全 文 ：满江红茎尖组培苗外观形态及生理生化特性变化
徐国忠 , 姚宇红 , 陈炳焕
(福建省农业科学院红萍中心 , 福建　福州　 350013)
摘　要: 采用 0. 1% HgCl2表面消毒 , 剥离 1. 0～ 1. 5 mm大小的茎尖进行组培 , 在 25℃ , 5 000～
7 000 lx下培养 30 d便可获得稳定的蕨藻共生的满江红植物体 ,该组培苗植株形态、叠生状态、叶
面、 叶缘颜色、 外观形态和生物量等生物学指标以及固氮酶活性、 酯酶同工酶、 红萍体内鱼腥藻
单克隆抗体等生理生化测定表明 , 它与出发萍体间没有本质差异 , 因此并没有发生变异 , 实验结
果表明 , 满江红茎尖组培是一种新的、 可靠的品种保存途径。
关键词: 满江红 ; 茎尖组培 ; 生态学 ; 生理生化 ; 特性
中图分类号: S 555. 1 文献标识码: A
Relationship between tip culture of Azolla and its variation in some morphological ,
biochemical and physiological characters
XU Guo-zhong , YAO Yu-hong , CHEN Bing-huan
(National Azolla Research Center , Fujian Academ y of Agricultural Sciences, Fuzhou, 350013)
Abstract: The tissue culture of Azolla tips cut in 1. 0- 1. 5 mm and surface disinfected by 0. 1% HgCl2
w as car ried out under 5000- 7000 lx , 25℃ condition. Th e Azolla plants with stable fern-algae
association w ere obtained after a 30-day cultiv ation. The results of observa tion on appearances
including plant mo rpho log y, ov er-lapped condition, co lour o f leaf surface and edge, biomass for
biological index and N-fixing activities, esterase isoenzyme, monoclonal antibodies to Anabaena Azolla
in Azolla fo r phy sio logica l and bio chemical determennation showed that, the plants f rom Azolla tip
cultur e have no essentia l v ariation to compare with the co rresponding conventional species. The
experiments also rev ealed that th e tissue cultur e for Azolla tips w as a new and reliable w ay to
maintain the Azolla germplasm.
Key words: Azolla; Shoo t tip culture; Morpholog y; Physiolog y and biochemistry; Character
满江红俗称红萍 , 是一种固氮蓝藻和水生蕨类共生的植物 , 在农业上常作为绿肥广泛应
用 [1 ] , 近年来 , 满江红已应用到作为饲料、 饵料甚至医药上。满江红品种繁多 , 目前我中心资
源圃已征集保存了世界各国及全国各地的 500多个满江红品系。 由于满江红的有性孢子果并
不是所有的品系都能采集到 ,人工诱导结孢的技术尚未成功 [2 ] ,因此保存满江红品系多采用无
性营养体繁殖法 , 茎尖组培法是在该方法基础上发展起来的 , 它能降低保存的难度 , 保持品
系的纯度 , 并节省工作量。满江红茎尖组培法首先由白克智等于 1979年应用于获取无藻萍的
实验 ,并未对茎尖组培法的保存效果进行研究 [2 ] ,到目前为止尚未有对茎尖组培保存后满江红
的形态生理变化进行研究的报道。由于满江红具有共生植物的特殊性 , 其蕨藻关系在长期的
进化中形成一个和谐的整体 [2 ] ,因此组培后是否会发生形态生理变化需要加以深入的探索 ,本
