全 文 ：收稿日期:2010-06-05;　修订日期:2010-11-08
基金项目:广东省自然科学基金(No.8151009001000029);
广东省科技厅计划项目(No.2008B021100013)
作者简介:孙　俊(1983-), 男(汉族),湖北黄冈人 ,现为广东工业大学
轻工化工学院在读硕士研究生 ,学士学位 ,主要从事天然产物的开发研究
工作.
＊通讯作者简介:丁利君(1965-),女(汉族),湖南长沙人 ,现任广东工业
大学轻工化工学院教授 ,硕士研究生导师 ,硕士学位 ,主要从事食品化学 、
食品加工教学与研究工作.
纤维素酶 -微波联合提取蜈蚣草黄酮及其抗氧化研究
孙　俊 ,丁利君＊ ,李梅艳
(广东工业大学轻工化工学院 , 广东 广州 510006)
摘要:目的 探索纤维素酶 -微波联合提取蜈蚣草黄酮的最佳工艺条件及对其抗氧化性进行研究。 方法 在单因素的基
础上进行正交实验 , 数据经 SPSS软件分析。以黄酮提取物对超氧自由基的清除率作为指标分析其抗氧化性。结果 纤
维素酶 -微波联合提取蜈蚣草黄酮的最佳工艺条件为:料液比 1∶20,微波功率 800 W, 压强 0.3 MPa条件下处理 2 min
后 , 再进行纤维素酶解 ,于 65℃, pH6.5条件酶解 4h(酶用量 0.11%)。此条件下 ,总黄酮提取率达到 14.44%。蜈蚣草黄
酮提取液对超氧自由基有良好的清除率 ,其 IC50为 3.45 mg/ml。结论 相比单一的微波法 、纤维素酶解法 , 纤维素酶 -微
波联合提取蜈蚣草黄酮的最大提取率分别高出 20%和 10%,且其黄酮提取物有良好的抗氧化性 ,有很好的开发前景。
关键词:蜈蚣草;　黄酮;　纤维素酶;　微波法;　抗氧化
DOI标识:doi:10.3969 /j.issn.1008-0805.2011.04.032
中图分类号:R284.2　　文献标识码:A　　文章编号:1008-0805(2011)04-0854-03
ExtractionofFlavonoidsfrom PterisvitataUsingCelulase-MicrowaveMethodand
AntionxidantActivities
SUNJun, DINGLi-jun＊ , LIMei-yan
(ColegeofChemicalEngineeringandLightIndustry, GuangdongUniversityofTechnology, Guangzhou
510006, China)
Abstract:ObjectiveToobtaintheoptimalextractionconditionsofflavonoidsfromPterisvittatausingcelulase-microwave
method.MethodsOrthogonalexperimentswasusedonthebasisofthesinglefactorexperiments.ThedatawasanalyzedbySPSS.
Thescavengingrateagainstsuperoxideradicalwasusedasanindicatortoanalyzetheantioxidantactivityoftheflavonoidsextract.
ResultsTheresultsshowedthattheoptimumextractionconditionswasasfolows:material-liquidratio1∶20, microwavetime
2 min, microwavepower800w, microwavepressure0.3MPa, cellulosedosage0.11%, cellulasehydrolysistemperature65℃,
pH6.5, hydrolysistime4 h.Undertheseconditions, theextractionrateofflavonoidsfromPterisvitatareached14.44%.Fla-
vonoidsfromPterisvitatahadagoodscavengingrateagainstsuperoxideradical, andtheIC50 was3.45 mg/ml.ConclusionCom-
paredtothesinglemicrowavemethod, theextractionrateincreasedby20%, comparedtothesinglecelulasehydrolysismethod,
theextractionrateincreasedby10%, andtheflavonoidsextractfromPterisvitatahasgoodantioxidantactivity.
