全 文 ：槟榔花中酚类物质对HSF细胞氧化损伤的
保护作用
宋菲1，王齐齐2，王挥1，黄玉林1，陈卫军1，赵松林1
（1.中国热带农业科学院椰子研究所，海南文昌 571339；2.海南大学食品学院，海南海口 570228）
摘 要：为了探讨槟榔花中 3种主要酚类物质（表儿茶素、没食子酸、香豆酸）对人皮肤成纤维细胞（HSF）氧化损伤的
保护作用，以 H2O2（150 μmol/L）处理 HSF细胞 24 h，建立氧化损伤模型，MTT法测定细胞存活率，分光光度法检测细
胞内总抗氧化能力和线粒体膜肿胀度，DCFH-DA染色法测定细胞内活性氧的含量。结果表明表儿茶素和没食子酸
均能改善 H2O2引起的 HSF细胞的氧化损伤，而香豆酸却没有保护作用。与 H2O2模型组相比，表儿茶素和没食子酸均
能提高氧化损伤细胞的存活率，并将细胞内总抗氧化能力提高了 4.73 %～31.66 %，细胞内活性氧和线粒体膜肿胀度
也明显降低。表明槟榔花中 2种主要的酚类物质表儿茶素和没食子酸对 HSF细胞氧化损伤具有保护作用。
关键词：槟榔花；酚类物质；HSF细胞；氧化损伤
Protective Effects of Phenolic Compounds in Areca Inflorescence on Oxidative Damage in HSF Cells
SONG Fei1，WANG Qi-qi2，WANG Hui1，HUANG Yu-lin1，CHEN Wei-jun1，ZHAO Song-lin1
（1. Coconut Research Institute，Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences，Wenchang 571339，
Hainan，China；2. College of Food，Hainan University，Haikou 570228，Hainan，China）
Abstract：In order to understand the protective effects of 3 kinds of phenolic compounds （epicatechin， gallic
acid， coumaric acid） in Areca inflorescence on oxidative damage in human skin fibroblasts cells （HSF）， HSF
cells were treated with 150 μmol/L H2O2 for 24 h and the oxidative damage model was established. Cell viability
was measured by MTT method， the total antioxidant capacity and mitochondria membrane swelling degree were
detected by spectrophotometry， intracellular reactive oxygen species （ROS）accumulation was measured by
DCFH-DA staining method. The results showed that epicatechin and gallic acid could improve the oxidative
damage on HSF cells induced by H2O2， whereas coumaric acid had no protective effect. Compared with the H2O2
model group， epicatechin and gallic acid can improve the survival rate of HSF cells， the total antioxidant
capacity was increased by 4.73 % -31.66 % ， intracellular reactive oxygen species and the mitochondrial
swelling decreased. As a results， the two main kinds of phenolic compounds （epicatechin and gallic acid ） in
Areca inflorescence have protective effects on oxidative damage in HSF cells.
Key words：Areca inflorescence； phenolic compounds； HSF cells； oxidative damage
食品研究与开发
Food Research And Development
2015年 12月
第 36卷第 23期
DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.23.003
基金项目：海南省自然科学基金（314146）
