全 文 ：建兰胶孢炭疽菌 陨栽杂序列分析
及其 孕悦砸快速检测
姚锦爱摇 余德亿鄢摇 陈福如摇 黄摇 鹏摇 陈摇 峰
渊福建省农业科学院植物保护研究所袁 福州 猿缘园园员猿冤
摘要院 由胶孢炭疽菌 悦燥造造藻贼燥贼则蚤糟澡怎皂 早造燥藻燥泽责燥则蚤燥蚤凿藻泽引起的炭疽病是建兰的重要病害遥 为建立快速检
测该病原菌的方法袁以 陨栽杂员 辕 陨栽杂源 为引物袁对 员缘 个建兰胶孢炭疽菌的 陨栽杂进行 孕悦砸扩增及测序袁将
测定的序列与炭疽菌属其它种的 陨栽杂序列进行比对分析袁设计特异性引物 悦云员 辕 悦砸员袁并通过常规和
巢式 孕悦砸对建兰胶孢炭疽菌进行检测遥 结果显示袁员缘 个菌株中有 员猿 个菌株 陨栽杂 序列与该菌的模
式种序列相似性高达 怨怨豫以上袁而另外 圆 个菌株相似性则为 愿远豫 曰供试菌株在系统发育树上聚为 圆
个不同的分支曰引物 悦云员 辕 悦砸员 通过常规 孕悦砸可从 员 灶早的建兰胶孢炭疽菌基因组 阅晕粤中扩增到目
的条带袁而利用引物 陨栽杂员 辕 陨栽杂源 和 悦云员 辕 悦砸员 通过巢式 孕悦砸 可从 员 责早 的基因组 阅晕粤 中扩增到目的
条带袁即巢式 孕悦砸反应检测灵敏度较常规 孕悦砸至少高 员 园园园 倍遥 研究表明建立的巢式 孕悦砸法可从
自然感病的建兰叶片组织中检测到胶孢炭疽菌遥
关键词院 建兰曰 胶孢炭疽菌曰 陨栽杂分析曰 孕悦砸检测
杂藻择怎藻灶糟藻 葬灶葬造赠泽蚤泽 燥枣 陨栽杂 葬灶凿 孕悦砸 则葬责蚤凿鄄凿藻贼藻糟贼蚤燥灶 燥枣 悦燥造造藻贼燥贼则蚤糟澡怎皂
早造燥藻燥泽责燥则蚤燥蚤凿藻泽 枣则燥皂 悦赠皂遭蚤凿蚤怎皂 藻灶泽蚤枣燥造蚤怎皂
再葬燥 允蚤灶爷葬蚤摇 再怎 阅藻赠蚤鄢摇 悦澡藻灶 云怎则怎摇 匀怎葬灶早 孕藻灶早摇 悦澡藻灶 云藻灶早
渊陨灶泽贼蚤贼怎贼藻 燥枣 孕造葬灶贼 孕则燥贼藻糟贼蚤燥灶袁 云怎躁蚤葬灶 粤糟葬凿藻皂赠 燥枣 粤早则蚤糟怎造贼怎则葬造 杂糟蚤藻灶糟藻泽袁 云怎扎澡燥怎 猿缘园园员猿袁 云怎躁蚤葬灶 孕则燥增蚤灶糟藻袁 悦澡蚤灶葬冤
粤遭泽贼则葬糟贼院 粤灶贼澡则葬糟灶燥泽藻 糟葬怎泽藻凿 遭赠 悦燥造造藻贼燥贼则蚤糟澡怎皂 早造燥藻燥泽责燥则蚤燥蚤凿藻泽 蚤泽 葬 凿藻泽贼则怎糟贼蚤增藻 凿蚤泽藻葬泽藻 燥枣 悦赠皂遭蚤凿蚤怎皂 藻灶鄄
泽蚤枣燥造蚤怎皂援 栽燥 凿藻增藻造燥责 则葬责蚤凿 贼藻糟澡灶蚤择怎藻泽 枣燥则 贼澡藻 凿藻贼藻糟贼蚤燥灶 燥枣 悦援 早造燥藻燥泽责燥则蚤燥蚤凿藻泽袁 贼澡藻 怎灶蚤增藻则泽葬造 责则蚤皂藻则泽 燥枣
陨栽杂员 辕 陨栽杂源 憎藻则藻 怎泽藻凿 贼燥 葬皂责造蚤枣赠 贼澡藻 蚤灶贼藻则灶葬造 贼则葬灶泽糟则蚤遭藻凿 泽责葬糟藻则 渊陨栽杂冤 泽藻择怎藻灶糟藻泽 燥枣 员缘 悦援 早造燥藻燥泽责燥则蚤燥蚤凿藻泽
蚤泽燥造葬贼藻泽袁 葬灶凿 遭葬泽藻凿 燥灶 贼澡藻 泽藻择怎藻灶糟藻 葬灶葬造赠泽蚤泽 燥枣 贼澡藻泽藻 蚤泽燥造葬贼藻泽 葬灶凿 燥贼澡藻则 悦援 泽责责援 袁 葬 责葬蚤则 燥枣 泽责藻糟蚤藻泽鄄泽责藻糟蚤枣蚤糟
责则蚤皂藻则泽 悦云员 辕 悦砸员 憎藻则藻 凿藻泽蚤早灶藻凿袁 葬灶凿 贼澡藻灶袁 贼澡藻 凿藻贼藻糟贼蚤燥灶 皂藻贼澡燥凿泽 燥枣 糟燥灶增藻灶贼蚤燥灶葬造 孕悦砸 葬灶凿 灶藻泽贼鄄孕悦砸 枣燥则
悦援 早造燥藻燥泽责燥则蚤燥蚤凿藻泽 憎藻则藻 凿藻增藻造燥责藻凿援 栽澡藻 则藻泽怎造贼 凿藻皂燥灶泽贼则葬贼藻凿 贼澡葬贼 员猿 燥怎贼 燥枣 贼澡藻 员缘 贼藻泽贼藻凿 悦援 早造燥藻燥泽责燥则蚤燥蚤凿藻泽
蚤泽燥造葬贼藻泽 泽澡燥憎藻凿 怨怨豫 泽蚤皂蚤造葬则蚤贼蚤藻泽袁 葬灶凿 贼澡藻 燥贼澡藻则 贼憎燥 蚤泽燥造葬贼藻泽 泽澡燥憎藻凿 愿远豫 泽蚤皂蚤造葬则蚤贼蚤藻泽袁 糟燥皂责葬则藻凿 憎蚤贼澡 贼澡藻