Keywords:Pterisvittata;　Flavonoids;　Cellulase;　Microwave;　Antioxidation
　　蜈蚣草 PterisvitataL.是蕨类凤尾蕨科凤尾蕨属 ,全草或根
状茎入药 , 全年可采 , 祛风活血 , 解毒杀虫 , 用于防治流感 、痢疾 、
风湿疼痛 、跌打损伤。蕨类植物的化学成分较为复杂 , 其中具有
生物活性的成分主要有酚类化合物 、黄酮类化合物 、生物碱类化
合物 、甾体及三萜类化合物 [ 1] 。黄酮是蕨类植物所含化学成分
中较多的一种 , 有很强的生物活性 ,在医药 、食品添加剂上具有广
泛用途。黄酮类化合物的传统提取方法主要有热水提取法 [ 2] 、
醇提法 [ 3] 、碱性水或碱性稀醇提取法 [ 4]等 , 现代先进的提取技术
有微波辅助提取法 [ 5] 、超声波提取法 [ 6] 、超临界流体提取法 [ 7] 、
半仿生提取法 [ 8] 、酶提取法 [ 9] 、高效液相色谱法 [ 10] 、分子印迹
法 [ 11]等等 ,各种提取方法各有利弊。本实验联合现代先进的微
波法和纤维素酶酶解法 ,最大限度地提高黄酮提取率 ,并对其提
取物的抗氧化性进行研究 ,为蜈蚣草黄酮的开发利用提供理论依
据。
1　材料与仪器
1.1　药材 蜈蚣草采自广州大学城 , 取地上部分的叶子 , 洗净 , 风
干 , 粉碎 ,粉末过 40目数的筛 ,备用。
1.2　试剂 芦丁 , 上海润捷化学试剂有限公司出品;纤维素酶(裕
立宝生物科技), 食品级酶制剂。三羟甲基氨基甲烷 、乙二胺四
乙酸 、浓盐酸 、亚硝酸钠 、硝酸铝 、氢氧化钠 ,天津市大茂化学试剂
厂出品 ,分析纯。邻苯三酚 , 天津福晨化学试剂厂出品 ,分析纯。
1.3　设备 XT-9900型微波消解仪(上海新拓微波溶样测试技
术有限公司), TU-1901双光束紫外可见分光光度仪(北京普析
通用仪器有限责任公司), 旋转蒸发仪(上海雅荣生化设备仪器
有限公司)。
2　方法
2.1　总黄酮的测定 [ 12] 按照文献的方法 ,制备芦丁标准曲线 , 分
析得出芦丁标准曲线的回归方程:Y=0.101 6X+0.000 8, R2 =
0.996, 其中 X为吸光度值 , Y为芦丁含量(mg/ml)
样品溶液黄酮提取率测定:将蜈蚣草粉末按料液比浸泡在蒸
馏水 , 经微波和纤维素酶解后 , 离心 ,抽滤 , 得到澄清的滤液 ,将滤
液定容到 250 ml容量瓶 ,然后从容量瓶中准确吸取 1 ml样液 , 加
入比色管中 ,加入 5﹪亚硝酸钠溶液 0.3ml,摇匀 , 静置 6 min后 ,
加入 10﹪硝酸铝溶液 0.3 ml, 摇匀 ,静置 6 min后 , 加入 1 mol/L
NaOH溶液 4ml, 用蒸馏水稀释至 10 ml刻度线 , 摇匀 , 静置 15 ～
20 min, 在波长 510 nm处测定各比色管中溶液的吸光度 ,空白试
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剂是用蒸馏水代替样品液 , 并重复以上的操作。记录每个样品的
吸光度 , 利用标准曲线方程计算出样品的黄酮提取率 ,黄酮提取
率计算公式为:
p=yV1V2 /mV×100%
式中:p为总黄酮类物质提取率(﹪);y为从回归方程计算
求得样品中黄酮类物浓度(mg/ml);V1为比色皿的体积(ml);V2
为样液定容总体积(ml);V测定取样体积(ml);m为蜈蚣草样品
投料量(g)。
2.2　纤维素酶 -微波联合提取蜈蚣草黄酮的工艺参数的确定方
法 先分别以影响蜈蚣草提取的各因素进行单因素实验研究 ,确
定单因素最佳的工艺条件 ,然后选取对蜈蚣草提取影响最大的 4
个主要的因素 , 微波功率 、微波压强 、纤维素酶解 pH、纤维素酶解