作者简介：宋菲（1986—），女（汉），助理研究员，硕士，研究方向：食
品中功能性成分的活性评价及产品开发。
槟榔（Areca catechu L.）为棕榈科槟榔属常绿乔
木，主要分布在中非和东南亚[1]，在我国主要分布在海
南、台湾等地。槟榔花为槟榔的雄花蕾，是槟榔的主要
副产物，在每年 3～8月份产花，开花多、花期长。槟榔
花含有多酚、多糖、生物碱等多种生理活性物质以及
对人体有益的微量元素，具有独特的食疗和保健功
效 [2-3]，以“微型营养品”和“长寿食品”著称。在海南常
用来做保健食品的原料，广受人们的喜爱。
目前对槟榔花提取物活性成分的研究主要集中
在多酚类物质。我们前期研究发现槟榔花提取物含有
多种酚类物质，包括没食子酸、香豆酸、表儿茶素、阿魏
酸、芦丁和柚皮素等[4]，但含量各不相同，而且酚类物
质的提取率受提取溶剂及提取方法的影响。研究还发
基础研究
10
现槟榔花多酚具有较强的抗氧化性及清除自由基的
能力[5-7]。本文选取槟榔花中含量相对较高的 3中酚类
物质，研究其对人皮肤成纤维细胞 HSF氧化损伤的保
护作用，进一步明确槟榔花多酚类物质的抗氧化作
用，以期为槟榔花功能产品的开发提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
表儿茶素、没食子酸、香豆酸、MTT、二甲基亚枫
（DMSO）、DCFH-DA：美国 sigma 公司；人皮肤成纤维
细胞 HSF：中国科学院细胞库提供；细胞总抗氧化能
力（T-AOC）测定试剂盒：南京建成生物工程研究所；
DMEM培养基、胰酶（Trypsin）：美国 Gibco公司；胎牛
血清（FBS）：杭州四季青生物工程材料有限公司；其他
均为 AR级试剂。
1.2 主要仪器
Thermo scientific varioskan ascent FL荧光测读仪；
WJ-185I CO2培养箱；leica倒置显微镜；TDZ4-WS离心
机；ZHJH-1109B超净工作台等。
1.3 试验方法
1.3.1 细胞氧化损伤模型的建立
HSF细胞培养于含 10 %胎牛血清的 DMEM高糖
培养基中，培养条件为 5 %CO2，温度 37℃，饱和湿度。
当细胞处于对数生长期时，用 0.25 %胰酶消化后用吸
管吹打成单细胞悬液，以 1.5×104个/mL的密度接种于
96孔板中，过夜培养后，加入含 H2O2的培养基，孔内
H2O2终浓度为 50、100、150、200 μmol/L，作用 24 h后，
检测细胞存活率。本实验中每组设置 6个平行复孔，
不含 H2O2的为正常对照组，以正常对照组的细胞存活
率为 100 %，选取致死率接近 50 %的 H2O2浓度作为氧
化损伤模型的浓度。
1.3.2 酚类物质对 HSF细胞氧化损伤的保护作用
试验分为正常对照组、H2O2模型组、酚类物质（表
儿茶素、没食子酸、香豆酸）保护组。正常对照组不做
任何处理，H2O2模型组用含终浓度 150 μmol/L H2O2
的培养基培养 24 h，酚类物质保护组用含终浓度为
150 μmol/L H2O2和不同浓度酚类物质的培养基培养
24 h。根据预实验结果，表儿茶素的作用浓度确定为
0.1、1、10 μg/mL，没食子酸和香豆酸的作用浓度为 2、
10、50 μg/mL。
1.3.3 细胞存活率的测定
细胞存活率的测定采用 MTT法[8]。96孔板中分组
处理的细胞结束培养后，加入 5 mg/mL的 MTT 20 μL，
37℃孵育 4h，吸除上清液，加 150μLDMSO，振荡 10min，
使结晶物充分融解，550nm波长下测定各孔吸光度（A）。
细胞存活率/%=[（试验孔 A-空白 A）/（正常对照
孔 A-空白 A）]×100
1.3.4 细胞总抗氧化能力的测定
细胞总抗氧化能力的测定采用南京建成试剂盒。
具体操作步骤按照说明书进行。
细胞总抗氧化能力（U/mg）= ODu-ODc0.01 ÷30×N÷C
式中：ODu为测定管吸光度值；ODc 为对照管吸
光度值；N为反应体系稀释倍数（反应液总体系/取样
量）；C为待测样本蛋白浓度，mg/mL。
相对总抗氧化能力/%= 试验组总抗氧化能力
正常对照组总抗氧化能力
×100
1.3.5 细胞内活性氧（ROS）的测定
细胞内活性氧的测定采用荧光染料 DCFH-DA染
色，荧光测读仪测定[9-10]。细胞悬液以 3×105个/mL接种
于 6孔板中，毎孔 2 mL，按 1.3.2所述方法进行分组处
理和培养，收集处理后的细胞，加入终浓度为 10 μmol/L
的 DCFH-DA 1 mL，37℃避光孵育 15 min，荧光测读仪
检测荧光强度，激发光波长为 485 nm，发射光波长为
525 nm。
1.3.6 线粒体膜肿胀度测定
收集分组处理后的细胞，12 000 r/min离心 5 min，
放入冰箱中反复冻融 3次。考马斯亮蓝染色法测定线
粒体蛋白浓度，取 50 μg蛋白加入到总体积为 200 μL
的反应缓冲液中（250 mmol/L蔗糖、5 mmol/L KH2P04、
3 mmol/L琥珀酸钠，pH 7.2），混匀后记录 520 nm处吸
光度值，测定过程保持 25℃恒温[11-12]。
