全 文 ：收稿日期:2014 － 01 － 16．
作者简介:廖兆贵(1975 － ) ，男，主要从事现代农业科技的研究．
零余子黄酮类化合物的提取工艺优化及初步分离
廖兆贵
(恩施市舞阳农业服务中心，湖北 恩施 445000)
摘要:探讨了零余子黄酮的提取工艺，最佳纸层析展层剂，利用正交实验对黄酮的醇提工艺进行优化，利用纸层析
对零余子粗黄酮进行分离纯化，通过紫外灯下荧光颜色观察层析结果．结果发现零余子黄酮用 80%的乙醇溶液，在
75℃条件下回流时间 3 h，回流次数 3 次的提取效果最好，最大得率为 5． 494 mg /g，平均回收率为 99． 41% ．纸层析的
最佳展层剂为甲醇∶ 冰醋酸∶ 水(20∶ 15∶ 85) ，通过对紫外荧光斑点检测，可将零余子黄酮分成 4 种物质．
关键词:零余子;黄酮;提取;纸层析;展层剂
中图分类号:TS201． 1 文献标志码:A 文章编号:1008 － 8423(2014)01 － 0043 － 04
Study on the Extraction Technology Separation and Purification
of Flavonoid from Yams Bubil
LIAO Zhao － gui
(Wuyang Agricultural Service Center of Enshi，Enshi 445000，China)
Abstract:The flavonoids extraction process and the optimal chromatogram solution for paper chromato-
graph were studied． With the orthogonal experiment，the extraction technology was optimized． At the
same time the flavonoids were separated and purified with the paper chromatograph，and the chroma-
tographits results were obtained through fluorescent color under the ultraviolet． The results showed that
with 80 percent of the alcohol solution，at 75 ℃，extracting time 3 hours，returning three times，the best
and biggest of bulbil flavonoids was 5． 494 mg /g． and the average recovery rate was 99． 41% ． The opti-
mal chromatogram solution was methanol:acetic acid:water(20∶ 15∶ 85) ，and the flavonoid from Yams
bubil were separated into four kinds of substance．
Key words:yams bulbil;flavonoid;extraction;paper chromatograph;chromatogram solution
零余子为薯蓣科植物薯蓣(Dioscoreaopposita Thunb．)叶腋间的珠芽［1 － 2］，俗称“山药豆”，呈卵圆形或椭
圆形，直径约 0． 4 ～ 2cm，外表皮淡黄色，有细皱纹，顶端中间略有茎痕，质坚硬，断面黄褐色角质样，亦有光
泽．气味淡而不苦，口嚼粘腻，零余子含有 16 种氨基酸、胆碱、尿素、植酸、多种维生素、淀粉酶、山药素等物
质，自古就是营养价值很高的滋补食品和药用价值很高的药材，可食用，还具医疗价值．
植物黄酮含量测定中最为关键的一步是黄酮的提取，不同的溶剂对不同植物黄酮的提取能力又有明显
的不同，因而提取溶剂的选择至关重要［3］．黄酮类物质的分离纯化的方法有很多，有大孔树脂的柱层析、纸
层析、高效液相色谱技术等，但纸层析是黄酮类物质的传统而适应面广的一种纯化技术．通过资料检索发现，
目前对零余子的研究报道较少，而对其黄酮的研究未见报道，同时现已证实，黄酮类化合物具有多种生理功
