全 文 ：收稿日期:2002-07-18;修回日期:2002-11-27
基金项目:国家自然科学基金(39970481)资助
＊通讯作者:E-mail:jhguo@njau.edu.cn
作者简介:葛芸英(1977-),女 ,江苏丹阳人 ,硕士 ,从事植物相关细菌的分子检测研究。E-mail:easygyy@yahoo.com.cn
植物病理学报
ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA　33(3):198-202(2003)
小麦苗枯病菌的 ITS分析及 PCR检测
葛芸英 , 郭坚华＊
(南京农业大学植物保护学院植物病理系 , 南京 210095)
摘要:小麦苗枯病菌(Clavibacter fangii , Cf)是引起小麦细菌性苗枯病的病原 , 本研究用 16S～ 23S rDNA 间的内源转录间隔区(inter-
nally transcribed spacer , ITS)序列通用引物 L1(5-AGTCGTAACAAGGTAGCCGT-3)和 L2(5-GTGCCAAGGCATCCACC-3)扩增 Cf和其它
相关细菌的基因组 DNA;并对其 PCR产物进行回收 、克隆和测序 , 将所获序列和其它已报道的细菌 ITS 序列进行多重比较后设计
出Cf的特异性引物 I1(5-TGCCAAGTCACACTGAGACGA-3)和 I2(5-CAATGATCTACCACCCTCCGA-3)。此引物可以从 Cf中扩增出 351
bp 的特异性片段 ,而其余参试的 21个细菌 PCR反应结果均为阴性。该方法可以应用于小麦苗枯病菌的快速 、可靠检测。此外 ,
本研究对多种植物病原棒形杆菌的 ITS 序列进行比较研究 , 发现其具有一定的分类意义。
关键词:小麦苗枯病菌;ITS 分析;分类;检测
Analysis of ITS sequence and PCR protocol for the detection of Clavibacter fangii , the causal agent
of wheat seedling wilting disease　GE Yun-ying , GUO Jian-hua　(Department of Plant Pathology , College of Plant Protection , Nan-
jing Agricultural University , Nanjing 210095, China)
Abstract:A polymerase chain reaction(PCR)protocol was developed to specifically detect Clavibacter fangii (Cf), the
causal agent of wheat seedling wilting disease.Generic PCR products from the internally transcribed spacer(ITS)region of
16S-23S ribosomal DNA of Cf and other two related bacteria were cloned and sequenced.Based on a multiple sequences
alignment among these obtained sequences , a pair of Cf-specific PCR primers I1(5-TGCCAAGTCACACTGAGACGA-3)/ I2
(5-CAATGATCTACCACCCTCCGA-3)were designed.These two oligonucleotides allowed specific amplification of a 351 bp
DNA product from genomic DNA samples of Cf strains ,but not from other 21 bacterial isolates tested.The PCR protocol pro-
vides a rapid and reliable tool for routine detection and identification of Cf.In addition , the classification implication of ITS
sequence homology was first found in bacteria by comparing sequences from Clavibacter spp.and Rathayibacter tritici .