温度进行优化组合 , 以黄酮提取率为指标 , 采用 L9(34)进行正交
实验。因素水平表如表 1。
表 1　L9(34)正交实验因素水平
水平 A微波功率 P/W
B
微波压强 P/MPa
C
酶解温度 T/℃
D
酶解 pH
1 700 0.2 65 5.5
2 800 0.3 70 6.0
3 900 0.4 75 6.5
2.3　抗氧化的测量方法 根据文献 [ 13]的方法 , 在试管中加入
缓冲液 0.1mol/LTris-HCl(pH8.20,内含 2mmol/LEDTA)和蒸
馏水 , 于 25℃恒温 20 min后加入 25℃预热过的邻苯三酚(对照
管用 10mmol/L盐酸代替),迅速摇匀 , 立即倾入光径 1 cm比色
杯中 , 在波长 420 nm处每 0.5 min测定 1次吸光度值 A0 , 共
4min。计算对照溶液吸光度值随时间的变化率■A0。样品测定:
加入 lml样品液 , 相应减少同体积水 , 测定加样后自氧化速率
■A1。
清除超氧自由基能力计算:清除率(%)=(■A0 -■A1)/■A0 ×
100%
3　结果
3.1　微波辅助提取蜈蚣草总黄酮的工艺参数的研究
3.1.1　料液比对提取蜈蚣草黄酮的影响 准确称量蜈蚣草
0.5 g,以不同料液比配制样品液经微波消解仪处理 , 微波功率
500W, 工作压力 0.2 Mpa条件 , 处理 2 min后 , 浸提 40 min, 过
滤 , 测吸光度。图 1表明 ,料液比为 1∶20, 黄酮提取率最高 , 但
是随着料液比的继续增大 , 黄酮含量反而减少。这主要是因为单
纯的加热浸泡中 , 提取剂量的选择应该有一定限度 , 当超过这个
限度时 , 浸泡出的杂质会增多 , 并且会干扰吸光度。由此 ,确定提
取蜈蚣草中黄酮的最佳料液比为 1∶20。
图 1　料液比在微波法中对黄酮提取率的影响
3.1.2　微波功率对提取蜈蚣草黄酮的影响 准确称量 0.5 g的
蜈蚣草粉末 ,按料液比为 1∶20加入适量的蒸馏水 ,微波时间为
2 min,工作压力为 0.2 MPa的条件下处理样品 , 处理完后在微波
消解罐中浸泡 40 min, 用分光光度计测量吸光度。 由图 2可看
出 , 黄酮提取率随着微波功率的提高而增大 , 在功率为 800 W
时 , 黄酮提取率最大。这主要是因为功率增大时 ,细胞壁受到电
磁波作用更增强 , 细胞壁破碎程度增大 , 黄酮的溶出量增大。但
是微波功率增大 , 会加快黄酮分子间的振动 , 当功率增大到一定
限度时 ,会破坏黄酮分子内结构 , 导致黄酮含量的降低。当微波
功率达到 900 W时 , 其吸光度明显下降。所以 , 最佳提取蜈蚣草
黄酮的微波功率是 800 W。
图 2　微波功率对黄酮提取率的影响
3.1.3　微波时间对提取蜈蚣草黄酮的影响 准确称量 0.5 g的
蜈蚣草粉末 ,按料液比为 1︰ 20加入蒸馏水 10 ml, 在微波功率
800 W,工作压力 0.2 MPa的条件下处理不同时间后 , 浸提 40
min,测吸光度。由图 3可知 , 黄酮提取率随着微波时间延长先升
高后降低 , 微波时间 2 min时 , 黄酮提取率最高。这主要是因为
时间太长 ,黄酮分子内结构完全被破坏 , 黄酮化合物变质 ,导致微
波消解罐中有糊味 ,黄酮含量迅速减少 , 其吸光度明显下降。 因
此 , 最佳提取蜈蚣草黄酮的微波时间是 2 min。
3.1.4　不同压强对提取蜈蚣草黄酮的影响 准确称量 0.5 g的
蜈蚣草粉末 , 按料液比为 1∶20加入 10 ml的蒸馏水 , 微波功率
800 W,在不同工作压强下处理样品 2 min, 浸提 40 min, 测吸光
度。由图 4表明 , 黄酮提取率随着压强的增加先上升后降低 , 压
强为 0.3 MPa时黄酮提取率达到最大值 。压强为 0.5 MPa时又