憎蚤造凿鄄贼赠责藻 泽责藻糟蚤藻泽援 酝藻葬灶憎澡蚤造藻袁 责澡赠造燥早藻灶藻贼蚤糟 葬灶葬造赠泽蚤泽 凿蚤泽责造葬赠藻凿 贼澡葬贼 贼澡藻 贼藻泽贼藻凿 蚤泽燥造葬贼藻泽 憎藻则藻 糟造葬泽泽蚤枣蚤藻凿 蚤灶贼燥
贼憎燥 凿蚤枣枣藻则藻灶贼 早则燥怎责泽援 云怎则贼澡藻则皂燥则藻袁 糟燥灶增藻灶贼蚤燥灶葬造 孕悦砸 怎泽蚤灶早 贼澡藻 泽责藻糟蚤藻泽鄄泽责藻糟蚤枣蚤糟 责则蚤皂藻则泽 悦云员 辕 悦砸员 糟燥怎造凿
凿藻贼藻糟贼 贼澡藻 泽责藻糟蚤枣蚤糟 枣则葬早皂藻灶贼 枣则燥皂 员 灶早 燥枣 早藻灶燥皂蚤糟 阅晕粤袁 遭怎贼 贼澡藻 泽藻灶泽蚤贼蚤增蚤贼赠 蚤灶糟则藻葬泽藻凿 员园园园鄄枣燥造凿 贼燥 员 责早 遭赠
凿藻增藻造燥责蚤灶早 灶藻泽贼藻凿 孕悦砸 责则燥糟藻凿怎则藻 贼澡葬贼 怎泽藻凿 陨栽杂员 辕 陨栽杂源 葬泽 贼澡藻 枣蚤则泽贼鄄则燥怎灶凿 责则蚤皂藻则泽 糟燥皂遭蚤灶藻凿 憎蚤贼澡 悦云员 辕
悦砸员 葬泽 贼澡藻 泽藻糟燥灶凿鄄则燥怎灶凿 责则蚤皂藻则泽援 栽澡藻 则藻泽怎造贼泽 泽怎早早藻泽贼藻凿 贼澡葬贼 贼澡藻 灶藻泽贼藻凿 孕悦砸 贼藻糟澡灶蚤择怎藻 凿藻增藻造燥责藻凿 澡藻则藻
糟燥怎造凿 遭藻 怎泽藻凿 贼燥 凿藻贼藻糟贼 悦援 早造燥藻燥泽责燥则蚤燥蚤凿藻泽 枣则燥皂 悦援 藻灶泽蚤枣燥造蚤怎皂 贼蚤泽泽怎藻泽 蚤灶枣藻糟贼藻凿 灶葬贼怎则葬造造赠援
运藻赠 憎燥则凿泽院 悦赠皂遭蚤凿蚤怎皂 藻灶泽蚤枣燥造蚤怎皂曰 悦燥造造藻贼燥贼则蚤糟澡怎皂 早造燥藻燥泽责燥则蚤燥蚤凿藻泽曰 陨栽杂 葬灶葬造赠泽蚤泽曰 孕悦砸 凿藻贼藻糟贼蚤燥灶
基金项目院 福建省科技重大专项渊圆园员园晕在园园园猿鄄圆冤袁福建省属公益类科研院所基本科研专项计划项目渊圆园员园砸员园圆远鄄源袁圆园员员砸员园圆远鄄苑冤
作者简介院 姚锦爱袁女袁员怨苑愿年生袁助理研究员袁研究方向为植物病害防治及分子生物学袁 耘鄄皂葬蚤造院 赠葬燥躁葬岳 员远猿援 糟燥皂
鄢通讯作者渊粤怎贼澡燥则 枣燥则 糟燥则则藻泽责燥灶凿藻灶糟藻冤袁 耘鄄皂葬蚤造院 赠怎凿赠赃圆园园源岳 员圆远援 糟燥皂
收稿日期院 圆园员圆 原 员员 原 员远
第 源园 卷摇 第 猿 期
圆园员猿 年摇 远 月
植摇 物摇 保摇 护摇 学摇 报
粤悦栽粤 孕匀再栽韵孕匀再蕴粤悦陨悦粤 杂陨晕陨悦粤
灾燥造援 源园摇 晕燥援 猿
允怎灶藻 摇 圆园员猿
摇 摇 建兰 悦赠皂遭蚤凿蚤怎皂 藻灶泽蚤枣燥造蚤怎皂 属兰科 韵则糟澡蚤凿葬糟藻葬藻袁
是多年生单子叶草本植物袁也是珍贵的园林观赏植
物袁在我国栽培历史悠久袁植物学界以其主产地福建
而命名咱员 原 圆暂 遥 近年来袁随着福建建兰规模化种植面
积不断扩大袁炭疽病的发生呈逐年加重趋势袁以胶孢
炭疽菌 悦燥造造藻贼燥贼则蚤糟澡怎皂 早造燥藻燥泽责燥则蚤燥蚤凿藻泽 引起的建兰炭
疽病危害较为严重咱猿暂 袁该病自苗期至成株期均可发
病袁但以成株期发病较重袁并主要危害叶片遥 叶片受
害初期表面产生浅褐色凹陷小点袁后期扩大为不规
则形或椭圆形的病斑袁病部凹陷明显尧中间灰褐色尧
边缘深褐色袁并产生许多轮状排列的小黑点袁严重影
响植株的生长和观赏性遥 该病菌潜伏性强袁环境因
子未达到致病条件时常潜伏于病残体或土壤中袁危
害症状不易被发现袁且初感染的叶片症状与建兰黑
斑病菌 悦赠造蚤灶凿则燥泽责燥则蚤怎皂 责蚤凿蚤尧圆斑病菌 杂贼葬早燥灶泽责燥则葬
糟怎则贼蚤泽蚤蚤和褐斑病菌 悦藻则糟燥泽责燥则葬 遭则葬灶噪蚤造 等侵染症状相
似袁因此袁急需一种有效的检测方法袁以实现田间准
确早期诊断遥
传统病原菌的分类及鉴定主要基于形态学特性
及致病性测定等袁耗时较长且程序繁琐袁难以做到早
期预测预报咱源暂 遥 随着分子生物学技术的发展袁可利
用真菌核糖内转录间隔区渊 蚤灶贼藻则灶葬造 贼则葬灶泽糟则蚤遭藻凿 泽责葬糟鄄
藻则袁 陨栽杂冤序列种内的保守性和科属种间可变性的特
点咱缘暂 袁设计特异引物进行聚合酶链反应渊责燥造赠皂藻则葬泽藻
糟澡葬蚤灶 则藻葬糟贼蚤燥灶袁 孕悦砸冤扩增袁从而对病原菌进行快速
