全 文 ：研究简报
满江红鱼腥藻遗传多样性的RAPD分析
陈　坚1 　郑伟文2 　宋铁英2 　徐国忠1 　唐龙飞1
(1.福建省农业科学院红萍研究中心 ,福州　350013;2.福建省农业科学院生物技术中心 ,福州　350003)
THE GENETICDIVERSITYOF ANABAENA AZOLLAE
BASEDON RAPD ANALYSIS
CHEN Jian1 , ZHENG Wei-Weng2 , SONG Tie-Ying2 , XU Guo-zhong1 and
TANG Long-fei1
(1.Azolla Research Center , Fujian Academy of Agr icul tural Sciences , Fuzhou 350013;
2.Biotechnology Research Center , Fuzhou　350003)
关键词:满江红鱼腥藻;满江红;遗传多样性;随机扩增多态 DNA
Key words:Anabaena azollae;Azolla;Genetic diversity;RAPD analysis.
中图分类号:Q949.2　　文献标识码:A　　文章编号:1000-3207(2001)05-0531-04
共生在水生蕨类植物满江红(又称“红萍” :Azolla)叶腔中的固氮兰细菌曾被认为是一个种满江红
鱼腥藻(Anabaena azollae Strasb.)。但由于现存的满江红在分类学上有 2 个亚属 , 7 个种[ 1] , 对不同满江
红叶腔中鱼腥藻的鉴别 ,多年来引起人们的重视。 80 年代 , 鱼腥藻的单克隆抗体和 RFLP 的研究 ,发现
了它与宿主分类上一定程度的对应关系[ 2 , 3] 。 90 年代以后 , Van Coppenolle和 Eskew 分别以 RAPD-PCR
和 DAF-PCR对从满江红共生体中提取的 DNA 进行了分析[ 4 , 5] , 但后者发现了共生体中藻的 DNA 对整
个 PCR产物的干扰作用会影响满江红属本身系统分类。近年来对满江红鱼腥藻的脂肪酸组分 , nif 基
因 RFLP和 STRR序列 PCR产物指纹分析 ,建立了各自的聚类分支图[ 6—8] , 其间的结果有所差异。为
此作者对征集的 16 种不同种属和地域来源的满江红叶腔中分离出来的鱼腥藻进行了 RAPD 分析 , 探讨
了满江红鱼腥藻的遗传多样性。
1　材料和方法
1.1　材料　满江红植物样本的来源见表 1。 　满江红无菌鱼腥藻的获得按文献[ 9] 方法 , 剥离及处理按
文献[ 7] 的方法进行。
1.2　RAPD分子标记　满江红鱼腥藻按[ 7] 法 , 取适量藻细胞直接进行 PCR反应。 PCR 扩增反应在
25μL 反应体系中进行:体系中包括 2.5μL 的 10XPCR反应缓冲液 , 200μmol/ L 的每种 dNTP , 10pmol的
收稿日期:2000-12-10;修订日期:2001-03-20
基金项目:福建省自然科学基金(编号 B9910024);福建省科技厅中—瑞国际合作研究计划资助
作者简介:陈　坚(1965—),男 ,福建省福州市人;副研究员;主要从事植物生理生化和分子生物学研究
第 25 卷 第 5 期
2 0 0 1 年 9 月
水 生 生 物 学 报
　 　 　 　 ACTA HYDROBIOLOGICA SIN ICA 　 　 　 　
Vol.25 , No.5
Sep ., 2 0 0 1 　
表 1　16种参试的满江红及其来源
Tab.1　16 Azolla accessions and their origins
样品号
Sample
No.
保存编号＊
Accession
code
来源地
Collection origin
现有植物分类状况
Taxonomic status
亚属
Subgenus
种(变种)
Species(Variety)
1
2
3
1001
1010
1043
前东德　Germany
秘鲁　Peru
巴西　Brazil
4
5
2002
2003
圭亚那　Guyana
6
7
3001
3501
美国　USA
哥伦比亚 Colom bia
8
9
4018
4060
巴拉圭　Paraguay
菲律宾　Philippines
三膘
(Azolla)
蕨状满江红
(A.f i liculoide)
墨西哥满江红
(A.mexicana)
卡洲满江红
(A.caroliniana)
小叶满江红
(A.m icrophyl la)
10
11
12
13
14
15
409
415
418
505
511
575
菲律宾　Philippines
泰国　Tai land
越南　Vietnam
福建莆田 Fujian Putian
福建宁德 Fujian Ninde
山东　Shang dong
16 7004 澳大利亚 Aust ralia
九膘
(Rhizosperma)
覆瓦状满江红
(A.imbricata var.)
羽叶满江红
(A.p innata var.)
　　＊为福建省农业科学院红萍研究中心资源圃编号　Accession code used by Azolla germplasm of Azolla research
center , FAAS.
