全 文 ：第 34 卷 第 1 期
2015 年 2 月
大 豆 科 学
SOYBEAN SCIENCE
Vol． 34 No． 1
Feb． 2015
AMP对铝胁迫诱导丹波黑大豆柠檬酸分泌及其铝耐受性的影响
郭传龙，赵 艳，武孔焕，李昆志，陈丽梅
(昆明理工大学 生命科学与技术学院生物工程技术研究中心，云南 昆明 650500)
摘 要:为了考察 AMP(Adenosine 5’-monophosphate)对铝耐受型丹波黑大豆(ＲB)柠檬酸的分泌及铝抗性的影响，在
50 mmol· L-1铝溶液中添加 100 mmol· L-1 AMP 共处理 ＲB，结果表明 ＲB 根的相对生长率显著小于单独用
50 mmol·L-1铝胁迫处理的植株。免疫共沉淀分析显示铝胁迫下 AMP的存在降低 ＲB根中 14-3-3 蛋白与磷酸化质膜
H + -ATP酶的相互作用，使根尖质膜 H + -ATP酶活性降低约 1 倍，氢泵活性和 H +分泌能力显著降低，根柠檬酸的分泌
量减少约 1 倍。说明铝胁迫下 AMP通过抑制 14-3-3 蛋白和质膜 H + -ATP酶的互作来减少 ＲB 根尖的氢泵活性和柠
檬酸分泌作用，从而降低 ＲB根的相对生长率及其对铝胁迫的耐受性。
关键词:铝胁迫;丹波黑大豆;铝诱导的柠檬酸分泌;14-3-3 蛋白;质膜 H + -ATP酶
中图分类号:S565. 1 文献标识码:A DOI:10． 11861 / j． issn． 1000-9841． 2015． 01． 0082
收稿日期:2014-04-24
基金项目:国家自然科学基金(31260063)。
第一作者简介:郭传龙(1987-)，男，硕士，主要从事环境植物分子生物学方面的研究。E-mail:gclong123@ 126． com。
通讯作者:陈丽梅(1963-) ，女，教授，主要从事环境植物分子生物学方面的研究。E-mail:chenlimeikm@ 126． com。
Effects of AMP on the Al-induced Citrate Exudation and Al-resistance of Tamba
Black Soybean
GUO Chuan-long，ZHAO Yan，WU Kong-huan，LI Kun-zhi，CHEN Li-mei
(Biotechnology Ｒesearch Centre，Faculty of Life Science and Biotechnology，Kunming University of Science and Technology，Kunming 650500，China)
Abstract:To investigate the effect of Adenosine 5’-monophosphate (AMP)on the citrate secretion and Al-resistance of Al-
resistant Tamba black soybean (ＲB)． ＲB was cotreated with AMP and 50 mmol·L-1 Al． The results showed that the relate
root growth rate of ＲB co-treated with 100 mmol·L-1 AMP and 50 mmol·L-1 Al for 8 h was significantly lower than that of the
plants treated with 50 mmol·L-1 Al alone． Co-immunoprecipitation showed that the presence of AMP under Al stress de-
creased the Al-enhanced interaction of PM H + -ATPase and 14-3-3 protein in root tips of ＲB，which reduced PM H + -ATPase
activity by approximately 1-fold and thereby led to a significant decrease in H + efflux and citrate secretion (approximately 1-
fold)in ＲB roots． Those results indicated that AMP decreases H + activity and citrate exudation in ＲB via its inhibition on the