Key words:Clavibacter fangii ;ITS analysis;classification;detection
中图分类号:S435.121.4　　　文献标识码:A　　　文章编号:0412-0914(2003)03-0198-05
　　小麦苗枯病是 1987年刘庆都等[ 1]发现和鉴定的
小麦上一种新病害 , 其病原菌为 Clavibacter fangii
(Cf)。此病害早春发生 ,主要症状表现为幼苗心叶受
害 ,初期新叶水渍状 ,上部稍发黄 ,继之整个新叶变
黄 ,最后新叶枯死 ,引起死苗或不能抽穗 ,田间小麦发
病率可达 10%左右[ 1] 。本研究依据 ITS 序列多态性
找出了可用于 Cf检测的特异性引物 ,为 Cf 快速准确
的检测提供了必要基础;另外对 ITS 序列用于细菌分
类研究进行了初步探讨。
1　材料和方法
1.1　参试菌株
用于测序的细菌包括 Cf 、番茄溃疡病菌和小麦
拉氏杆菌;用于 PCR扩增的还包括其它植物病原细
菌属的模式种 、大肠杆菌和一些腐生菌种(表 1)。
1.2　细菌基因组DNA的提取
参照文献[ 2]的方法进行。用不同浓度的λDNA
作对照 ,将提取的 DNA用TE稀释至 20 ng/μL , -20℃
保存。
DOI :10.13926/j.cnki.apps.2003.03.002
表 1　参试菌株及来源
Table 1　Strains tested and their origins
菌株拉丁名(Latin name of st rains) 中文名(Chinese name of st rains) 菌株号(Number of strains)
Clavibacter fangii 方氏棒形杆菌 Ta19
C.michiganense subsp.michiganense 密执安棒形杆菌密执安亚种 ICMP＊2550
Rathayibacter tri tici 小麦拉氏杆菌 ICMP 2626
Curtobacterium flaccumfaciens pv.flaccumfaciens 萎蔫短小杆菌萎蔫致病变种 ICMP 2584
Cur.f.pv.betae 萎蔫短小杆菌甜菜致病变种 ICMP 2594
Cur.f.pv.poinsettias 萎蔫短小杆菌一品红致病变种 ICMP 2632
Cur.f.pv.oortii 萎蔫短小杆菌奥氏致病变种 ICMP 2566
Cur.f.pv.basellae 落葵叶斑病病原菌 BR10
Cur.f.pv.beticila 甜菜叶斑病病原菌 CV30
Cur.citreum 柠檬色短小杆菌 ATCC＊＊15828
Cur.luteum 金黄色短小杆菌 ATCC 15830
Cur.albidum 白色短小杆菌 ATCC 15831
Cur.pusillum 极小短小杆菌 ATCC 19096
Cur.plantarum 　　-　　　　　 ATCC 49174
Rhodococcus fascians 带化红球菌 ICMP 5833
Arthrobacter ilicis 美国冬青节杆菌 ICMP 2607
Agrobacterium tumefaciens 根癌土壤杆菌 A6
Ralstonia solanacearum 茄青枯菌 LE24
Erwinia chrysanthemi 菊欧文氏菌 Ch10
Pseudomonas syringae pv.phaseolicola 丁香假单胞菌菜豆致病变种 Psp2
Escherichia coli 大肠杆菌 JM110
Bacillus megaterium 巨大芽孢杆菌 Ga5
　　＊ICMP:新西兰国际菌种保藏中心(Internat ional Collection of Micro-Organism from Plant(New Zealand));
　　＊＊ATCC:美国菌种保藏中心(American Type Culture Collection)。
1.3　工具酶 、试剂 、序列测定和引物合成
Taq酶和标准分子量购自 TaKaRa 公司;dNTPs 、
pUC-T 载体购自 Sangon公司;玻璃奶回收试剂盒购自
博大公司;序列由上海博亚公司测定;引物由 Sangon
公司合成 。
1.4　通用引物设计及 PCR扩增
选用 ITS 通用引物 L1(5-AGTCGTAACAAGGTAGCC
GT-3)[3]和L2(5-GTGCCAAGGCATCCACC-3)扩增参试菌株
16S ～ 23S rDNA间的 ITS[4] 。
PCR扩增条件为:95℃ 5 min;94℃30 s , 60℃1
min ,72℃1 min , 35个循环;72℃ 10 min。阴性对照
用ddH2O代替模板 DNA。PCR反应产物在 0.8%琼
脂糖凝胶上电泳分离 。
1.5　PCR产物的回收 、克隆和测序
3个测序菌的 PCR产物经电泳分离后的 500 bp
左右的片段从胶中切下 ,用玻璃奶回收试剂盒进行回
收;与 pUC-T 载体连接后转化 E.coli JM110 ,经酶切
鉴定后 ,挑选出阳性克隆并测序。
1.6　DNA序列分析及引物设计
用生物学软件 DNAMAN 对各片段的序列及
GenBank 、EMBI 、DDBJ数据库中已经报道的其它细菌
的 ITS序列进行多重同源性比较;选取适当的界定
值 ,在多态性丰富的区域运用此软件进行引物设计 ,
送交合成。
1.7　棒形杆菌的 ITS序列同源性分析
根据本研究中所得的 3 种细菌的 ITS全序列和
GenBank中登录的其它 6种植物病原棒形杆菌的 ITS
序列 ,使用 DNAMAN 软件绘制同源分析树状图 。已
报道的 6个序列登录号分别如下:C.m.subsp.insi-
diosum(U09378)、 C.m.subsp.nebraskense(U09381)、C.