1.3.7 统计学方法
所有数据均来自于 3次以上独立试验结果，试验
数据以均值±标准偏差表示。使用 Students t-test比较
两组间差异，P＜0.05代表统计学上具有显著性差异，
P<0.01代表统计学上具有高度显著性差异。
2 结果与分析
2.1 H2O2对细胞的氧化损伤作用
H2O2是一种重要的活性氧，具有良好的细胞膜渗
透性，可以轻易的进入细胞内部，引起脂质过氧化、
DNA损伤等，从而对细胞产生毒作用 [13]。为了建立
H2O2对 HSF细胞的氧化损伤模型，采用不同浓度的
H2O2（终浓度为 0、50、100、150、200 μmol/L）处理 HSF
细胞 24 h，细胞存活率的结果见图 1。
随着 H2O2浓度的增大，细胞存活率逐渐减低，且
呈浓度依赖性。浓度范围在 100 μmol/L～200 μmol/L
宋菲，等：槟榔花中酚类物质对HSF细胞氧化损伤的保护作用基础研究
11
注：**P<0.01，与 H2O2模型组相比。
时，H2O2对 HSF细胞产生显著的毒性作用（P<0.01）。
150 μmol/L H2O2作用 24 h 后，HSF 细胞死亡率达到
50.62 %，故选择此浓度建立模型。
2.2 酚类物质对氧化损伤的 HSF细胞的保护作用
HSF细胞在 H2O2损伤 24 h后，在槟榔花中 3种
主要酚类物质（表儿茶素、没食子酸、香豆酸）的保护
下，细胞存活率的结果见表 1。
如表 1所示，表儿茶素浓度为 0.1 μg/mL～10 μg/mL
时，可将细胞存活率提高 4.81 %～35.28 %，没食子酸
浓度为 2 μg/mL～50 μg/mL时，可将细胞存活率提高
2.38 %～24.82 %，香豆酸浓度为 2 μg/mL～50 μg/mL时，
对 HSF细胞没有明显的保护作用，而且高浓度的香豆
酸会引起细胞死亡率的升高。综上所述，槟榔花中主
要的酚类物质表儿茶素和没食子酸对 HSF细胞有明
显的保护作用，而香豆酸则没有保护作用。
2.3 酚类物质增强氧化损伤的 HSF细胞的总抗氧化
能力
为了明确表儿茶素和没食子酸对 H2O2 引起的
HSF细胞氧化损伤的保护作用，检测细胞内总抗氧化
能力。
从图 2可以看出，H2O2模型组抗氧化能力较正常
对照组显著降低（P<0.01），为对照组的 60.23 %，而表
儿茶素和没食子酸保护组可显著抑制 H2O2造成的细
胞总抗氧化能力的下降，表儿茶素保护组（0.1、1、
10 μg/mL）的总抗氧化能力分别提高到了正常组的
75.69 %、82.63 %和 91.89 %，分别比 H2O2模型组提高
了 15.46 %、22.40 %和 31.66 %。没食子酸保护组（2、
10、50 μg/mL）的总抗氧化能力分别提高到了正常组的
64.96 %、73.17 %和 79.46 %，分别比 H2O2模型组提高
了 4.73 %、12.94 %和 19.23 %。本试验结果证实，表儿
茶素和没食子酸均能通过提高 H2O2诱导的 HSF细胞
内的总抗氧化能力来减轻细胞受到的氧化损伤。
2.4 酚类物质对细胞内活性氧和线粒体膜肿胀度的
影响
DCFH-DA本身不发荧光，进入细胞内后，被细胞
内的酯酶水解为发光的 DCFH，而 DCFH能停留在细
胞内，因为其不能透过细胞膜流出。细胞内的活性氧
可以将 DCFH氧化为 DCF，因此，检测 DCF荧光强度
的强弱就可以评价细胞内活性氧水平的高低[14]。如表
2所示，150 μmol/LH2O2模型组的 DCF荧光强度明显
升高，即 ROS明显升高。而加入表儿茶素和没食子酸
进行保护后，DCF荧光强度较 H2O2模型组要降低，说
明表儿茶素和没食子酸能降低 H2O2引起的细胞内
ROS的升高。
H2O2作用 24 h后，可损伤 HSF细胞的线粒体膜，
表现为 A520 nm值降低（即线粒体肿胀），表儿茶素和没
食子酸可抑制线粒体膜的肿胀，表明线粒体膜受到了
100
80
60
40
20
0
细
胞
存
活
率
/%
对照 50 200
H2O2浓度/（μmol/L）
100 150
**
**
**
图 1 不同浓度 H2O2对 HSF细胞存活率的影响
Fig.1 Effects of different concentration of H2O2 on HSF cell
viability
组别 浓度/（μg/mL） 细胞存活率/%
对照组 100±0.02
H2O2模型组 50.79±0.53
表儿茶素保护组 0.1 55.60±0.74**
1 62.08±1.53**
10 86.07±1.56**
没食子酸保护组 2 53.17±0.99*
10 64.98±1.37**
50 75.61±3.99**
香豆酸保护组 2 50.27±1.11
10 48.78±0.54
50 44.88±4.17*
表 1 槟榔花中 3种酚类物质对氧化损伤的 HSF细胞存活率的影
响（n = 8，x±s）
Table 1 Phenolic compounds in Areca inflorescence inhibits the
reduction of cell viability induced by H2O2 in HSF cells（n = 8，x±s）