检测和鉴定咱远 原 愿暂 遥 目前袁国内外对炭疽菌的分子生
物学检测进行了一些研究袁如 酝蚤造造泽 等咱怨暂 尧刑红梅
等咱员园暂和戴富明咱员员暂等分别建立了不同作物炭疽病菌
的分子检测方法袁但尚未见建兰炭疽病菌分子检测
的相关报道遥 本试验通过比较分析不同地理来源的
建兰品种胶孢炭疽菌与 郧藻灶月葬灶噪 中胶孢炭疽菌及
炭疽菌属其它种的 陨栽杂 的差异袁设计建兰胶孢炭疽
菌的特异性引物袁并结合 孕悦砸技术袁建立一套快速尧
灵敏的建兰胶孢炭疽菌分子检测方法遥
员 材料与方法
员援 员 材料
供试菌株院员缘 个胶孢炭疽菌 悦援 早造燥藻燥泽责燥则蚤燥蚤凿藻 菌
株尧员 个黑斑病菌 悦援 责蚤凿蚤 菌株和 员 个圆斑病菌 杂援
糟怎则贼蚤泽蚤蚤菌株分离自福建福州尧漳州和龙岩地区的不
同建兰品种上袁番石榴焦腐病菌 月燥贼则赠燥泽责澡葬藻则蚤葬 则澡燥凿鄄
蚤灶葬尧水稻稻曲病菌 哉泽贼蚤造葬早蚤灶燥蚤凿藻葬 增蚤则藻灶泽尧香蕉炭疽病
菌 悦援 皂怎泽葬尧马铃薯青枯病菌 砸葬造泽贼燥灶蚤葬 泽燥造葬灶葬糟藻葬则怎皂尧
水稻稻瘟病菌 酝葬早灶葬责燥则贼澡藻 早则蚤泽藻葬尧榕树黑斑病菌 粤造鄄
贼藻则灶葬则蚤葬 泽责援 尧辣椒疫霉菌 孕澡赠贼燥责澡贼澡燥则葬 糟葬责泽蚤糟蚤尧大豆腐
霉菌 孕赠贼澡蚤怎皂 葬责澡葬灶蚤凿藻则皂葬贼怎皂 等菌株分离于不同作
物袁以上菌株均保存于福建省农业科学院植物保护
研究所遥 大肠杆菌菌株 耘泽糟澡藻则蚤糟澡蚤葬 糟燥造蚤 阅匀缘倩 为本
实验室保存遥
供试植物院感染炭疽病的建兰品种为采自福建福
州和漳州建兰种植基地的素心尧大凤素和小桃红等遥
培养基院所用培养基为马铃薯葡萄糖琼脂渊责燥鄄
贼葬贼燥 凿藻曾贼则燥泽藻 葬早葬则袁孕阅粤冤培养基袁配方为院马铃薯 圆园园
早尧葡萄糖 圆园 早尧琼脂 员愿 早尧水 员 园园园 皂蕴曰马铃薯葡萄糖
液体培养基除不加琼脂外袁配方同 孕阅粤遥
试剂院异丙基硫代 原 茁 原 阅 原半乳糖苷渊 蚤泽燥责则燥责鄄
赠造贼澡蚤燥鄄茁鄄阅鄄早葬造葬糟贼燥泽蚤凿藻袁 陨孕栽郧冤尧限制性内切酶尧 栽葬择
阅晕粤聚合酶尧缘 原溴 原 源 原氯 原 猿 原吲哚 原 茁 原 阅 原半
乳糖 苷 渊 缘鄄遭则燥皂燥鄄源鄄糟澡造燥则燥鄄猿鄄蚤灶凿燥造赠造鄄茁鄄阅鄄早葬造葬糟贼燥责赠则鄄
葬灶燥泽蚤凿藻袁载鄄早葬造冤尧氨苄青霉素尧阅晕粤 皂葬则噪藻则尧责酝阅员愿鄄栽
增藻糟贼燥则等试剂购于宝生物渊大连冤公司曰普通琼脂糖
凝胶 阅晕粤 回收试剂盒购自 栽陨粤晕郧耘晕 公司曰其它试
剂均为进口或国产分析纯遥
仪器院缘圆悦型紫外可见分光光度计袁上海第三分
析仪器厂曰粤蕴孕匀粤员鄄圆 型冷冻干燥机袁上海亚荣生化
仪器厂曰粤蕴阅员圆源源 孕悦砸 仪袁月蚤燥砸粤阅 公司曰猿再 郧粤杂鄄
圆园园园 凝胶成像系统袁上海富玛实验设备有限公司遥
员援 圆 菌丝体的收集及 阅晕粤提取
供试菌株在 孕阅粤培养基上培养 猿 凿 后袁沿菌落
边缘切取菌丝块转接于马铃薯葡萄糖液体培养基
中袁于 圆缘 益尧员愿园 则 辕 皂蚤灶 摇床培养 缘 耀 苑 凿 后袁经冷冻
真空抽滤后研磨成菌丝粉袁采用十六烷基三甲基溴
化铵渊澡藻曾葬凿藻糟赠造 贼则蚤皂藻贼澡赠造 葬皂皂燥灶蚤怎皂 遭则燥皂蚤凿藻袁悦栽粤月冤
法提取 阅晕粤咱员圆暂 遥
员援 猿 陨栽杂序列同源性分析
选用真菌 陨栽杂 通用引物 陨栽杂员渊缘忆鄄栽悦悦郧栽粤郧郧栽鄄
郧粤粤悦悦栽郧悦郧郧鄄猿忆冤 和 陨栽杂源 渊 缘忆鄄栽悦悦栽悦悦郧悦栽栽粤栽栽鄄
郧粤栽粤栽郧悦鄄猿忆冤扩增建兰胶孢炭疽菌的 陨栽杂遥 孕悦砸 反
应体系渊圆缘 滋蕴冤院栽葬择 孕悦砸 酝葬泽贼藻则 酝蚤曾 员圆援 缘 滋蕴袁员园园
灶早 辕 滋蕴模板 阅晕粤 圆 滋蕴袁员园 滋皂燥造 辕 蕴 引物各 员 滋蕴袁加
凿凿匀圆韵 至 圆缘 滋蕴曰阴性对照用 凿凿匀圆韵代替模板 阅晕粤遥孕悦砸反应程序院怨源 益预变性 缘 皂蚤灶曰怨源 益变性 员 皂蚤灶袁