能和药用价值［4 － 5］，因此本文主要对零余子的黄酮的提取工艺及初步分离进行了探讨．
1 材料与方法
1． 1 试验材料
零余子粉:经干燥粉碎后过 40 目筛收集于棕色试剂瓶中，备用．
1． 2 试验试剂
芦丁标准品(≥95%)、无水乙醇、甲醇、丙酮、亚硝酸钠、硝酸铝、正丁醇、冰醋酸、异丙醇、浓氨水以上试
剂均为分析纯(国药集团化学试剂有限公司)．
第 32 卷第 1 期 湖北民族学院学报(自然科学版) Vol． 32 No． 1
2014 年 3 月 Journal of Hubei University for Nationalities(Natural Science Edition) Mar． 2014
DOI:10.13501/j.cnki.42-1569/n.2014.01.013
1． 3 仪器设备
UV1900PC紫外光谱仪(上海亚研电子科技有限公司) ;旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂) ;SHZ － CB
型循环水式多用真空泵(河南巩义市英裕予华仪器厂) ;电子恒温水浴锅(深圳国华仪器厂) ;FA2104 电子天
平(上海天平仪器厂) ;800B离心机(上海安亭仪学仪器厂) ;85 － 2 恒温磁力搅拌机(江苏中大仪器厂) ;紫
外灯;层析缸等．
表 1 因素水平表
Tab． 1 The factors and levels
水平
A乙醇
浓度 /%
B回流
时间 /h
C回流
次数
D提取
温 /度℃
1 60 2 1 65
2 70 3 2 75
3 80 4 3 85
1． 4 试验方法
1． 4． 1 薯蓣零余子黄酮化合物的溶剂优化 称取三份零余子粉，各 0． 5 g，分别按料液比为 1∶ 20 加入 60%
甲醇，60%乙醇，60%丙酮进行回流提取，提取时间为 2 h，提取次数为 1 次，提取温度为 75℃ ．将提取液离心
(4 000 r /min，15 min) ，收取上清液定容至 50 mL，取 2 mL测定吸光度值，确定最佳提取溶剂．
1． 4． 2 零余子黄酮的提取工艺优化 以乙醇为溶剂，选择提取温度、溶剂的体积分数、回流时间、回流次数
4 个因素，料液比均为 1∶ 20，采用 L9(3
4)正交设计，从而对其提取条件进行优化，因素和水平见表 1．
提取时准确称取 0． 5 g的零余子粉 9 份按正交设计表分别提
取，将提取液过滤，离心，定容后测定吸光度值［6］．
1． 4． 3 黄酮的测定方法 标准曲线的制作:配制浓度为 1． 0 mg /
mL的芦丁标准溶液，吸取 0． 0、0． 2、0． 4、0． 6、0． 8、1． 0 mL 芦丁标
准溶液(相当于 0． 0、0． 2、0． 4、0． 6、0． 8、1． 0 mg 芦丁)分别置于 10
mL容量瓶中，再加 5%亚硝酸钠溶液 0. 3 mL，摇匀，加 10%硝酸铝
溶液 0． 3 mL，摇匀，加入 4%氢氧化钠溶液 4 mL，再加乙醇稀至刻度，摇匀，放置 12 min后，用 1 cm比色皿，在
波长 510 nm处测定吸光度 A［7］．以芦丁含量(mg)为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，用最小二乘法
进行线性回归，得到回归方程 A = 0． 006 5 + 1． 005 7C，r = 0． 999 8．
薯蓣零余子黄酮的测定:将提取液离心(4 000 r /min，15 min) ，定容至 50 mL的棕色容量瓶，移取 2 mL提
取液入 10 mL容量瓶中，测定方法同标准曲线，根据回归方程计算测试液中黄酮含量 C(mg) ，则样品中黄酮
含量计算式为:
黄酮含量 C(mg /g)= A510 － 0． 0065W × 1． 0057 × V × T
其中:T为为供试液总量(mL) ;V为测定时吸取的样品量(mL) ;W为样品重量(g)．
1． 4． 4 回收率试验［8］ 取 3 个 10 mL容量瓶，在已知黄酮含量的提取液中分别加一定体积的 1． 0 mg /mL芦
丁标准对照品溶液，分别测其黄酮含量，根据所测得的黄酮量减去提取液中黄酮含量，再除以加标量即可计
算回收率．
1． 4． 5 零余子黄酮的纸层析分离纯化 试验选取三种不同的展层剂，第一种为双向纸层析［9 － 10］:
1)第一展开剂为正丁醇∶ 冰醋酸∶ 水 = 3∶ 1∶ 1，第二展开剂 15%醋酸(HOAC) ，取浓缩液 10 μL，将其