注：与空白对照组比较，* P < 0.05；** P < 0.01。
100
80
60
40
20
0
相
对
总
抗
氧
化
能
力
/%
对照组 H2O2
模型组
10
表儿茶素浓度/（μg/mL）
0.1 1
**
**
**
502 10
没食子酸浓度/（μg/mL）
**
**
图 2 表儿茶素和没食子酸对细胞内总抗氧化能力的影响
Fig.2 Effects of epicatechin and gallic acid on the total antioxidant
capacity in H2O2-treated HSF cells
注：**P<0.01，与 H2O2模型组相比。
宋菲，等：槟榔花中酚类物质对HSF细胞氧化损伤的保护作用 基础研究
12
表 2 表儿茶素和没食子酸对 HSF细胞内活性氧和线粒体肿胀度
的影响（n = 3，x±s）
Table 2 The effects of epicatechin and gallic acid on ROS
generation and mitochondria swelling in HSF cells（n = 3，x±s）
组别 浓度/（μg/mL）
活性氧（DCF荧
光强度）
线粒体膜肿胀
（A520 nm）
对照组 8.010±0.711 0.940±0.034
H2O2模型组 12.203±0.318 0.749±0.036
表儿茶素保护组 0.1 8.970±0.070** 0.925±0.009**
1 8.357±0.103** 0.815±0.019**
10 8.167±0.186** 0.825±0.018
没食子酸保护组 2 10.277±0.168** 0.803±0.009*
10 9.333±0.127** 0.829±0.005**
50 8.843±0.116 0.891±0.012
注：与空白对照组比较，* P < 0.05；** P < 0.01。
保护。
3 讨论
研究表明槟榔花中含有大量的酚类化合物，并且
具有较强的体外抗氧化活性，但槟榔花中主要酚类物
质对人皮肤成纤维细胞 HSF的作用未见报道，本文通
过构建 H2O2对 HSF细胞的氧化损伤模型，探讨槟榔
花中主要的酚类物质对 HSF细胞氧化损伤的保护作
用，结果表明表儿茶素和没食子酸对 HSF细胞具有保
护作用，而香豆酸对 HSF细胞没有保护作用。实验结
果进一步明确了槟榔花多酚的抗氧化作用，进而为槟
榔花多酚类物质的利用提供新思路。
细胞总抗氧化能力是衡量细胞内源性抗氧化防
御系统功能的指标，大量研究报道 H2O2作用于细胞
后，会显著降低细胞内的总抗氧化能力，从而引起细
胞毒性 [15-16]。Zhao 等 [17]研究发现 30 μmol/LH2O2作用
Neuro-2A细胞 24 h后，细胞总抗氧化能力显著降低。
本实验结果表明 150 μmol/L H2O2作用 24 h后，HSF细
胞死亡率达到 50.62 %，细胞内总抗氧化能力与对照
组相比下降 39.77 %，而在不同酚类物质（表儿茶素和
没食子酸）的保护作用下，细胞内总抗氧化能力显著
提高。
活性氧 ROS是破坏细胞内环境氧化还原平衡状
态的主要因素之一。过量的 ROS会使细胞内蛋白质和
核糖核酸等发生不可逆修饰，造成细胞损伤并导致细
胞凋亡[18]，是引起多种疾病的主要原因之一[19-20]。本试
验证实表儿茶素和没食子酸能够抑制 H2O2引起的
HSF细胞内 ROS的生成，表明其对 HSF细胞的保护
作用可能与 ROS的清除有关。线粒体是 ROS产生的
主要来源之一，其所产生的氧自由基更易直接破坏线
粒体的结构和功能，使线粒体内酶失活，线粒体膜功
能受损，导致线粒体呼吸功能损伤[21-22]。我们的试验也
发现 H2O2可导致 HSF细胞线粒体膜肿胀，使线粒体
功能受到损伤，而表儿茶素和没食子酸均降低 H2O2引
起的这种损伤。因此，我们认为表儿茶素和没食子酸
是通过清除 ROS，进而抑制线粒体膜损伤而实现对
HSF细胞的保护作用。
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收稿日期：2014-08-25
4 h，提取次数为 3次，提取率为 89.8 %。对两种提取方
法进行比较发现，浸提法所需时间较长，为 4 h，而微波
法只需 10 min；浸提法提取次数为 3次，而微波法提取
次数为 4次；两种方法的提取率差异较小。本试验研
究表明，单独使用微波辅助提取法提取红枣红色素的
优势并不明显，需对提取工艺条件进行进一步的优
化，如与超声波联合使用、与酶解法共同作用等，这还
有待于进一步的研究。
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收稿日期：2014-07-04
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吴进菊，等：微波法提取红枣红色素的工艺研究 分离提取
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