缘缘 益退火 员 皂蚤灶袁苑圆 益延伸 员援 缘 皂蚤灶袁猿缘 个循环曰最后
苑圆 益延伸 愿 皂蚤灶遥 孕悦砸 反应产物于含 园援 缘 滋早 辕 皂蕴 溴
化乙锭渊藻贼澡蚤凿蚤怎皂 遭则燥皂蚤凿藻袁耘月冤的质量分数 员援 缘豫琼
脂糖凝胶上电泳分离袁电压为 愿 灾 辕 糟皂尧时间为 源缘 皂蚤灶
园缘圆 植摇 物摇 保摇 护摇 学摇 报 源园 卷
左右袁在凝胶成像系统上检测并拍照曰将含有大小约
为 缘愿园 遭责 的目的片段切胶并用回收试剂盒回收袁与
责酝阅员愿鄄栽载体连接后转化大肠杆菌 耘援 糟燥造蚤袁提取质
粒袁经酶切鉴定后袁挑选阳性克隆送生工生物工程
渊上海冤股份有限公司测定序列遥
利用 晕悦月陨 月蕴粤杂栽 对所测序列进行在线比对袁
分析其与 郧藻灶月葬灶噪 中胶孢炭疽菌和其它炭疽菌种
的一致性遥 选取一致性较高的炭疽菌属其它种的
陨栽杂序列及作为外群的盘多毛属 孕藻泽贼葬造燥贼蚤葬 泽责援 真菌
的 陨栽杂序列袁通过 月蚤燥耘凿蚤贼 编辑后用 悦造怎泽贼葬造载 进行多
重比对袁利用 酝耘郧粤 缘援 园 的邻接法渊灶藻蚤早澡遭燥则鄄躁燥蚤灶蚤灶早袁
晕允冤法构建系统发育树遥 用 月燥燥贼泽贼则葬责 渊员 园园园 次重
复冤评估系统发育树的置信值遥
员援 源 建兰胶孢炭疽菌的 孕悦砸检测
员援 源援 员 引物设计与合成
利用 阅晕粤酝粤晕 软件将测定的 陨栽杂 序列渊登录
号院允晕猿怨怨圆员愿援 员袁运悦园员园缘猿猿 耀 运悦园员园缘源远冤和炭疽菌属
中与其同源性较高的其它种 陨栽杂 序列 渊登录号院
粤月园源圆猿园怨尧粤月园缘苑源猿苑尧 粤月园缘苑源猿愿尧 粤月园愿苑圆圆园尧粤月园愿鄄
苑圆圆圆尧 粤月员园缘怨缘苑尧 粤月员怨远猿园园尧 粤云园缘怨远苑远尧 粤允猿园员怨源圆尧
粤允猿园员怨源缘尧 粤允猿园员怨缘缘尧 粤允猿园员怨苑猿尧 粤允猿园员怨苑缘尧粤允猿园员怨鄄
愿怨尧粤允缘猿远圆员怨尧粤允缘猿远圆猿园尧粤允缘猿远圆猿员尧粤允缘缘愿员园苑尧耘云圆园鄄
愿远员愿尧耘哉源园园员源园尧耘哉缘圆园圆员园尧 耘哉缘圆园圆员员尧 郧哉缘怨苑猿圆圆尧
匀酝园员远苑怨愿尧匀匝圆远源员苑远尧 匀匝远园苑怨苑源尧匀匝苑猿员源怨员尧允云苑源鄄
怨愿园愿冤进行多重比对袁选取序列间有差异位点的区
域袁设计建兰胶孢炭疽菌特异性引物袁委托生工生物
工程渊上海冤股份有限公司合成遥
员援 源援 圆 引物特异性验证
用合成的引物对参试菌株的基因组 阅晕粤 进行
扩增袁检测其特异性遥 选用不同的反应体系和循环
参数进行 孕悦砸扩增袁选出最佳扩增条件遥 孕悦砸反应
体系 圆缘 滋蕴袁包括 栽葬择 孕悦砸 酝葬泽贼藻则 酝蚤曾 员圆援 缘 滋蕴袁员园园
灶早 辕 滋蕴模板 阅晕粤 圆 滋蕴袁员园 滋皂燥造 辕 蕴引物 悦云员 和 悦砸员
各 员滋蕴袁加 凿凿匀圆韵至 圆缘滋蕴遥 孕悦砸反应程序院怨源益 预
变性 缘 皂蚤灶曰怨源 益变性 远园 泽袁苑园 益退火 远园 泽袁苑圆 益延伸
远园 泽袁共 猿缘 个循环曰苑圆 益延伸 员园 皂蚤灶曰阴性对照用
凿凿匀圆韵代替模板 阅晕粤遥 扩增结束后取 员园援 园 滋蕴 孕悦砸
产物上样于含 园援 缘 滋早 辕 皂蕴 耘月 的 员援 缘豫琼脂糖凝胶
上电泳袁电压为 愿 灾 辕 糟皂尧时间为 源缘 皂蚤灶袁在凝胶成像
系统上检测并拍照遥
员援 源援 猿 引物灵敏度检测
用紫外分光光度计测定所提取的建兰胶孢炭疽
病菌基因组 阅晕粤 的 韵阅圆远园 辕 韵阅圆愿园袁将菌株基因组
阅晕粤浓度调整为 员园 滋早 辕 滋蕴袁并按 员园 倍梯度分别稀
释为 员园尧员尧员园 原员尧员园 原 圆尧员园 原猿尧员园 原 源尧员园 原缘尧员园 原远 滋早 辕 滋蕴
备用遥 分别以不同浓度的 阅晕粤 为模板进行常规和
巢式 孕悦砸反应袁阴性对照用 凿凿匀圆韵 代替模板 阅晕粤遥
常规 孕悦砸 反应院以特异引物 悦云员 辕 悦砸员 作为 孕悦砸 反
