多种限制性 内切酶作用制作 了 p S J l lZ D N A 酶 切 图
谱 (图 l ) . 从 p S J l l Z D N A 分离 g k b cE o R I 片段分别 以 p s J I 和 S a l 等限制性 内切酶作用 ,
电泳后将 D N A 带转移到硝酸纤维素滤膜上 , 然后分别 以 0 . 24 k b R m no dD D N A (来于质粒
p SnIS L 4 2 的 B班 I一 B a m H I 酶解物含部分 n o dD )及 2 . 8 k b R m n o dA B C D N (A 来于质粒 p R m 3 1的 C al l 一 S a d 酶解物含部分 no dA 及全部 no dB O 作探针进行滤膜杂交 , 放射性 自显影结果 (图
2 )表明以 2 . 8 k b R m n o dA B C D N A 作探针能分别与 9 k b E e o R I 片段的 P s t l 酶解物 ( 6 . 0 , 2 . 0 ,
0
.
9 k b )中的 2 . 0 , 0 . 9 及 9 k b E e o R I 片段 的 s a l l 酶解物 ( 0 . 55 , 1 . 2 , 1 . 1 , 2 . 8 , l , 8 , l . 4 k b ) 中的
1
.
8
,
1
.
4 k b 杂交 . 以 o . 24 k b R m no dD D N A 作探针能分别 与上述酶解物中的 .2 o k b sP lt 片
段及 1 . 8 k b S a且片段杂交 . 上述滤膜杂交结果表 明紫云英根瘤 菌 159 中的 g k b E co R I 片段
携带了与 R m no dD AB C 同源的片段 .
卜 - 目-
,
-
一一 卜~ ~ ~ -一一叫 一一-一一 刊 ~ 一一一刊
0() bP H S a
H H e K
— /n 超心D /
K / / s s P
p s j l 12— .口2 2 又2 】二2 二乙2 2 二Z 又 二二二2 口口二乙 2 2 二2 二二 2 2 2 口 「2 二二 2 二艺二二之匀图 1 PS J l lZ 的限制性酶解图谱及 n 诫D 基因序列测定示意图~ 表示测序片段的长度及读序方向 , 〔 二二〕 表示 朋d D 基因 的编码区滩田五刃表示 与 R m 摊诫D 及 R m 。耐A B C 探针杂交的片段 , E 为 E co R I , H e 为拓nlC l , H 为托 r ld l l l , K 为 KP nl , P 为 R t l , S a 为 S喊 , S 为 S al l.2 2 紫云英根瘤菌 159 n如毋基因和 n记 bo x 的核昔酸序列如图 1所示 , 将各酶切片段分别克隆到 M 1m3 p ls 及 M l皿p lg 载体上进行 D N A 序列测定 . 图 3即是紫云英根瘤菌 159 on dD 基因的核昔酸序列 . 共测定的序列约 1 2 7 0 b p . 包括从起始密码 A T G ( 2 35 位 ) 到终止 密码 T A G ( 1 1 70 位 ) 的完整的 on dD 基 因编码区及 on d bo x 的