福建农业学报 14(增刊 ): 148～ 153, 1999
Fujian Journal of Agricultural Sciences
文章编号: 1008- 0384( 1999) S0- 0148- 06
文就此问题进行了多品种间的对比研究。
1　材料和方法
1. 1　满江红茎尖组培　将满江红萍体置小纱布袋中用自来水冲洗 30 min, 后用 0. 1% HgCl2
浸泡 3～ 5 min, 取出后用无菌水冲洗 10余次 ,消毒后的萍体转移到灭菌的铺有干滤纸的培养
皿中吸去多余水分 , 然后在解剖镜下剥离茎尖 , 用解剖针剥取 1. 0～ 1. 5 mm大小的茎尖 , 接
种于灭菌过的含 15 m l 6302液体培养基的 25 m l小三角瓶中 , 置于 25℃、 5 000～ 7 000 lx光
强的培养室内培养保存。
1. 2　满江红组培苗的形态观察及生理生化测定
1. 2. 1　观察材料的选取　从国家红萍中心的资源中保存的 300多个茎尖培养的满江红品种
(系 ) 中选取以下 4个品系 (表 1) , 并以常规温室中选取相对应的品系作为对照。
表 1　供试品种 (系 )名单
Table 1　 List of Azolla species ( strains) in the test
品种 (系 ) 　学 　　 名 国际水稻所编号 引进时间
(年份 )
细绿萍 A . f il iculoides Colombia 1020 1987
墨西哥萍 A .mex icana Guayana 2003 1984
卡州萍 A . carol iniana USA 3001 1984
小叶萍 A .microphylla Paraguay 4018 1984
1. 2. 2　形态观察　在相同的自然条件下 ,将 4种组培苗与对照进行培养 ,定期用解剖镜和肉
眼观察其萍体形态 , 萍体、 叶缘颜色等周年的形态学变化。
1. 2. 3　生物量测定　在 25℃温室内 , 将组培苗和对照进行预培养 , 待生长一致后在 yoshida
培养液中进行正式测定 , 每品系放萍量为 1 g , 培养 7 d后测定各品系的生物量。
1. 2. 4　固氮酶活性测定　采用乙炔还原法 [ 3] , 25℃温度下 , 在大三角瓶 ( 250 ml) 中 , 加入
50 m l培养液 , 放入 1 g量的红萍 , 软木塞塞上 , 抽取空间体积 1 /10, 注入等体积的乙炔 , 在
8 000 lx光照下充分反应 20 min, 然后抽取 10 ml的混合气体 , 注入准备好的血清瓶内 (血清
瓶内抽取真空 ) , 利用 102 G气相色谱仪进行测定。
1. 2. 5　同工酶测定　采用酯酶同工酶进行酶谱分析 [2 ] , 取 1 g鲜萍 (去根、 冲洗干净、 滤纸
吸干 ) , 加 1 ml电泳缓冲液 ( Tris 6 g , 甘氨酸 28. 8 g溶于 1 L水中 , p H8. 3) 进行研磨 , 纱
布过滤入小试管 , 再以 8 000 r· min- 1离心 5 min, 上清液置冰箱备用 , 取 100μl样品进行电
泳 , 电泳后 , 取出凝胶 , 用蒸馏水冲洗后浸入酯酶染色液中 , 在 37℃下反应 30 min, 显色后
用蒸馏水清洗干净 , 保存在清水中以备观察、 拍照或扫描 , 然后制成干片保存。
1. 2. 6　单克隆抗体测定　试验用单克隆抗体荧光素标记物 C16 -FITC ( 1∶ 100) R1-FITC
( 1∶ 100) [4 ]对 4个品种 (系 ) 的组培苗和常规对照品种的体内鱼腥藻进行抗原性鉴定。
2　结果分析
2. 1　满江红茎尖组培保存　 按茎尖组培法剥离的满江红茎尖 , 在 25℃、 5 000～ 7 000 lx光
149增 刊 徐国忠等: 满江红茎尖组培苗的外观形态及生理生化特性变化
照下进行培养 , 经过 20 d左右就可长成整朵的萍体 , 30 d左右把长成的萍体用无菌操作方法
转入灭菌的含 50 m l 6302液体培养基的 100 ml三角瓶中继续培养保存 ,液体培养时 ,每隔 40
～ 45 d更换一次培养液。当改为含 0. 5%琼脂的半固体培养基时 , 可延长为 150～ 180 d更换
一次。 因为红萍为水生植物 , 当采用半固体培养基时 , 由于缺乏水表面张力 , 满江红品种的
侧枝断离速率下降 ,这样可抑制红萍的生长 , 由原来的 3～ 4 d产量翻一翻 ,变成 20多 d翻一
翻 , 其衰退进程也减缓。因此便可延长其保存时间 , 进行满江红种质资源的长期保存。
2. 2　满江红茎尖组培后的形态特征变化情况　满江红茎尖组培苗长成的萍体与相应对照萍
体的形态学观察情况列于表 2。观察结果表明 ,无论是植株的生长形态 ,还是其生长叠生情况