应引物袁其它反应体系和程序同 员援 源援 圆曰巢式 孕悦砸反
应院以 陨栽杂 通用引物 陨栽杂员 辕 陨栽杂源 作为第一轮 孕悦砸 反
应引物袁其它反应体系和程序同 员援 猿援 员袁后取 员 滋蕴第
一轮 孕悦砸产物为模板与引物 悦云员 辕 悦砸员 组合进行巢
式 孕悦砸扩增袁反应体系和程序同 员援 源援 圆遥 扩增结束
后分别取 员园援 园 滋蕴 孕悦砸产物上样于含 园援 缘 滋早 辕 皂蕴耘月
的 员援 缘豫琼脂糖凝胶上电泳袁电压为 愿 灾 辕 糟皂尧时间
为 源缘 皂蚤灶袁在凝胶成像系统上检测并拍照遥
员援 源援 源 自然发病叶片组织中胶孢炭疽菌检测
选取当年生成株期建兰植株袁采集已表现炭疽
病病害症状的叶片袁挑取 愿怨 个发病组织分成 圆 份袁员
份在 原 圆园 益低温下保存袁员 份进行病原菌的常规分
离和鉴定遥 将挑取的病组织经 苑园豫酒精溶液消毒
猿园 泽后接于 孕阅粤培养基上袁将所接的平板与叶片挑
取位置对应并分别编号袁置 圆愿 益培养箱中培养袁圆 凿
后挑取菌落边缘的菌丝转至新鲜的 孕阅粤培养基上袁
持续培养 苑 耀 员园 凿至分生孢子产生遥 以无菌水洗脱
平板上的分生孢子袁制备成浓度为 员园缘 耀 员园远 个 辕 皂蕴
的孢子悬浮液袁对健康叶片进行刺伤接菌袁同时以无
菌水接菌健康叶片为对照遥 将接种后的样品置于在
圆愿 益尧砸匀 愿园豫 耀 员园园豫的人工气候培养箱中培养袁
至叶片表现病害症状后袁再次分离培养病原菌遥 根
据菌株的培养特征和形态特征袁鉴定病原菌的种
类咱员猿暂 遥 将另一份发病组织每个样品称取 园援 缘 早 左
右袁按 杂阅杂鄄悦栽粤月 改进法咱员源暂 提取 阅晕粤袁以纯化的
阅晕粤为模板袁通过常规 孕悦砸 和巢式 孕悦砸 检测病原
菌袁其反应体系和反应程序同 员援 源援 猿遥
圆 结果与分析
圆援 员 陨栽杂扩增及引物设计
以 陨栽杂员 辕 陨栽源 为引物袁对 员缘 个建兰胶孢炭疽菌
进行 孕悦砸扩增袁得到分子量约为 缘愿园 遭责的条带遥 将
测定的序列与炭疽菌属其它种的 陨栽杂 序列进行多重
比对袁选取上游片段大小约为 员园怨 耀 员猿员 遭责尧下游片
段约 猿怨缘 耀 源员圆 遭责 位置的差异位点袁进行引物设计袁
根据序列差异袁设计建兰胶孢炭疽菌特异性引物 悦云员
渊缘忆鄄郧郧悦悦栽悦悦悦郧悦悦栽悦悦郧郧郧悦郧郧郧栽悦鄄猿忆冤和 悦砸员渊缘忆鄄
栽郧粤郧郧郧悦悦栽粤悦粤栽悦粤郧悦栽 鄄猿忆冤 袁委托生工生物工程
员缘圆猿 期 姚锦爱等院建兰胶孢炭疽菌 陨栽杂序列分析及其 孕悦砸快速检测
渊上海冤股份有限公司合成遥
圆援 圆 陨栽杂序列同源性分析
利用 阅晕粤酝粤晕软件对参试菌株 陨栽杂 序列进行
比对袁其中 员猿 个菌株间一致性高达 怨愿豫以上曰对所
测序列进行 月蕴粤杂栽 比对袁其中 员猿 个菌株与该菌的
模式种序列渊郧藻灶月葬灶噪 登录号院耘哉猿苑员园圆圆冤咱员猿暂及其
它胶孢炭疽菌渊 允晕圆源愿远远远尧匀酝园员远苑怨愿冤一致性高达
怨怨豫以上袁而菌株 员员 和 员缘 与模式种的一致性仅为
愿远豫 袁但与 郧藻灶月葬灶噪中其它胶孢炭疽菌的一致性高
达 怨怨豫以上渊 允载愿远苑圆员远尧允载远远怨源源怨尧允载远远怨源缘园冤遥 建
兰胶孢炭疽菌的系统发育树如图 员 所示袁炭疽菌属
真菌与盘多毛孢属真菌处于不同的分支上袁其中炭
疽菌属的 猿缘 个菌种在置信度 怨怨豫下又聚为 圆 个分
支曰参试的 员猿 个胶孢炭疽菌与 郧藻灶月葬灶噪中下载的胶
孢炭疽菌渊郧哉缘怨苑猿圆圆尧匀酝园员远苑怨愿冤聚在同一分支袁而
其它 圆 个菌株聚在另一分支遥
图 员 建兰胶孢炭疽菌 陨栽杂序列系统发育树
云蚤早援 员 孕澡赠造燥早藻灶藻贼蚤糟 则藻造葬贼蚤燥灶泽澡蚤责泽 葬皂燥灶早 悦燥造造藻贼燥贼则蚤糟澡怎皂 早造燥藻燥泽责燥则蚤燥蚤凿藻泽 蚤泽燥造葬贼藻泽 葬灶凿 则藻造葬贼藻凿 泽责藻糟蚤藻泽 遭葬泽藻凿 燥灶 贼澡藻 陨栽杂 泽藻择怎藻灶糟藻泽