随机引物 ,对文献[ 4] 中所用的全部22 种10-mer引物进行筛选 ,有 7种能对藻细胞进行较稳定的扩增反
应。其引物号和顺列为:OPA13 CAGCACCCAC;OPB07 GGTGACGCAG;OPB08 GTCCACACGG;
OPC05 GATGACCGCC;OPC07 GTCCCGACGA;OPC08 TGGACCGGTG;OPD07 TTGGCACGGG , 1 个
单位 TaqDNA 聚合酶(均购自上海 Sangon),并加入 1μL 的藻细胞。反应在 PTC-100热循环仪(MJ)中进
行 ,并按[ 7] 中程序进行 PCR扩增和电泳 , 在 Gel Doc 2000 凝胶成像系统(Bio-Rad)上观察并贮存图像 ,
用系统所带有的软件(Quantity One)进行带的识别和带型的定义比较 , 计算相似性系数(Dice系数)矩阵
SD ,建立 UPGMA 系统聚类分析树状图。
2　结果与分析
2.1　RAPD扩增状况　筛选出的 7个引物对16种满江红鱼腥藻有很强的扩增能力 ,共产生 106 条可区
分的带 ,其多态性位点的比例在 80%以上。如图 1 所示其中引物 OPB07 的扩增状况。
2.2　遗传关系　根据 7 个引物对 16 个样本的 RAPD-PCR产生的相似系数(Dice系数)建立起来的满江
红鱼腥藻的 UPGMA聚类树状图(图 2)可以看出:①三膘亚属和九膘亚属的满江红鱼腥藻之间存在明
显的遗传差异 ,差异率达 84%。 ②三膘亚属 9个样本的共生藻分为蕨状和卡洲萍及小叶与墨西哥萍 2
个类群组。来自菲律宾的小叶满江红(样品 9)的鱼腥藻变异较大。此外 , 2 个墨西哥萍品系(样品 4 , 5)
中的鱼腥藻也有较大差异(达 61%)。 ③九膘亚属 7 个样本的鱼腥藻对应宿主的 2 个变种 , 即覆瓦状满
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图 1　引物OPB07扩增的 16个满江红鱼腥藻的带型
(M 为 lamdaDNA/Hind Ⅲ分子量标记 ,1—16样品)
Fig.1　RAPD banding pattern of 16 accessions for Anabaena-azol lae amplifed
by primer OPB07(M as M W marker of lamdaDNA/ HindⅢ , Sample No.1-16 in Table)
江红(样品 10—15)和羽叶满江红(样品 16)明显分开。在 6 个来自不同地域的覆瓦状满江红鱼腥藻之
间 ,来自菲律宾(样品 10)的藻发生了明显的变异外 ,其余 5 个藻之间相似程度较高(0.71—0.89)。
图 2　基于 RAPD分析的满江红鱼腥藻 16个样本的 UPGMA 树状关系图
Fig.2　Dendrogram (UPGMA)based on RAPD for Anabeana-Azol lae from 16 Azol la accessions
3　讨论
Caudales根据不同种满江红叶腔内鱼腥藻的脂肪酸成分不同 , 提出了藻与宿主的共进化假说[ 8] 。
但迄今只有用 RFLP和 S TRR-PCR指纹法能将共生藻区分为三膘和九膘 2 个明显不同的类群。早期
F ranche用 ni fHDK 的 RFLP 可进一步将三膘分为 2 个亚组 , 一组包括蕨状和卡洲萍的藻 , 另一组包括
了小叶与墨西哥萍的藻[ 3] 。而后 Van Coppenolle用 nif 基因其它 3 个片段的 RFLP将 11 个满江红样本
的鱼腥藻分为与宿主分类大致相对应的 5 个类群 ,但却区别不出小叶 、卡洲和墨西哥萍的藻[ 6] 。直到近
5335 期　　　　　　　　　陈　坚等:满江红鱼腥藻遗传多样性的 RAPD 分析
来 ,Zheng用 ST RR-RCR鉴别出了参试 18 个样本的全部 7 种满江红的鱼腥藻 , 但同一个种内不同地域
来源的品系间的带型没有区别[ 7] 。通过对满江红鱼腥藻进行的 RAPD 分析 ,可以鉴别出参试的所有 16
个样本 ,具有更高分辨率 , 尽管从总体上看:满江红品系间共生藻的遗传多样性程度要小于满江红种间
及亚属间(如样品 1—3 , 样品 6—7 和样品 11—15), 但也揭示出了在某些满江红品系间 , 共生的鱼腥藻
存在较高程度的遗传多样性。推测这种遗传上的分化有地理分隔的因素 ,如征集于菲律宾群岛的小叶
萍和覆瓦状萍中的共生藻(样品 9 和 10)在同类群中均表现出明显变异。但也不排除地域相近不同种满
江红 ,其共生藻间相互侵入的因素 , 如源于南美圭亚那的墨西哥萍品系中可能渗入了小叶萍的共生藻。
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