以及品种叶的颜色和叶缘颜色 , 茎尖组培苗长成的萍体与原出发萍一致 , 具有各品种的典型
生物学特征。
表 2　满江红茎尖组培 ( TC)与常规培养 ( CK)后红萍形态特征比较
Tabl e 2　 Comparison of morphological characters of the Azolla plants f rom tissue culture of t ips(TC)
and conventional cult ivat ion(CK)
品 种 (系 ) 植株基本型 植株形态 叠生情况 叶的颜色 叶缘颜色
1020( TC) 长方形、近圆形 平面浮生、 直立 基本无 深绿色 白色
1020( CK) 长方形、近圆形 平面浮生、 直立 基本无 深绿色 白色
2003( TC) 多边形、三角形 平面浮生 有、厚 浅绿色 红色
2003( CK) 多边形、三角形 平面浮生 有、厚 浅绿色 红色
3001( TC) 近圆形、卵圆形 平面浮生 有、深厚 深绿色 深红色
3001( CK) 近圆形、卵圆形 平面浮生 有、深厚 深绿色 深红色
4018( TC) 三角形、多边形 平面浮生 基本无 黄绿色 白色
4018( CK) 三角形、多边形 平面浮生 基本无 黄绿色 白色
2. 3　满江红茎尖组培后生物量的变化情况　生物量的测定值 ,用各处理平均数间极差方式统
计并列于表 3, 细绿萍 1020、 墨西哥萍 2003、 卡州萍 3001、 小叶萍 4018, 它们的茎尖组培苗
和常规对照萍体生物量测定平均值分别为: 3. 81和 3. 83、 3. 60和 3. 55、 3. 18和 3. 27、 2. 47
和 2. 53。其中 2003、 3001、 4018的茎尖组培苗的生物量略低于常规培养 , 而 2003的茎尖组
培苗生物量略高于常规培养 , 采用方差分析各处理间相互比较的邓肯复全距测验进行显著性
分析 [ 5] ,从表 3中可以看出 ,它们的茎尖组培苗和常规对照培养萍体生物量之间都无显著性差
异 , 说明茎尖组培不会影响满江红品种 (系 ) 的生物量。
2. 4　满江红茎尖组培后固氮酶活性变化情况　固氮酶活性的测定值 ,用各处理平均数间极差
方式统计并列于表 4, 细绿萍 1020、 墨西哥萍 2003、 卡州萍 3001、 小叶萍 4018, 它们的茎尖
组培苗和常规对照培养的固氮酶活性分别为: 2. 017和 1. 863、 1. 977和 1. 687、 2. 213和
2. 049、 1. 785和 1. 653。茎尖组培苗的固氮酶活性都略高于常规培养 , 用方差分析各处理间
相互比较的邓肯复全距测验进行显著性分析 [5 ] (表 4)可以看出 , 它们的茎尖组培苗和常规对
照培养之间都无显著性差异 , 说明满江红茎尖组培不会影响其品种 (系 ) 的固氮酶活性。
150 福建农业学报 第 14卷
表 3　满江红各处理生物量平均数间极差
Tabl e 3　 The l imit division of averaged biomass production among various Azolla treatments
品　种
(系 )
生物量平均值
( g)
差　　　别
1020( CK) 3. 83
1020( TC) 3. 81 0. 02
2003( TC) 3. 60 △ △
2003( CK) 3. 55 △ △ 0. 05
3001( TC) 3. 27 △ △ △ △
3001( CK) 3. 18 △ △ △ △ 0. 09
4018( CK) 2. 53 △ △ △ △ △ △
4018( TC) 2. 47 △ △ △ △ △ △ 0. 06
　　注: k= 2时 LSR0. 05= 0. 943。 k= 8 7 6 5 4 3 2
　　
表 4　 满江红各处理固氮酶活性平均数间极差
Table 4　 The limit division of averaged N-f ixing activit ies among various Azolla treatments
品　种
(系 )
固氮酶活性
(μmol· g- 1· h- 1) 差　　　别
1020TC 2. 017
1020( CK) 1. 863 0. 154
2003( TC) 1. 977 △ △
2003( CK) 1. 687 △ △ 0. 290
3001( TC) 2. 213 △ △ △ △
3001( CK) 2. 049 △ △ △ △ 0. 164
4018( TC) 1. 785 △ △ △ △ △ △
4018( CK) 1. 653 △ △ △ △ △ △ 0. 132