m.subsp.sepedonicum(U09382)、C.m.subsp.tesselarius
(L43095)、C.xyli subsp.xyli(AF034641)、C.xyli subsp.
cynodontis(AF056004)。
1.8　特异性的 PCR扩增
表 1列出的所有细菌种的基因组 DNA样本用于
检测设计的引物特异性。用不同的反应体系和循环
参数进行 PCR扩增 ,选择出最佳扩增条件 。最终反
应体系为:10×buffer 2μL , dNTP(10 mmol/L)0.35μL ,引
物 I1/引物 I2(50μmol/L)0.35μL/0.35μL , rTag 酶 1U ,
模板DNA 1 μL ,加ddH2O至20 μL;最终循环参数是:
1993 期 葛芸英 ,等:小麦苗枯病菌的 ITS 分析及 PCR检测
95℃5 min;94℃30 s , 60℃1min , 72℃1 min , 30个
循环;72℃10 min。
2　结果与分析
2.1　L1/L2 引物扩增及引物设计
L1/L2 对 C.fangii 、C.m.subsp.michiganense
和R .tritici 3种不同细菌进行 PCR扩增时 ,均得到了
分子量为 500 bp 左右的主要扩增产物(图 1)。产物
测序结果见图 2;根据序列设计出Cf的特异性引物 I1
(5-TGCCAAGTCACACTGAGACGA-3)/ I2(5-CAATGATC
TACCACCCTCCGA-3)。
图 1　L1/ L2 对 3 个测序菌基因组 DNA的扩增产物
Fig.1　PCR products following amplification with primers L1
and L2 from genomic DNA of 3 tested bacteria
1.Ta19;2.2626;3.2550;M.分子量标准。
Lanes 1-3:Ta19, 2626 ,2550 respectively , Lane M is DNA size marker.
图 3　棒形杆菌的 ITS序列同源性树状图
Fig.3　Homology tree of ITS sequences of Clavibacter bacteria
2.2　ITS序列同源性分析结果
根据 ITS 序列的同源性绘制同源性树状图(图
3)。C.michiganense 下 5 个亚种的同源性为 95%,
C.xyli 种下的 2个亚种的同源性为 85%左右;棒形
杆菌属下的 3 个种(C.michiganense , C.xyli , C.
fangii)的同源性为 60%,而这 3个种与 R.tritici 的
同源性为 45%左右。
2.3　引物 I1/ I2 对Cf扩增的特异性
引物 I1/I2从目标菌 Cf中扩增出 1条明显的分
子量为 351 bp的产物 ,其余 21个参试菌均无明显扩
增主带(图 4)。扩增产物带型清晰 ,结果稳定 ,说明
I1/ I2引物具有很高的特异性 ,在实际应用中仅需根
据扩增产物的有无便可对目标菌Cf进行检测。
图 4　引物 I1/ I2对 22 个参试细菌 PCR 扩增结果
上排 1-11依次是:2607、5833 、Ta19、2626 、2550 、Ga5 、JM110、Psp2 、Ch10 、
LE24 、A6;下排 1-11依次是:2566 、2632、2594 、2584 、CV30、BR10 、49174 、
19096 、15831 、15830 、15828;M:分子量标准。
Fig.4 　PCR products following amplification with primers I1
and I2 from genomic DNA of different tested bacteria
Upper lanes 1-11:2607, 5833 , Ta19 , 2626 , 2550 , Ga5 , JM110 , Psp2, Ch10 ,
LE24 , A6;Lower lanes 1-11:2566, 2632 , 2594 , 2584 , CV30, BR10 , 49174 ,
19096 , 15831 , 15830 , 15828;Lane M is DNA size marker.