圆援 猿 建兰胶孢炭疽菌的 孕悦砸检测
圆援 猿援 员 引物特异性验证
利用设计的特异引物 悦云员 辕 悦砸员 对参试的不同
来源建兰胶孢炭疽菌尧建兰黑斑病菌尧圆斑病菌以及
其余 远 个真菌与细菌种进行 孕悦砸 扩增渊图 圆冤袁特异
引物悦云员 辕 悦砸员从员缘个胶孢炭疽菌菌株的阅晕粤中
圆缘圆 植摇 物摇 保摇 护摇 学摇 报 源园 卷
特异扩增出大小约为 猿园园 遭责 的条带袁而其它相关种
病菌包括香蕉炭疽菌尧建兰黑斑病菌尧建兰圆斑病菌
和阴性对照均无扩增条带遥
圆援 猿援 圆 引物灵敏度检测
利用特异引物 悦云员 辕 悦砸员 通过常规 孕悦砸 可从 员
灶早的菌株基因组 阅晕粤 中扩增得到目的条带渊图 猿鄄
葬冤曰而以通用引物 陨栽杂员 辕 陨栽杂源 和特异引物 悦云员 辕 悦砸员
组合进行巢式 孕悦砸反应时袁其产物量较单独以特异
引物 悦云员 辕 悦砸员 进行扩增的 孕悦砸 产物量有明显的提
高袁可从 员园园尧员园 和 员 责早 的菌株基因组 阅晕粤 中扩增
得到目的条带渊图 猿鄄遭冤遥 表明巢式 孕悦砸反应检测灵
敏度至少提高 员 园园园 倍遥
图 圆 建兰胶孢炭疽菌引物 悦云员 辕 悦砸员 特异性检测
云蚤早援 圆 杂责藻糟蚤枣蚤糟 凿藻贼藻糟贼蚤燥灶 燥枣 悦燥造造藻贼燥贼则蚤糟澡怎皂 早造燥藻燥泽责燥则蚤燥蚤凿藻泽 憎蚤贼澡 贼澡藻 责则蚤皂藻则泽 悦云员 辕 悦砸员
摇 摇 注院酝院阅晕粤 皂葬则噪藻则 阅蕴圆园园园曰员 耀 员缘院建兰胶孢炭疽菌曰员远院双蒸水曰员苑院建兰黑斑病菌曰员愿院建兰圆斑病菌曰员怨院番石榴焦腐病菌曰圆园院水
稻稻曲病菌曰圆员院香蕉炭疽病菌曰圆圆院马铃薯青枯病菌曰圆猿院水稻稻瘟病菌曰圆源院辣椒疫霉菌遥 晕燥贼藻院 酝院 阅晕粤 皂葬则噪藻则 阅蕴圆园园园曰 员鄄员缘院 悦援
早造燥藻燥泽责燥则蚤燥蚤凿藻泽曰员远院 凿凿匀圆韵曰 员苑院 悦援 责蚤凿蚤曰 员愿院 杂援 糟怎则贼蚤泽蚤蚤曰 员怨院 月援 则澡燥凿蚤灶葬曰 圆园院 哉援 增蚤则藻灶泽曰 圆员院 悦援 皂怎泽葬曰 圆圆院 砸援 泽燥造葬灶葬糟藻葬则怎皂曰 圆猿院 酝援 早则蚤泽藻葬曰 圆源院
孕援 糟葬责泽蚤糟蚤援
图 猿 建兰胶孢炭疽菌 孕悦砸和巢式 孕悦砸灵敏度检测
云蚤早援 猿 杂藻灶泽蚤贼蚤增蚤贼赠 凿藻贼藻糟贼蚤燥灶 燥枣 悦燥造造藻贼燥贼则蚤糟澡怎皂 早造燥藻燥泽责燥则蚤燥蚤凿藻泽 憎蚤贼澡 孕悦砸 葬灶凿 灶藻泽贼藻凿 孕悦砸
摇 摇 注院葬院引物 悦云员 辕 悦砸员常规 孕悦砸扩增曰遭院引物 陨栽杂员 辕 陨栽杂源与 悦云员 辕 悦砸员巢式 孕悦砸扩增遥 酝院阅晕粤 皂葬则噪藻则 阅蕴圆园园园曰员院双蒸水曰圆 耀 怨院员园尧员尧
员园 原员尧员园 原圆尧员园 原猿尧员园 原源尧员园 原缘尧员园 原远 滋早 辕 滋蕴 阅晕粤浓度遥 晕燥贼藻院 葬院 砸燥怎贼蚤灶藻 孕悦砸鄄葬皂责造蚤枣蚤藻凿 责则燥凿怎糟贼泽 憎蚤贼澡 贼澡藻 责则蚤皂藻则泽 悦云员 辕 悦砸员曰 遭院 灶藻泽贼藻凿 孕悦砸鄄
葬皂责造蚤枣蚤藻凿 责则燥凿怎糟贼泽 憎蚤贼澡 贼澡藻 责则蚤皂藻则泽 陨栽杂员 辕 陨栽杂源 葬灶凿 悦云员 辕 悦砸员援 酝院 阅晕粤 皂葬则噪藻则 阅蕴圆园园园曰 员院 凿凿匀圆韵曰 圆 原 怨院 员园袁 员袁 员园 原员袁 员园 原圆袁 员园 原猿袁 员园 原源袁
员园 原缘袁 员园 原远 滋早 辕 滋蕴 阅晕粤 糟燥灶糟藻灶贼则葬贼蚤燥灶袁 则藻泽责藻糟贼蚤增藻造赠援
圆援 猿援 猿 自然发病叶片组织中胶孢炭疽菌检测
对挑取的 愿怨 个样品进行分离鉴定袁其中 苑缘 个
样品分离获得的病原菌在 孕阅粤平板上生长迅速袁菌
丝疏松絮状袁菌落初生白色后逐渐变成墨绿色袁远 耀 苑
凿长满 怨 糟皂平板袁苑 耀 员园 凿 长出红色分子孢子团曰分
生孢子长椭圆形尧无色尧单孢尧表面光滑尧顶端钝圆袁
有的有油球遥 叶片伤口接种后的症状和自然发病的