　　　注: k= 2时 LSR0. 05= 0. 943。 k= 8 7 6 5 4 3 2
2. 5　满江红茎尖组培后同工酶酶谱变化情况　从图 1可以看出 , 细绿萍 1020组培苗具有细
绿满江红特征谱带 11和 20两条谱带 ,因而具有细绿萍满江红品种同工酶的基本酶谱特征 ,同
时还有 1、 4、 7三条非特征谱带 , 与对应的常规萍种相比 ,虽然组培苗多了一条 7号谱带 , 但
与种性无关。墨西哥萍 2003与小叶萍 4018也有类似的情况。与对应常规品种 3001相比 , 卡
州萍 3001组培苗具有所有特征谱带 ( 12、 17、 16)与非特征谱带 ( 2、 5) , 说明组培后的 3001
卡州萍品种的同工酶所代表的种性未发生任何变化。
2. 6　满江红茎尖组培后其共生藻的单克隆抗体检测情况　单克隆抗体检验结果 (表 5)表明 ,
细绿萍 1020、 墨西哥萍 2003、 卡州萍 3001、 小叶萍 4018组培后的萍体 , 其叶腔内的共生藻
与对应常规萍体内的共生藻具有同样的抗体反应特征 , 说明共生植物满江红组培后 , 其体内
鱼腥藻还是原来的共生藻类型 , 其抗原特性没有发生变化。
151增 刊 徐国忠等: 满江红茎尖组培苗的外观形态及生理生化特性变化
图 1　 满江红茎尖组培与常规培养的酯酶同功酶酶谱比较
Fig. l　 The zymographic comparison to the Azolla plants from tip culture and conventional cultivation
表 5　单克隆抗体 ( C16和 R1 )对不同方法培养的满江红体内鱼腥藻鉴定结果
Tabl e 5　 The result of monoclonal ant ibodies of Anabaena Azollae MCAB ( C16 and R1 ) reacted
to the algae from diff erent Azolla species
品种 (系 ) FA
C16 R1
1020( TC) + -
1020( CK) + -
2003( TC) - -
2003( CK) - -
3001( TC) + +
3001( CK) + +
4018( TC) - -
4018( CK) - -
3　结论和讨论
3. 1　满江红茎尖组培中应注意的几个问题　满江红茎尖组织培养已于 1979年 [3 ]获得成功 ,
但是由于满江红为共生植物 ,因此弄清该方法是否能保证蕨、藻两者均保持原有的生物学、生
理生化特性是茎尖组培用来保存种质资源的关键问题。 以前的研究者对于要剥取多大的茎尖
来保持其共生特性未有深入研究 , 一般只对剥取怎样的茎尖才能获得无藻萍感兴趣 , 其研究
结果认为 ,剥取的茎尖在 0. 5 mm左右时可以形成无藻萍 ,至于如何保持其共生特性没有深入
研究。综合 10多年的实践和上述试验 ,本人认为满江红剥取的茎尖在 1. 0～ 1. 5 mm时 ,可以
获得稳定的萍藻共生满江红 (表 6) , 茎尖太小难以成活且易于形成无藻萍 , 茎尖太大容易受
152 福建农业学报 第 14卷
污染 , 当茎尖为 1. 0～ 1. 5 mm时 , 其成活率最高。
表 6　 满江红不同茎尖大小组培结果的统计
Table 6　 The statistical results for the growing conditions of Azolla tissue culture in diff erent tip size
茎尖大小
( mm )
剥离茎尖数
(个 )
成活率
(% )
无藻萍
(个 )
污染率
(% )
0. 5～ 1 200 20 15 30
1～ 1. 5 300 60 0 35
1. 5～ 3. 0 220 31. 8 0 68. 2
3. 2　满江红茎尖组培可以用来保存满江红的种质资源　通过 1 a的萍体外观形态观察结果
表明 , 茎尖组培后其外观形态的一些基本特征未发生任何变化 , 说明满江红茎尖组培后 , 萍
体形态不会发生任何变化。 通过对满江红茎尖组培后的生物量、 固氮酶活性、 同工酶酶谱鉴
定、 单克隆抗体对其体内鱼腥藻的鉴定等生理性实验测定结果表明 , 其品种特性和共生藻都
保持原来的特征 , 未有变化 , 说明满江红茎尖组培可以用来保存满江红的种质资源 , 它是一
种既可靠又节省人力的以红萍无性繁殖保种的途径。
致　谢　单克隆抗体测定结果由原生物中心郑国铝同志测定提供 , 本文承蒙唐龙飞研究员审
阅、 斧正 , 在此一并表示感谢。
[参考文献 ]
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153增 刊 徐国忠等: 满江红茎尖组培苗的外观形态及生理生化特性变化