3　讨论
3.1　小麦苗枯病菌的检测
C.fangii 是本实验室 80 年代末期新发现的一
种病原菌 ,本实验室依据其形态学 、培养特征 、生理生
化反应 、细胞化学成分分析 、G+C比例和 DNA 同源
值等将之鉴定为 Clavibacter属下的一个新种[ 1 , 5] 。小
麦苗枯病是小麦生产上出现的又一个具有潜在危险
性的病害 ,一旦大面积发生将导致小麦的严重减产 。
200 植物病理学报 33卷
图 2　C.fangii 、C.m.subsp.michiganense和 R.tritici 的 ITS序列比较
Fig.2 　Sequence alignment of the ITS of C.fangii , C.m.subsp.michiganense and R.tritici
(·):碱基缺乏;(-)碱基相同;划线部分为通用 、特异性引物位点。
Dot(·):alignment gaps and base deletions;dash(-):identity with sequence of Cf;The underlined regions are universal and specific primer sites.
2013 期 葛芸英 ,等:小麦苗枯病菌的 ITS 分析及 PCR检测
目前此病害只在局部地区发现 ,应严格控制其病种子
和病秸杆的调运。为此 ,对小麦苗枯病菌的快速 、高
效的检测势在必行。
16S和 23S 间的 ITS是较理想的细菌鉴定及检测
的PCR引物区域。在相近的细菌中 ,由于 ITS序列不
需翻译 ,面临较小的进化选择压 ,在进化过程中可以
将突变保留积累下来 , 从而 ITS 包含许多差异序
列[ 6] 。
由于PCR可通过检测病原菌DNA来确定植株或
种子中病原菌的存在 ,因此 PCR技术可作为病害诊
断的辅助手段 。本研究利用 ITS 序列的多态性获得
的特异性引物 I1/ I2及PCR过程可以为Cf的快速 、准
确检测提供可靠的分子检测工具 ,检测过程只需要简
便的 PCR和琼脂糖电泳操作 ,为小麦苗枯病的及时
发现和防治提供依据 。
3.2　棒形杆菌的分类及 ITS序列在细菌分类中的潜
在应用
依据目前的分类体系 , Clavibacter属中仅有3个种 ,
即 C.michiganense (下分 C.m.subsp.michiganense 、
C.m.subsp.insidiosum 、 C.m.subsp.nebraskense 、C.
m.subsp.sepedonicum 、C.m.subsp.tesselarius 5 个亚
种), C.xyli (下分 C.xyli subsp.xyli 、C.xyli subsp.
cynodontis 2个亚种)和 C.fangii[ 7] 。R.tritici 曾经作为
Clavibacter属下的一个种。1993年 ,Zgurskaya等提议建
立拉氏杆菌属 ,囊括了 R.tritici等 3种以线虫为媒介的
细菌 ,部分依据细胞的甲基萘醌 、糖的组成 、细胞壁组
成、基因图谱等性状[8] 。
目前 ,已经有一些关于利用 ITS 分析方法对植物
病原细菌进行研究的报道。例如 Li等[ 2]获得了 C.
michiganense 种下 5 个不同亚种的 16S 和 23S rDNA
之间的 ITS序列;Pan 等[ 9] 用通用引物扩增 C.xyli
subsp.xyli 和C.xyli subsp.cynodontis的 ITS 区域 ,并
将之克隆获得其序列;Maes等[ 10]获得了 4种黄单胞
菌的 ITS序列 。但这些研究仅利用其 ITS序列做了相
关细菌的检测或鉴定 ,没有进行分类上的研究 。
依据图 3 ,作者认为 C.michiganense 下的 5个亚
种和 C.xyli 下的 2个亚种各自间的同源性均很高 ,
适合作为亚种;C.fangii 与其它 Clavibacter 属下的 2
个种同源性较高 ,适合作为其下的一个新种;R .triti-
ci和Clavibacter 属亲缘关系较远 ,同源性只有 45%左
右 ,所以不适合归为 Clavibacter 属中。本研究的同源
性分析结果 ,进一步验证了郭坚华等[ 5]对小麦苗枯病
菌的分类地位的确定和 Zgurskaya 等[ 8]将小麦蜜穗病
菌从 Clavibacter属中分离出来的提议。
图 3所示的分类结果与目前的分类体系吻合 ,为
这一分类体系提供了另外的依据。由此可见 , ITS 序
列包含了生物物种的某些进化特征 ,至少可以作为物
种分类的一种新的辅助手段。
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202 植物病理学报 33卷