interaction between 14-3-3 protein and PM H + -ATPase under Al stress，thereby reducing the relate root growth rate of ＲB and
its Al-tolerance．
Keywords:Al stress;Al resistant black soybean;14-3-3 protein;Plasma membrane H + -ATPase;Adenosine 5’-monophos-
phate
铝毒是酸性土壤中影响植物生长和作物产量的
主要限制因素，主要体现在抑制植物根的生长和发
育，从而影响植物根系对水分和养分的吸收。铝诱
导有机酸的分泌被认为是植物抗铝的主要机制［1］。
质膜 H + -ATP酶是细胞膜上最丰富的蛋白质，有研
究结果显示，铝毒和缺磷胁迫下植物根尖质膜 H + -
ATP酶活性与根系柠檬酸的分泌有关［2］，在铝胁迫
下添加质膜 H + -ATP 酶的抑制剂矾酸盐(VA)可以
显著降低大豆质膜 H + -ATP酶的活性和根尖柠檬酸
的分泌量［3-4］。越来越多的研究结果证实 14-3-3 蛋
白对植物质膜 H + -ATP 酶的活性有重要的调控作
用，它通过与质膜 H + -ATP 酶的结合而增加其活
性［5］。在铝溶液中添加 14-3-3 蛋白与质膜 H + -ATP
酶结合的激活剂可增加大豆［6］和蚕豆［7］质膜 H + -
ATP酶活性和柠檬酸的分泌量。
体外实验研究表明腺苷-5’-单磷酸(Adeosine
5’-Monophosphate，AMP)能够抑制 14-3-3 蛋白与质
膜 H + -ATP酶的结合从而抑制质膜 H + -ATP酶的活
性，所以 AMP可用作质膜 H + -ATP酶的抑制剂。我
们之前的研究结果显示铝胁迫能够增强铝耐受型丹
波黑大豆 ＲB根尖质膜 H + -ATP酶的磷酸化及其与
14-3-3 蛋白的结合，从而提高质膜 H + -ATPase 的活
性并增强根尖柠檬酸的分泌［6］。为了考察 AMP 对
铝耐受型丹波黑大豆(ＲB)柠檬酸的分泌及铝抗性
的影响，本研究在铝胁迫下用 AMP处理 ＲB，考察铝
胁迫下 AMP对 ＲB 根的相对生长率、根尖中 14-3-3
蛋白和质膜 H + -ATPase的相互作用、根尖质膜 H + -
ATPase的活性、柠檬酸分泌作用及铝耐受性的影
1 期 郭传龙等:AMP对铝胁迫诱导丹波黑大豆柠檬酸分泌及其铝耐受性的影响 83
响。
1 材料与方法
1． 1 材料
铝耐受型丹波黑大豆(ＲB)种子在恒温(25℃)
黑暗的培养箱中浸种催芽，待种子长出 2 ～ 3 cm 根
后转移到有针眼孔的薄泡沫板上，置于完全营养液
中于温室中漂浮培养，每隔 1 d更换一次培养液。
1． 2 方法
1. 2. 1 ＲB的 Al胁迫和 AMP处理 选取生长一致
的 ＲB幼苗，先用 0． 5 mmol·L-1 CaCl2(pH4． 3)预处
理过夜后分两组处理，其中一组用 0，10，50，100
和 200 mmol·L-1的不同浓度的 AMP 分别处理 0，
2，4，8，12 和 24 h，作为单独的 AMP 处理组;另一
组在 50 mmol·L-1铝处理液中添加 0，10，50，100
和 200 mmol·L-1不同浓度的 AMP 分别处理 0，2，
4，8，12 和 24 h，作为 Al + AMP 同时处理，以不添
加铝和 AMP处理作为对照。
1． 2． 2 相对根伸长量(ＲＲG)的测定 铝对植物的
毒害作用最典型的症状表现在对根伸长的抑制作
用。因此通过测定根的伸长率来分析植物耐受铝毒
的能力。每个不同处理时间点做 6 个重复，记录经
0． 5 mmol·L-1 CaCl2 预处理过夜后处理前的根长，
然后再分别记录每个处理时间点处理后的根长度。
相对根伸长率(%)=(处理后根长度 －处理前
得根长度)/(对照处理后的根生长度 －对照处理前
的根长度)× 100。
1． 2． 3 质膜的分离 选取生长一致水培 14 d 的
ＲB幼苗，先用pH4． 3 的0． 5 mmol·L-1 CaCl2 预处理
过夜，然后分别置于 0． 5 mmol · L-1 CaCl2、100
mmol·L-1AMP(含有 0． 5 mmol·L-1 CaCl2)、50 mmol·
L-1加100 mmol·L-1AMP(含有0． 5 mmol·L-1 CaCl2)中
处理 8 h，收集处理后的 ＲB 根尖。采用 Dextran (右
旋糖苷)T500 /PEG 3350 组成的两相法提取根尖组
织质膜。
1． 2． 4 质膜纯度的检测和质膜 H + -ATPase 活性和
