全 文 ：硒 纬 雇 业 学报20 0 5 , 1 4 ( 4 ) : 7 3 一 7 6
A `才a A g r i` 一` l r i `阳尹 B “ ,? u l i 一 )t c ` i d尸 n t u l i s 5 1” ; `农
应用多因子正交试验筛选野生七姊妹离体培养条件
余晓丽 ’ , 陶 杰 2 , 杜敏华 ’ , 刘宗才 ’
l(
. 南阳师范学院生物系 , 河南南 阳 4 73 0 6卜 2 . 南 阳市园林绿化管理 处 , 河南南阳 17 3 05 6)
摘 要 : 应用正交设计法研究 了植物生 长调节剂 、 硝酸银 和活性炭等对七 姊妹愈伤组织的诱 导 、 不定芽诱导
和生根培养的影响 。 结果表 明 : 最佳愈伤组织诱导培养基 为 M s 十 2 , 4一 D o . s m g I/ 沙 + 6 一 B A O . Z m g I/ J + 蔗糖
3 0 9 / I
J
+ 琼脂 7 . 0 9 / I , ; 不定 芽诱导最佳培养基为 M S + N A A 0 . l m g / I + C p p U O . 8 m g / I J + A g N ( ) : , 4 · Om g / I ·
+ 蔗糖 3 0 9 I/ + 琼脂 7 . 0 9 I/ , 分化率为 95 % , 增殖率为 5 . 5 ;最佳生 根培养基为 1 4/ M S + N A A 0 . 3 m g八 +
IB A 0
.
3 m g / I
才
+ 蔗糖 2 0 9 / I J + 琼脂 4 . 0 9 / I碑 , 生根率为 9 0% 。
关键词 : 七姊妹 ;幼叶 ; 正交设计 ;离体培养 ;方差分析 ;
中图分类号 : Q 9 4 3 . l ; Q 9 4 9 . 7 5 1 . 8 文献标识码 : A 文章编号 : 1 0 0 4 一 1 3 8 9 ( 2 0 0 5 ) 0 4 一 0 0 7 3一 O理
A P P l i c a t i o n o f O r t h o g o n a l D e s i g n i n S e l e c t i n g C u l t u r e C o n d i t i o n
i n V i t r o o f R o s e m u l t ifl
o r a f
.
P l a t yP 匆 l l a T h o r y .
Y U X i a o
一
11’ , T A ( ) Ji e Z
,
D U M in
一
h u a ’ a n d I
J
IU Z o n g
一 e a i ’
( 1
.
B i o lo g y D e p a r r m e n一 ) f N a n y a n g T e a e h e r s ( ’ o l l e g e , N 丢I n y a n g H e ’ n a n 魂7 30 6 1 , C h in a
2
.
G a r d e n V i r e
s e e r l e (
、
In
s 一i一u t i o n o f N a n y a n g , N a n y a n g H e 甲n a n 4 7 3 ( ) 5 6 . (二h i n a )
A b s t r a c t : U
s i n g o r t h o g o n a l t y d e
s i g n I
J 。
( 3
,
)
,
w e s t u d i e d t h e e f f e e t o f p l a n t g
r o w t h
r e g u l a t o
r s ,
A g N ( )
3
a n d a e t i v a t e d e a r b o n e t e o n t h e i n d u e t i o n o f e a l l u s
, a d v e n t i t i o n b u d s i n d u e t i o n a n d t h e a d v e n t i t i o n b u d
r o o t i n g
.
T h e b e s t m e d i u m f o r i n d u e i n g e a l l u
s
1
5
M S + 2
,
4
一
D 0
.
s m g / I
J
+ 6
一
B A 0
.
2 m g / I
,
+ s u e r o s e 3 o
g / I
J
+ a g a r 7
.
0 9 / L ; F o r a d v e n t i t i o n B u d s
,
t h e m e d i u m 15 M S + N A A 0
.
l m g / I
J
+ C P P U 0
.
8 m g / I
J
+
+ A g N ( )
3 4
.
0 m g / L + s u e r o s e 3 0 9 / I
J
+ a g a r 7
.
0 9 / I
, ,
d i f f e r e n t i a t io n r a t e 1
5 9 5%
,
t h e m u l t i p li e a t i o n
r a t e 15 5
·
5 ; A s f o r t h e i n d u e t i o n o f r o o t i n g t h e o n l y m e d i u m 15 1 / 4M S + N A A 0
.
3 m g / I
碑
+ IB A 0
.