点析滤纸(16 cm × 16 cm)右下角距层析纸两边距离各 3． 5 cm 处，反复点样，吹干，使其直径控制在 3 mm 左
右．将点好样品的层析纸放入盛有第一展开剂的层析缸中，采用上行法，使样品斑点与展开剂液面相距 1 cm
左右．盖好层析缸，当展开剂的前沿上行至距纸边约 3 cm 左右时，取出层析纸晾干． 将风干的层析纸旋转
90℃，放入盛第二展开剂的层析缸中，方法同上．
2)第二种展层剂为甲醇∶ 水∶ 异丙醇 = 20∶ 1∶ 3［11］，取浓缩液 10 μL，点样于新华慢性层析纸上，直至
在紫外灯下呈 1 cm的绿色斑点为止．将层析纸放入层析缸内展开．当溶剂前沿到达离层析纸前沿约 3 cm 时
将层析纸从缸中取出，用铅笔标出溶剂前沿，再将其吹干．
3)第三种展层剂为甲醇:冰醋酸:水 = 20∶ 15∶ 85，点样和展层方法同第二种．
1． 4． 6 紫外灯检查 将得到的干燥的层析纸先在紫外灯下观察，纪录观察结果，而后用氨气熏，将盛有浓氨
水的 100 mL广口瓶的瓶口与每个斑点接触约 5s，再于紫外灯下观察，纪录其颜色变化［10］．
1． 4． 7 黄酮体比移值 Ｒf的测定 将在紫外灯下有荧光的斑点用铅笔一一标点，并用刻度尺量取原点到每
一个荧光斑点圆心的距离和原点到溶剂前沿的距离．计算比移值 Ｒf．
比移值 =原点到黄酮体斑点中心的距离 /原点到溶剂前沿的距离
44 湖北民族学院学报(自然科学版) 第 32 卷
图 1 不同浸提溶剂对黄酮得率的影响
Fig． 1 The influence of bleaching solvent on the flavonoid yield
图 2 各因素水平的直观效果图
Fig． 2 The visual chart of all factors and levels
表 3 正交实验方差分析表
Tab． 3 The analysis of variance of the orthogonal experiment
因素 类型
III的
方差和 df 均方差 F Sig．
A 3． 692 2 1． 846 375． 0570． 000
B 0． 606 2 0． 303 61． 6030． 000
C 0． 448 2 0． 224 45． 5360． 000
D 2． 544 2 1． 272 258． 4070． 000
差错 0． 089 18 0． 005
合 541． 157 27
Corrected Total 7． 3790 26
2 结果分析
2． 1 零余子黄酮化合物的提取溶剂优化
由图 1 可以看出，不同的提取溶液对黄酮的提
取有一定的影响，实验结果表明甲醇的提取黄酮能
力最低，而丙酮的其次，乙醇的提取效果最好．
2． 2 零余子黄酮的提取工艺优化
试验选取乙醇浓度(A)、回流时间(B)、回流次
数(C)、回流温度(D)四个因素进行 L9(3
4)正交实
验，具体结果见表 3，试验结果进行极差分析和方差分析．
表 2 L9(3
4)黄酮提取的正交试验结果
Tab． 2 The results of orthogonal experiment
序号 A B C D 得率 1/(mg·g －1)
得率 2
/(mg·g －1)
得率 3
/(mg·g －1)
平均得率
/(mg·g －1)
1 1 1 1 1 3． 058 3． 107 3． 306 3． 157
2 1 2 2 2 4． 350 4． 350 4． 350 4． 350
3 1 3 3 3 4． 350 4． 300 4． 400 4． 350
4 2 1 2 3 4． 649 4． 549 4． 599 4． 599
5 2 2 3 1 4． 450 4． 400 4． 350 4． 400
6 2 3 1 2 4． 599 4． 698 4． 649 4． 649
7 3 1 3 2 4． 947 4． 947 5． 096 4． 997
8 3 2 1 3 5． 046 5． 146 4． 946 5． 046
9 3 3 2 1 4． 599 4． 450 4． 450 4． 499
K1 3． 950 4． 251 4． 281 4． 019
K2 4． 549 4． 598 4． 482 4． 664
K3 4． 847 4． 498 4． 581 4． 664