症状一致袁从接种发病的建兰病叶上再分离获得性
状和分生孢子形态与原接种菌株一致的病原菌遥 根
据上述特征及致病性测定结果袁结合 悦葬灶灶燥灶 等咱员猿暂
报道袁将分离获得的苑缘个病原菌鉴定为胶孢炭
疽菌遥 同时袁孕悦砸检测结果表明袁常规 孕悦砸 从 苑缘 个
带菌样品中检测到 苑 园个带菌样品 袁检出率为
怨猿援 猿猿豫 曰而巢式 孕悦砸能检出全部带菌样品袁检出率
达 员园园豫 曰以健康叶片样品提取的 阅晕粤 为模板无扩
增条带遥 表明巢式 孕悦砸 检测结果和常规分离鉴定
的结果完全一致遥
猿 讨论
本试验中 员缘 个建兰胶孢炭疽菌的 陨栽杂 序列与
郧藻灶月葬灶噪中该菌的模式种序列咱员猿暂和其它胶孢炭疽
菌相似性高达 怨怨豫以上袁进一步表明所分离的 员缘
个菌株为炭疽属的胶孢炭疽菌遥 在系统发育树中袁
员猿个建兰胶孢炭疽菌菌株与郧藻灶月葬灶噪中其它胶孢
猿缘圆猿 期 姚锦爱等院建兰胶孢炭疽菌 陨栽杂序列分析及其 孕悦砸快速检测
炭疽菌聚为同一分支袁而菌株 员员 和 员缘 聚为另一分
支 袁说明陨栽杂序列种内存在遗传多样性曰菌株员员是
分离自福建连城的建兰金边四季兰袁菌株 员缘 是分离
自福州的建兰杂交种台湾小姐袁这两个品种在选育
方面进行了改良袁菌株的分子变异可能与品种以及
地域有一定的相关性遥 如 月葬则则赠 等咱员缘暂 和曾大兴
等咱员远暂认为炭疽菌的分类与菌株的地理来源有明显
的相关性遥
与核糖体 阅晕粤 中的 员愿杂尧缘援 愿杂和 圆愿杂的基因组
序列相比较袁陨栽杂员尧陨栽杂圆 作为非编码区袁承受的进化
选择压力较小尧相对变化较大袁在种间表现出较高的
差异袁可以为研究真菌的分类鉴定和分子检测提供
丰富的遗传信息咱员苑暂 遥 因此袁本试验根据 陨栽杂 序列间
的差异位点设计了建兰胶孢炭疽菌的特异性引物遥
王楠等咱员愿暂采用 酝蚤造造泽等咱怨暂设计的建兰胶孢炭疽菌特
异引物 悦早陨灶贼 辕 陨栽杂源 检测到草莓胶孢炭疽菌袁检测灵
敏度达 员园 责早 基因组 阅晕粤曰云则藻藻皂葬灶 等咱员怨暂根据病原
菌的形态特征将 缘苑 个以色列杏子炭疽病菌分离物
鉴别为胶孢炭疽菌袁但利用引物 悦早陨灶贼 辕 陨栽杂源 未扩增
出胶孢炭疽菌的特异条带遥 本试验设计的建兰胶孢
炭疽菌特异性引物 悦云员 辕 悦砸员 检测灵敏度可达 员 责早
基因组 阅晕粤袁对不同来源的菌株进行特异性测试袁
只有以胶孢炭疽菌基因组 阅晕粤 为模板时扩增出特
异性条带袁其它菌株如香蕉炭疽病菌尧建兰黑斑病
菌尧建兰圆斑病菌等均无扩增条带袁表明该对引物具
有较强的特异性遥
本试验建立的 孕悦砸 检测方法只能对建兰植株
中的胶孢炭疽菌进行定性检测袁尚不能进行定量检
测遥 近年来发展起来的实时荧光定量 孕悦砸 技术能
够对样品靶标 阅晕粤进行定量袁并实时检测植物病原
菌在寄主组织中的变化遥 目前实时荧光定量 孕悦砸
技术已广泛应用于植物病原真菌定量检测咱圆园 原 圆员暂 袁采
用该技术进行早期建兰炭疽病病原菌的定量检测将
是今后的研究方向遥
致谢院本试验得到了福建省农业科学院野植物有害生物灾变
规律及综合治理研究冶创新团队的支持及浙江省农业科学
院鹿连明博士的帮助袁特此致谢遥
参 考 文 献渊砸藻枣藻则藻灶糟藻泽冤
咱员暂 许东生援 中国建兰名品赏培援 北京院中国林业出版社袁圆园园怨
咱圆暂 陈翠云援 建兰无土栽培的基质筛选的研究援 嘉应学院学报袁
圆园园怨袁圆苑渊猿冤院愿愿 原 怨圆
咱猿暂 姚锦爱袁黄鹏袁余德亿袁等援 建兰炭疽病病原菌分离尧鉴定及
培养条件优化援 热带作物学报袁圆园员员袁猿圆渊员园冤院员怨源园 原 员怨源源
咱源暂 郧怎灶灶藻造 孕 杂袁 郧怎遭造藻则 宰 阅援 栽葬曾燥灶燥皂赠 葬灶凿 皂燥则责澡燥造燥早赠 燥枣 悦燥造造藻鄄
贼燥贼则蚤糟澡怎皂 泽责藻糟蚤藻泽 责葬贼澡燥早藻灶蚤糟 贼燥 泽贼则葬憎遭藻则则赠援 酝赠糟燥造燥早赠袁 员怨怨圆袁
愿源院 员缘苑 原 员远缘
咱缘暂 赵杰援 陨栽杂序列分析及其在植物真菌病害分子检测中的应