开始上升。这主要是因为随着微波压强的增大 ,有利于细胞壁破
裂 , 黄酮溶出量增大。压强增大到一定程度 ,会导致黄酮化合物
的结构破坏以及其他物质的流出 , 从而影响吸光度值。因此 , 最
佳提取蜈蚣草黄酮的微波压强是 0.3 MPa。
图 3　微波时间对黄酮提取率的影响
图 4　压强对黄酮提取率的影响
3.2　纤维素酶辅助提取蜈蚣草总黄酮的工艺参数的研究
3.2.1　不同料液比对提取蜈蚣草黄酮的影响 准确称量蜈蚣草
0.5 g,以不同料液比配制样品液 , 在 pH7, 纤维素酶用量 0.05%,
室温 28℃浸泡 1 h,测吸光度。由图 5可知 ,料液比 1︰ 40时黄
酮的提取率达到最大值 ,之后黄酮提取率开始小幅度下降。因为
充足的溶剂可以充分地将蜈蚣草黄酮类物质浸提出来。因此 , 最
佳提取蜈蚣草黄酮的料液比是 1︰ 40。
3.2.2　不同 pH值对提取蜈蚣草黄酮的影响 准确称量蜈蚣草
0.5 g,在料液比为 1︰ 40, 纤维素酶用量为 0.05%, 在不同 pH
值下室温浸提 1 h,过滤 , 测吸光度。由图 6表明 , 黄酮的提取率
在 pH值 6.0时最大。由于酶活受 pH值的影响很大 , 当 pH6.0
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LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH2011VOL.22NO.4 时珍国医国药 2011年第 22卷第 4期
时纤维素酶的活性最大。在适宜的 pH值范围内 , 纤维素酶的活
性越大 , 分解细胞壁的能力越强 , 从而使黄酮类物质更容易从细
胞中分离出来。因此 , 最佳提取蜈蚣草黄酮 pH6.0。
图 5　料液比在纤维素酶解法中对黄酮提取率的影响
图 6　pH值对黄酮提取率的影响
3.2.3　不同温度对提取蜈蚣草黄酮的影响 准确称量蜈蚣草
0.5 g,在料液比为 1︰ 40, 纤维素酶用量为 0.05%, pH值 6下 ,
在不同温度下浸提 1h,测吸光度。由图 7可以看出 , 黄酮的提取
率随着温度的增加先增大后减小 , 当温度为 70℃时出现峰值。
这主要是因为当温度为 70℃时 , 纤维素酶的活性最大。在适宜
的温度范围内 , 纤维素酶的活性越大 ,分解细胞壁的能力越强 ,从
而使黄酮类物质更容易从细胞中分离出来。因此 ,最佳提取蜈蚣
草黄酮的温度为 70℃。
图 7　酶解温度对黄酮提取率的影响
3.2.4　不同酶用量对提取蜈蚣草黄酮的影响 准确称量蜈蚣草
0.5g, 在料液比为 1︰ 40, pH6,温度为 70℃加不同量的酶 ,浸提
1h, 测吸光度。由图 8可以看出 ,黄酮的提取率随着酶用量的增
加先增大后减小 , 当用量为 0.11%时出现峰值。这是因为当底
物的量一定的时候 , 其他条件不变的情况下 , 酶的量越多 , 纤维
素酶解细胞壁的速度也越快 , 黄酮的溶出量也会增多 ,但纤维素
酶的用量增到一定的程度后 ,纤维素酶的大量存在会降低样液的
吸光度 ,影响黄酮提取率的测定。因此 ,最佳提取蜈蚣草黄酮的
酶用量为 0.11%。
图 8　酶用量对黄酮提取率的影响
3.2.5　不同时间对提取蜈蚣草黄酮的影响 准确称量蜈蚣草
0.5 g,在料液比为 1︰ 40,在 pH=6,纤维素酶用量为 0.11%, 温
度为 70℃浸提不同时间 ,测吸光度。图 9表明 , 黄酮的提取率随
着纤维素酶处理时间的延长而加大 ,浸提 4 h达最大值。这主要
是因为酶解时间越长 ,纤维素酶解细胞壁的效果越好 , 黄酮溶出
量越大 。但时间到达一定限度时 ,其他物质的溶出会降低样液的
吸光度值 ,影响黄酮提取率的测定。因此 , 最佳提取蜈蚣草黄酮
的时间为 4 h。