3
m g / I
J
+ s u e r o s e 2 0 9 / I
矛
+ a g a r 4
.
0 9 / I
J ,
t h e r o o t i n g r a t e 15 9 0 %
.
K e y w o r d s : R o s e m u l zlf
o ar f
.
P l a zyP h
夕l l a T h o r y . ; Y o u n g l e a v e s ; ( ) r t h o g o n a l t y d e s i g n ; C u l t u r e i n
V i t阳 ; A n a l y s i s o f v a r i a n e e
七 姊 妹 ( R o s e , n u l z ,fl o ,二 f . P l a tyP 勺 l l a
T h o r y
.
) 是蔷薇科蔷薇属药用植物 , 可做树月季
砧木 L’ 二,其农艺性状好 ,抗病力强 。 以单瓣花白者
为好 。 中医称 “ 白残花 ” ,入药称 “ 营实 ” 。 花 ,味甘 ,
性凉 ,用于理气 、 清暑 、 和胃 、 止血 。 果 ,味酸 ,性温 ,
可用于利尿 ,通经 ,治水肿 。 根 ,味苦 ,涩 ,性寒 ,用
于清利湿热 ,祛风 ,活血解毒川 。 是我国传统常用
中药材之一 。 目前 ,有关七姊妹的组织培养未见报
道 。 本文以七姊妹幼叶为试验材料 , 对其愈伤组织
的诱导 、 不定芽的分化和根诱导作了较为详细的
研究 , 为运用生物技术进一步开发 和利用这一植
物资源提供依据 。
1 材料和方法
1
.
1 取材及培养条件
材料及来源 : 七姊妹采自河南西峡山区 。
收稿日期 : 2。。 5一。 1一 15 修回日期 : 2。 。5一 0 6一 17
基金项 目 : 南阳师范学院 2 0 0 3 年应用与科技开发项 目 ( n y t c Z。。31 8 ) ;河南省南阳市 2 (〕04 年科技攻关项 [J ( 2 (〕01 o q o l 6 )
作者简介 : 余晓丽 ( 19 6 3一 ) , 女 , 河南南阳人 ,副教授 . 从事细胞培养研究工作 。
西 北 农 业 学 报 14 卷
愈伤组织的诱导: 取七姊妹幼叶 , 自来水冲洗
3 () n l i l l
,
7 5写酒 精 3 0 5 , 0 . 1% H g C IZ 消 毒 6 ~ s
m :。 ,无菌水清洗 3一 5 次 ,得到无菌材料 , 以 M S +
2
,
4
一
D + 6
一
B A + 蔗糖30 9 / I J + 琼脂 7 . 0 9 I/ J 为基
本培养基 , 暗处理 2 周后 ,每 日光照 。
不定 芽诱 导 : 取 七 姊妹无 菌 芽 , 以 M S +
〔 ’ 1, I , U + N A A + A g N ( ) 3 + 蔗糖 3 0 9 / I矛 + 琼脂
7
.
0 盯 l矛为基本培养基 。
生根试验 : 在无菌条件下 ,取七姊妹不定芽 ,
以 1 / 4M S + N A A + IB A + 活性炭十蔗糖 20 9 /
I
J
+ 琼脂 4 . 0 9 I/ J 为基本培养基 。
培养条件 : 置 M G C 一 3 50 H P 型智能人工气候
箱中 ,光照强度 2 S OO l x , 每 日光照 1 2 h ,培养温度
2 5 (
、 士 0 . S C 。
1
.
2 正交试验设计
1
.
2
. 】 不 定 芽诱导及培养系统的建立 根据文
献报道「月川及预试验 , 在不定芽诱导试验中 , 选取
C P P U
、
N A A 和 A g N ( ) 3 等因子 , 其 中 ( ) P P U 为
[ N
一
( 2
一氯 一 4一毗吮基 ) 一 N 产苯基脉 j , 每个 因子取 3
个水平 , 选用 I J , 〔3」 )正交表 ,考察对七姊妹不定芽
诱导的影响「了 · 吕〕 。 因子水平安排见表 1。
表 I L , ( 3 碑 )正交试验设 计
T a b l e 1 T h e d e s i g n f o r m o f th e o
r t h o g o n a l te s t I
J ,
( 3
4
)
A B C l )
( 1
,
l
,
t j r,
飞9 2 1 N A A m g / 1 A g N ( ) 3 m g / L C K
1 ( )
. 气 0 . 1 3 . 0 1
2 工j
.