Ｒ 0． 897 0． 347 0． 297 0． 645
以 K值作各因素不同水平的黄酮得率的直观效果图，见图 2．
采用 SPSS 11． 5 软件对表 3 实验数据进行方差分析，结果见表 3．
由表 3 的极差分析可以得出黄酮化合物的最佳工
艺是 A3B2C3D2，结合表 4 的方差分析可以看出影响其
表 4 各个因素的各水平显著性分析
Tab． 4 The significant analysis of different levels
因素水平 N 分组1 2 3 因素水平 N
分组
1 2 3
1． 00 3． 957 8 1． 00 4． 272 2
A 2． 00 9 4． 528 9 C 2． 00 9 4． 486 7
3． 00 4． 852 2 3． 00 4． 580 0
Sig． 1． 000 0 1． 000 0 1． 000 0 Sig． 1． 000 0 1． 000 0 1． 000 0
1． 00 4． 246 7 3． 00 4． 012 2
B 2． 00 9 4． 484 4 D 1． 00 9 4． 660 0
3． 00 4． 607 8 2． 00 4． 666 7
Sig． 1． 000 0 1． 000 0 1． 000 0 Sig． 1． 000 0 0． 978 0

54第 1 期 廖兆贵:零余子黄酮类化合物的提取工艺优化及初步分离
得率的主次因素是 A ＞ D ＞ B ＞ C，即乙醇的浓度最为显著，其次是提取温度，回流时间和回流次数．随着溶液
浓度的提高和回流次数的增加，黄酮得率提高，随着回流时间的增加得率先是较大幅度的提高而后有小幅下
降，而提取温度的增加先使得得率有所增加，但到 75℃后影响不大．表 5 中各个因素水平的方差分析表也说
明 A、B、C三因素的各个水平间差异非常显著，而 D因素的 2、3 水平间差异不显著．验证试验得出薯蓣零余
子黄酮得率最高为 5． 494 mg /g．
2． 3 回收率实验
回收率是判断分析结果的量化指标，也是重要的质控手段，为了衡量零余子前处理过得和测试过程中黄
酮类物质的保留情况，本文进行了回收率的测定，具体见表 6．由表 6 可见，回收率为 98% ～102%，说明样品
处理及测试方法可行．
表 6 零余子黄酮含量回收率试验
Tab． 6 Ｒecovery experiment results of flavonoid levels from Yams bubil
样品 测定值 /mg 加标量 /mg 加标后测定值 /mg 回收率 /% 平均回收率 /%
1 0． 559 6 0． 408 5 0． 962 5 98． 63
2 0． 522 2 0． 405 7 0． 932 7 101． 18 99． 41
3 0． 359 9 0． 405 7 0． 759 2 98． 42
图 3 零余子黄酮的纸层析
Fig． 3 The paperchromatograph
map of flavonoids
2． 4 零余子黄酮的初步分离
经过对不同的展层剂系统的层析纸荧光斑点的观察，双向纸层析和
甲醇:水:异丙醇系统层析的荧光斑点呈现一条黄绿色光带，而甲醇:冰醋
酸:水系统层析的荧光斑点均匀分布并呈现不同的颜色，具体结果见图
3，故选用甲醇:冰醋酸:水为最佳展层剂．
以甲醇∶ 冰醋酸∶ 水(20∶ 15∶ 85)为纸层析的溶剂系统，经纸层析
并于紫外灯下检查，以乙醇提取的黄酮被分离为 4 部分，第 1 部分显紫红
色，2，3 部分呈较淡的黄绿色，第 4 部分显黄绿色，氨气熏蒸后荧光颜色
均不变，比移值分别是 Ｒf1 = 0． 096，Ｒf2 = 0． 280，Ｒf3 = 0． 592，Ｒf4 =
0. 771．
3 结论
1)零余子黄铜提取的最佳提取溶液为乙醇，乙醇提取零余子黄酮的
最佳提取工艺是用 80%的乙醇，回流时间为 3h，回流次数为 3 次，提取温
度为 75 或 85℃，最大得率为 5． 494mg /g．此时平均回收率为 99． 41%
2)采用纸层析对零余子黄酮进行分离纯化，最佳展层剂为甲醇:冰醋酸:水 = 20:15:85，可将零余子黄酮
分离为四种成分，但这四种成分的具体性质还有待于研究．
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责任编辑:高 山
64 湖北民族学院学报(自然科学版) 第 32 卷