图 9　酶解时间对黄酮提取率的影响
3.3　纤维素酶 -微波联合提取蜈蚣草黄酮的正交实验及其结果
以微波功率 、微波压强 、纤维素酶解 pH、纤维素酶解温度 4个因
素进行 4元 3次正交实验 , 并运用 SPSS统计分析软件对表 2的
实验数据进行处理。对表 2中的结果进行极差分析可知 [ 14] , 各
因素对总黄酮提取率影响的主次顺序为 C>B>D>A, 即影响纤
维素酶解温度对总黄酮提取率影响显著 , 微波压强 、纤维素酶解
pH次之 ,而微波功率影响较小 , 最优组合为 A2B2C1D2。 则最佳
工艺条件为料液比 1︰ 20, 微波时间 2 min, 微波功率 800 W, 微
波压强 0.3MPa, 纤维素酶用量 0.11%,纤维素酶解温度 65℃, 纤
维素酶解 pH 6.5, 酶解时间 4 h。此条件下 , 总黄酮提取率是
14.44%。
表 2　L9(34)正交实验结果与极差分析
水平 因素A B C D
平均吸
光度值
黄酮提取率
(%)
1 1(700) 1(0.2) 1(65) 1(5.5) 1.022 10.464
2 1(700) 2(0.3) 2(70) 2(6.0) 1.087 11.124
3 1(700) 3(0.4) 3(75) 3(6.5) 0.851 8.726
4 2 1 2 3 0.949 9.722
5 2 2 3 1 0.950 9.732
6 2 3 1 2 1.230 12.577
7 3 1 3 2 0.849 8.706
8 3 2 1 3 1.330 13.593
9 3 3 2 1 0.850 8.716K1 30.314 28.892 36.634 28.912K2 32.031 34.449 29.562 32.407K3 31.015 30.019 27.164 32.041K1 10.105 9.631 12.211 9.637K
2 10.677 11.483 9.854 10.802K3 10.338 10.006 9.055 10.680R 0.572 1.852 3.156 1.165
3.4　单一微波法和纤维素酶解法与联合法的提取率比较 由图
10可知 , 联合提取法的最大提取率比单一微波法的最大提取率
高出 20%, 比单一纤维素酶解法的最大提取率高出 10%。表明
联合提取法相对单一的微波法和纤维素酶解法有一定的优势 , 可
应用于实际的提取中。
图 10　3种提取方法的最大提取率比较
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时珍国医国药 2011年第 22卷第 4期 LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH2011VOL.22NO.4
3.5　黄酮提取物对超氧自由基的清除作用 由图 11可知 , 随着
黄酮浓度的增加 , 提取物对超氧自由基的清除率随之提高 , 其
IC50为 3.45mg/ml。当浓度为 4.70 mg/ml时 ,其超氧自由基清除
率达到了 79.9%, 表明蜈蚣草黄酮有很好的清除超氧自由基的
效果。
图 11　不同浓度黄酮提取液对 O2 -·的影响
4　结论
本研究表明 , 先运用微波破壁后再进行纤维素酶解 , 蜈蚣草
黄酮的提取率可到达 14.44%。 其最佳工艺条件为:料液比 1∶
20,在微波功率 800 W,微波压强 0.3MPa下处理 2 min后 , 再加
纤维素酶 0.11%, 于 65℃, pH6.5, 酶解 4h。微波 -纤维素酶联
合提取蜈蚣草黄酮 , 比单一的微波法的最大提取率高出 20%,比
单一的纤维素酶解法高出 10%。其清除超氧自由基的效果良
好 , 由于提取物是总黄酮 ,其纯化后的抗氧化性有待进一步研究。