8 0
.
3 4
.
0 2
3 1
.
(〕 () . 5 5 . 0 3
1
.
2
.
2 生根培养 选取 N A A 、 BI A 两种植物生
长物质和活性炭 , · 6 {等因子 , 每个 因子取 3 个水
平 , 选用 L 。 ( 3 , )正 交表 , 考察对七姊妹生根的影
响阶 川 。 因子水平安排见表 2 。
表 z L , ( 3 4 )正交试验设计
1
’
a b l e 2 1
’
h e d e s ig n f o r m o f t h
e o r t h o g o n a l t e s t L , ( 3 4 )
A B C D
N A A ( m从 / I ) IB A ( m g / I ) A e t i v a t e d e a r b o n (二K
结果与分析
不同激素对七姊妹幼叶愈伤组织诱导 的影
起着十分重要的作用 ,但它们对愈伤组织诱导 、 生
长和分化的影响却不相同 : 在附加 2 , 4 一D 的培养
基中 ,愈伤组织数量 多 ,生 长快 ; 而附加 N A A 的
培 养基 , 愈伤组织数量明显减少 , 前者可为后者 4
~ 5 倍 ,甚至更多 ,而且愈伤组织不能分化 出再生
植株 。 而在 N A A 诱导作用下 ,幼叶脱分化后 , 只
长出少量愈伤组织 ,便迅速分化出大量不定芽及
再生植株 。 说明 2 , 魂一 D 在试验的浓度范围内促进
七姊妹幼叶脱分化及愈伤组织生 长 , 抑制愈均组
织 分化 , 而 N A A 在试验 的浓度范围内则促 进愈
伤组织分化 。
由于七姊妹幼叶对外源激素的反应不同 ,在
实际应用时 ,应根据需要不同 ,选择不同的外源激
素 ,若以诱导愈伤组织为 目的 ,生长素 2 , 4一 D 适宜
浓度为0 . 8 m g I/ , , 6一 B A 适宜浓度为 0 . 2 m g I/ J ; 若
以 获得再生植株为 目的 ,则生长素 N A A 适宜浓
度为 0 . 1 m g / I一 ,而 6一B A 适宜浓度为 0 . 8 m g I/ , 。
2
.
2 不定芽诱导及培养系统的建立
在无菌芽接种 s d 后 ,开始有新芽出现 ; 随后
大多数培养基中的丛生芽不断增加 ,并 且丛生芽
的生长都十分健壮 ,在接种 4 周后统计分化率 (表
3 )
。
直观分析表明 , R A 为 2 7 . 2 6 、 R B 为 2 8 . 13 、
R C 为 1 9 . 1( )、 空列因子 R 。 为 1 3 . 5 7 , 3 种因子对丛
生芽诱导产生效应的大小依次为 N A A > C P P U >
A g N O
。 , 3 种因子的 R 值均 比空列的大 , 说明各
因素间 的变异是可靠的 。 可 见 , N A A 、 C P P U 和
A g N( )
3 是影响不定芽分化的主要因子 。
N A A 的浓度为 0 . l m g l/ J 时的平均相对分化
率为 26 . 91 ,分别是浓度为 0 . 3 m g I/ 才 和 0 . s n 飞g I/ 廿
时的 1 . 5 4 和 1 . 1倍 , 3 种水平的平均相对分化率
的极差为 9 . 38 ,表现出明显的差异 。 C P P U 浓度为
O
,
s m g / L 时和 A g N O 污 浓度 为 4 . 0 m g l/ 护 时的平
均相对分化率最高 ,分别为 28 . 21 和 25 . 4 6 ,其 3 种
水平 的平均 相对分化 率 的极 差分 别为 9 . 09 和
6
甲
3 7 (表 4 ) 。 方 差分析表 明 , F 、 为 4 . 3 5 、 户’ , , 为
4
.
68
、
F 。 为 2 . 3 0 , 3 种因子的 F 值均大于 l , 说明各
因素对试验的影响都显著 、。 和直观分析的结果相
一致 。 因此产 3 种因子的最佳结合应为 A Z B I C : (0 . 8
m g / I
J
C p P U
、
0
.