用援 陕西农业科学袁圆园园源渊源冤院猿缘 原 猿苑
咱远暂 曹丽华袁徐世昌袁陈万权袁等援 小麦叶锈菌的特异性分子诊断
检测技术援 植物保护学报袁圆园园苑袁猿源渊远冤院缘远员 原 缘远远
咱苑暂 陈怀谷袁方正袁陈厚德袁等援 小麦纹枯病菌的分子检测援 植物
保护学报袁圆园园缘袁猿圆渊猿冤院圆远员 原 圆远缘
咱愿暂 胡汉桥袁李信申袁梁甲贤袁等援 不同基因型香蕉分化芽 月杂灾
和 月月栽灾带毒率的 孕悦砸检测援 植物保护学报袁圆园员园袁猿苑渊员冤院
怨缘 原 怨远
咱怨暂 酝蚤造造泽 孕 砸袁 杂则藻藻灶蚤增葬泽葬责则葬泽葬凿 杂袁 月则燥憎灶 粤 耘援 阅藻贼藻糟贼蚤燥灶 葬灶凿 凿蚤枣鄄
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云耘酝杂 酝蚤糟则燥遭蚤燥造燥早赠 蕴藻贼贼藻则泽袁 员怨怨圆袁 怨愿院 员猿苑 原 员源源
咱员园暂 刑红梅袁丁平袁周晓云袁等援 红掌胶孢炭疽菌的分子检测援
植物病理学报袁圆园园愿袁猿愿渊圆冤院员员猿 原 员员怨
咱员员暂戴富明袁曾蓉袁戚龙君袁等 援 百合炭疽病病原菌孕悦砸检测
技术援 上海交通大学学报渊农业科学版冤 袁圆园员员袁圆怨渊源冤 院
缘缘 原 远园
咱员圆暂 何月秋援 真菌菌丝体培养和提取 阅晕粤 方法的改进援 菌物
系统袁圆园园园袁员怨渊猿冤院源猿源 原 源猿源
咱员猿暂 悦葬灶灶燥灶 孕 云袁 月怎凿凿蚤藻 粤 郧袁 月则蚤凿早藻 孕 阅袁 藻贼 葬造援 栽澡藻 贼赠责蚤枣蚤糟葬鄄
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员愿怨 原 圆园源
咱员源暂刘小勇袁田素忠袁秦国夫袁等 援 提取植物和微生物阅晕粤
的杂阅杂鄄悦栽粤月改进法援 北京林业大学学报袁员怨怨苑袁员怨渊猿冤 院
员园园 原 员园猿
咱员缘暂 月葬则则赠 栽袁 悦燥造造藻则葬灶 郧袁 郧造藻灶灶燥灶 酝袁 藻贼 葬造援 栽澡藻 员远泽 辕 圆猿泽 则蚤遭燥泽燥鄄
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贼藻则蚤葬援 郧藻灶燥皂藻 砸藻泽藻葬则糟澡袁 员怨怨员袁 员院 缘员 原 缘远
咱员远暂 曾大兴袁戚佩坤袁姜子德援 香蕉炭疽菌菌株亲缘关系的
砸粤孕阅分析援 菌物系统袁圆园园员袁圆园渊猿冤院猿圆源 原 猿圆怨
咱员苑暂 白树猛袁田黎援 陨栽杂 序列分析在真菌分类鉴定和分子检测
中的应用援 畜牧与饲料科学袁圆园园怨袁猿园渊员冤院缘圆 原 缘猿
咱员愿暂王楠袁王剑袁尹丹韩袁等 援 三重孕悦砸检测草莓灰霉病菌尧
炭疽病菌和黄萎病菌 援 中国农业科学袁 圆园员园袁源猿渊圆员冤 院
源猿怨圆 原 源源园园
咱员怨暂 云则藻藻皂葬灶 杂袁 酝蚤灶扎 阅袁 允怎则噪藻增蚤贼糟澡 耘袁 藻贼 葬造援 酝燥造藻糟怎造葬则 葬灶葬造赠泽藻泽
燥枣 悦燥造造藻贼燥贼则蚤糟澡怎皂 泽责藻糟蚤藻泽 枣则燥皂 葬造皂燥灶凿 葬灶凿 燥贼澡藻则 枣则怎蚤贼泽援 孕澡赠贼燥鄄
责葬贼澡燥造燥早赠袁 圆园园园袁 怨园渊远冤院 远园愿 原 远员源
咱圆园暂 蕴怎糟澡蚤 晕袁 悦葬责则藻贼贼蚤 孕袁 杂怎则蚤糟燥 郧袁 藻贼 葬造援 粤 则藻葬造鄄贼蚤皂藻 择怎葬灶贼蚤贼葬贼蚤增藻
孕悦砸 葬泽泽葬赠 枣燥则 贼澡藻 凿藻贼藻糟贼蚤燥灶 燥枣 杂责澡葬藻则燥责泽蚤泽 泽葬责蚤灶藻葬 枣则燥皂 蚤灶燥糟怎鄄
造葬贼藻凿 孕蚤灶怎泽 灶蚤早则葬 泽澡燥燥贼泽援 允燥怎则灶葬造 燥枣 孕澡赠贼燥责葬贼澡燥造燥早赠袁 圆园园缘袁
员缘猿渊员冤院 猿苑 原 源圆
咱圆员暂 李琼袁孔宝华袁范静华袁等援 应用 栽葬择酝葬灶探针实时荧光定量
孕悦砸技术早期检测稻瘟病援 植物病理学报袁圆园员员袁源员渊圆冤院
员员愿 原 员圆猿
渊责任编辑院高峰冤
源缘圆 植摇 物摇 保摇 护摇 学摇 报 源园 卷