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收稿日期:2010-06-17;　修订日期:2010-11-09
基金项目:宁夏回族自治区自然科学基金(No.NZ0958)
作者简介:刘建利(1973-),男(汉族),陕西凤翔人 ,现任北方民族大学生物科学与工程学院讲师 ,硕士学位 ,主要从事微生物分子生物学研究工作.
宁夏枸杞内生真菌的分离及抗氧化活性的测定
刘建利
(北方民族大学生物科学与工程学院 ,宁夏 银川 750021)
摘要:目的 分离和鉴定宁夏枸杞茎 、叶和果实中的内生真菌 ,并检测其抗氧化活性。方法 以宁夏枸杞为试验材料 , 采用
组织分离法从其茎 、叶 、果实中分离内生真菌 ,依据形态进行初步鉴定;随机选择 4株内生真菌 , 采用 Fenton反应清除测
定羟自由基(· OH)活性。结果 从宁夏枸杞表面消毒的茎 、叶和果组织块中 , 共分离出内生真菌 104株 , 茎中分离出 42
株 , 占 40.3%,叶中分离出 36株 , 占 34.6%,果实中分离出 26株 , 占 25%。对产孢的 67株进行初步鉴定 , 分类为 2纲 3
目 5科 7属 , 其中青霉属(Penicillium)12株 ,占 17.9%;黑葱花霉属(Periconia)5株 , 占 7.5%;链格孢属(Alternaria)26株 ,
占 38.8%;镰孢霉属(Fusarium)5株 ,占 7.5%;曲霉属(Aspergillus)13株 , 占 19.4%;枝梗茎点霉属(Dendrophoma)3株 ,
占 4.5%;根霉属(Rhizopus)3株 , 占 4.5%;其中链格孢属(Alternaria)为优势菌群。 4株枸杞内生真菌发酵产物都对
· OH自由基有清除作用。结论 内生真菌普遍存在于宁夏枸杞组织内 ,是一大类具有抗氧化活性的生物资源。
关键词:宁夏枸杞;　内生真菌;　抗氧化
DOI标识:doi:10.3969 /j.issn.1008-0805.2011.04.033
中图分类号:R284.2　　文献标识码:A　　文章编号:1008-0805(2011)04-0857-03
IsolationandDeterminationofAntioxidantActivityofEndophyticFungifrom Lycium
barbarum
LIUJian-li
(ColegeofBiologicalSciencesandEngineering, NorthUniversityforEthnics, Yinchuan, Ningxia750021, China)
Abstract:ObjectiveToisolateanddetermineantioxidantactivityofendophyticfungifromthehealthystems, leavesandfruits
ofLyciumbarbarum.MethodsTheendophyticfungiwereisolatedbyusingtissueisolationmethodfromthestems, leavesand
fruitsofLyciumbarbarumandidentifiedpreliminarilybasedonmorphologicalcharacteristics.Thescavengingactivityagainst· OH
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LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH2011VOL.22NO.4 时珍国医国药 2011年第 22卷第 4期