1 m g / I
J
N A A 和 4 . Om g / I J
A g N O
、
)
,分化率为 95 % ,且单芽均增殖率为 5 . 5 。
.2响
在 七蛛妹脱分化过程中 ,生长素 2 , 4 一D 、 N A A
4期 余晓丽等 :应用 多因子 正交试验筛选野生七姊妹离体培养条件 7 5
表 3 七姊妹不定芽诱导试验结果 L, ( 34 )
T a b l e 3 T h e r e s u l t o f t h e a d v e n t i t io n b u d i n d u e t io n o f R o s e
m u l t ifl
o
ar f
.
P l a ty P hy l l
a T h o r y
.
i n th e o r t h o g o n a l te s t I
J ,
( 3 4 )
处 理
T
r e a t m e n l
A I )
接种数
In e u b a t i
〔) n N o
.
分化数
I )1f f e r e n 一i a l i o n N o
.
分化率 / 写
I )1f f e r e n t一a t i ( ) 11 r a t e
-
-
~一 -一一一一一 一~一 - .一 ~ 一一 - 一 ~ ~一 一 - ~ ~一 ~一一 - . 一一 - ~ 一一 一一1 0 . 5 0 . 1 3 . 0 1 8( ) 6一 7 . 52 0 . 5 0 . 3 4 . ( ) 2 8 1 6 . 13 0 . 5 0 . 5 5 . 0 3 78 16 2 0 . 34 0 . 8 0 . 1 4 . 0 3 80 76 9只 . 〔)5 0 . 8 0 . 3 5 . ( ) 1 8 7 7 1 8 1 . 66 0 . 8 0 .一 0 2 8 8 68 77 . ;弓7 1 . 0 0 . 1 5 . 0 2 8 9 6一 9 . 78 1 . ( ) 0 . 3 3 . 0 3 7 7 5 0 6 4 . 99 1 . 0 0 .一 . 0 1 9 0 5 ` 1 6 ( )K 1 1 7 2 . ] 2 4 2 . 2 2 19 . 7 2 1 9 . 1 注 ( n o 一e 、 ) :K Z 2 5 3 . 9 2 20 . 6 2 2 9 . 1 2 2 1 . 1 .①K I 代表水平 l 的总值K 3 1 94 . 6 1 5 7 . 8 17 1 . 8 1 8 0 . 4 K l r e 一) r e s 〔旧 t s l () t a l v 乏l { u e o 「Ic v c l l` 1 5 7 . 3 7 8 0 . 7 3 7 3 . 2 3 7 3 . ( ) 3 ② ` l 代表水平 1 的平均值
K
Z 8 4
.
6 3 7 3
.
5 3 76
.
3 7 7 3
.
70 K l r e p
r e s e n 一5 z h e a v e r乏一g e o f l e v e l l
`一 8一 60 5 7 . 2一 于一似材料为 f . P l u 勺沪如 l la T h o r y .R 2 7 . 2 6 2 8 . 1 3 19 . 10 1 3 . 5 7 U s i n g f . P I“ z〕户h〕 ,11“ T h ( ) r y . a s m a t c r 一a lF 4 . 3一 . 68 2 . 3 0表 4 七姊妹各因子不定芽的平均相对分化率 比较
T a b le 4 T h e e o m P a
r i s o n a m
o n g a v e r a g e r e l a t i v e
d i f f e r e n t i t a t io n r a t e s o f a d v e n t i t io n b u d s
in R o s e m u l tifl
o
or f
.
P l a tyP hy ll
a T h o r y
.
f a e t o r s
水平代码 ( ’ p p U N A A A g N ( ) :
I e
v e l e o d e / ( m g
·
1 1 ) / ( rn g
·
1 1 ) ( m g
·
1 1 )
(
,
K
1 19
.
1 2 2 6
.
9 1 2 4
.
4 1 2 4
.
3 4
2 8
.
2 1
2 1
.
6 2
2 4
.
5 !
17
.
5 3
2 5
.
16
19
.
0 9
2 4 5 7
2 0
.
()」
伙 9 . 0 9 9 3 8 6 . 3 7 4 . 3
2
.
3 不定芽诱导生根试验
接种不定芽 7 d 开始有根出现 , 随后 ,大多数
培养基不定芽不断生根 , 在接种 4 周后统计丛生
芽生根率 (表 5 ) 。
经 N A A 、 川 A 和活性炭 3 个水平 9 个浓度组
合的正交试验 , 对实验结 果进行直观分析 ,发现
N A A
、
I B A 的极差分别为 31 . 03 和 29 . 9 7 , 比空列
因子 R 。 大 ( R 一 1 6 . 8 3 ) , 而活性炭的极差为 8 . 8 0 ,
表 S 七姊妹不定芽生根诱导试验结果 L , (3 4 )
T a b le 5 T h e r e s u lt o f t h e a d v e n t i t io n b u d s r o o t i n g i n d u e t i l一n o f R o s e m u l tifl
o r a f
.
P l a tyP hy ll
a T h o r y
.
i n t h e o r t h o g o n a l t e s t L
,
( 3 4 )
处 理
T
r e a tm e n l
I )
接种数
In e
t ,
h
a z i o n N o
.
分化数
I) 1f f e r e n z i a 一i o n N o .
分化率 /州
I )
一
f f
e r e n l l ; l一 lo n r a [ e
ùOé1六ù门]凡一!9甸吕一门八é曰乃一 了O-匀(一门On日
0
.
3
()
.
3 1 ( )
( )
.
3
0
.
5 l ( )
泪.2()0 . 5O 5
17 2
.
5 1 90 6 15 9
.
6
2 4 3
1 5 0
1 74 6
2( ) l
2 10
.
1
1 9 6
.
5
K I 5 7
.
5 0 6 3
.
9 ( ) 6 3
.
53 5 3
.
2 0 必 K l 代表水平 一的平均依
陀 2 8 1
.
1 3 7 7
. 飞0 5 8 . 20 7 0 . ( )3 化 l r e l 〕 r c s e n t s l h e 是I v c r芯一g e o f l e v e l l
二3 5 0
.
]〔) 4 7 . 4 3 6 7 . 0 0 6 5 . 5 0 写多供试材料为 f . 户l u , J沪儿, 7 /`之 T I、`。 r y .
R 3 1
.
0 3 2 9
.
9 7 8
.
8 0 1 6
.
8 3 U
s
i了l g f
.
P l
u z ,沪h〕, l l u ` F h r ) r y . a s m 乏五t e r i a l
F 3
.
4 6 2 9 7 0
.
26
西 北 农 业 学 报1 4卷
比 R。 小 ,说明活性炭的效应是不 可靠的 , N A A 、
I B A 两因素的效应可靠 。
方 差 分 析表 明 , N A A 、 I B A 的 F 值分 别 为
3
.
4 6和 2 . 9 7 ,大于 1 ,而活性炭的 F 值为 0 . 26 , 小于
1
, 说 明 N A A 、 BI A 因子对丛生芽诱根的影 响较
大 , 活性炭对丛生芽诱根的影响较小 , 可以不考
虑 。 以上分析结合表 6 可知 ,各因子的最佳组合为
A
ZB Z ( 0
.
3 m g / I
J
N A A 和 o 。 3 m g / L I B A ) 。 生根
率为 9 0 % 。
诱导生根后 , 移栽到珍珠岩和沙土各半的栽
培基质 中 , 炼苗 2 周 , 然后移栽到土壤 中 , 按常规
方法管理 , 30 d 后小苗成活 。
表 6 七姊妹各因子不定芽生根的
平均相对分化率比较
T a b l e 6 T h e c o m p a
r
is o n a m o n g a
v e r a g e r e la t iv e
d i f r e
r e n t i t a t io n r a te s o f a d v e n t i t io n b u d s r o o t i n g
i n R o s e m u l r ifl o ar f
.
P l a t yP hy ll
a T h o r y
.
f a e t o r s
属植物 ,丛生效果较好 。 在不定芽诱导阶段 ,适量
添加 A g N 0 3 对不定芽的增殖起一定的辅助作用 ,
并可一定程度地控制黄化现象 。
本实验采用正交实验分别选取不同的影响因
子进行实验 , 筛选出七姊妹愈伤组织 、 丛生芽和生
根培养的最佳培养基 , 建立 了七姊妹离体培养系
统 , 为其快繁奠定了基础 , 更重要的是为毛状根的
培养 ,植株再生以及遗传转化系统的建立提供了
实验材料 。
.,’ 双代码 N A今 . 、 B[八 、 A ct i丫at de c K
l e v e l c o a c /气 m g ’ l ) /叹m g . 1 ` ) c a r D o n
3 讨 论
七姊妹愈伤组织的诱导和培养系统的建立具
有重要的实践意义 ,不 同种类 、 浓度和配 比的植物
生长调竹剂影响着七姊妹离体培养系统的建立 。
C P P U 是一种新型植物生长调节剂 , 本室前
阶段试验发现 C P P U 在刺激细胞分裂 ,诱导芽的
分化等方面 比 6一 B A 好 。 因此 , 首次应用于蔷薇
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