H +泵活性的测定 H + -ATP 酶主要有 3 种类型:P
型(质膜)、V型(液泡膜、内质网膜、高尔基体膜等)
和 F型(线粒体和叶绿体) ，其专一性抑制剂分别为
Na3VO4、KNO3 和 NaN3，根据 H
+ -ATP 酶对各专一
性抑制剂的敏感性来检测所得分离质膜的纯度。使
用 Bradford的方法测定质膜蛋白的浓度，然后参照
Guo等［6］的方法测定质膜 H + -ATP的活性，质膜 H +
泵活性的测定参照 Guo等［6］的方法。
1． 2． 5 免疫共沉淀(CO-IP)和Western Blot 分析 用
免疫共沉淀的方法分析 ＲB 根质膜 H+ -ATP 酶与 14-
3-3蛋白的相互作用。在 200 μg 质膜蛋白溶液中添加
适量 Triton X-100或 0． 02% Brij (w/v)，使原位膜翻转
充分暴露H+ -ATP酶蛋白的 C末端，再加入特异性质
膜 H+ -ATP 酶磷酸化抗体(VHA2p)［7］及 protein A/G
plus-agarose 沉淀相互结合的质膜 H+ -ATP 酶与
14-3-3蛋白，取适量沉淀蛋白于聚丙烯酰胺凝胶中进行
电泳分离沉淀蛋白。经过电转 PVDF 膜后，使用
VHA2p抗体或大豆 14-3-3蛋白抗体作一抗进行West-
ern Blot分析，加入二抗观察结果。
1． 2． 6 根柠檬酸分泌量的测定 ＲB的根用 1． 4 的
方法处理后，收集含有根系分泌物的处理液，将处理
液真空干燥后溶解于蒸馏水中，用滤器过滤后使用
HPLC法测定柠檬酸的含量［6］。柠檬酸的含量根据
标准曲线计算。
1． 3 数据分析
各项生理指标的检测均进行 3 次生物学重复，采
用统计学分析软件 SPSS16． 0 进行单因素方差分析
(one-way ANOVA)进行统计学分析(P ＜0． 05)。
2 结果与分析
2． 1 铝胁迫下添加 AMP对 ＲB根相对生长量的影响
由图 1A 可知，在没有铝胁迫条件下，低浓度
(10 和 50 mmol·L-1)的 AMP 处理对 ＲB 根的生长
有微弱的抑制作用，且这两个浓度抑制生长的效果
类似，与对照相比，在每个时间点对 ＲB 根生长的抑
制效率大约为 30% 左右。高浓度(100 和 200
mmol·L-1)的 AMP 处理对 ＲB 根生长的抑制作用
较为明显，随着处理时间的增加，100 mmol·L-1的
AMP处理对 ＲB 根的生长抑制作用呈现增强的趋
势，在 2 ～ 4 h内，ＲB 根的生长大约被抑制 35%，在
处理 8 ～ 12 h内 ＲB 根的生长被抑制 50%左右，在
AMP处理24 h时，ＲB根的生长被抑制 60%;当 AMP
的处理浓度达到 200 mmol·L-1时，处理 2 h 时 ＲB
根的生长被抑制 50%左右，而后随着处理时间的增
加抑制作用更为明显，在处理4 ～ 24 h内，AMP 对
ＲB根的生长抑制作用趋于稳定状态，根的生长大
约被抑制 65%。
由图 1B可知，在 50 mmol·L-1铝胁迫下随着处
理时间的增加根的相对生长量呈现出微弱的下降趋
势，在 Al 处理2 ～ 24 h时根的生长大约被抑制 30%
左右。在铝胁迫的同时添加不同浓度的 AMP 处理
不同时间后，ＲB根 ＲＲG的变化模式与单独的 AMP
处理一致，但 Al 和 AMP 同时处理后对 ＲB 根生长
的抑制作用更为严重，在 50 mmol·L-1的 Al 胁迫
84 大 豆 科 学 1 期
下，添加 10 和 50 mmol·L-1的 AMP 处理时，ＲB 根
的生长大约被抑制 40%;添加 100 mmol· L-1的
AMP在处理时间为 2 h时根的 ＲＲG为 53%，在 2 ～
12 h时期内 ＲB根的 ＲＲG大约降低至 50%左右，当
处理时间达到 24 h 时，ＲB 根的 ＲＲG 大约为 30%;
添加 200 mmol·L-1的 AMP 时，随着处理时间的增
加 AMP对 ＲB根生长抑制作用增强，在 4 ～ 24 h 内
ＲB根的生长大约被抑制 70%。这些结果说明 AMP
的存在降低了 ＲB对铝胁迫的耐受性。
A:不同浓度 AMP对ＲB的ＲＲG的影响;B:在50 mmol·L-1铝胁迫下添加不同浓度的AMP对ＲB的ＲＲG的影响;C:在50 mmol·L-1铝
胁迫添加100 mmol·L-1的 AMP处理8 h后 ＲB的 ＲＲG变化。
A:Effect of different content of AMP on ＲＲG of ＲB;B:Effect of different content of AMP with on ＲＲG of ＲB;C:Change of ＲＲG of
ＲB treated with 100 mmol·L-1 AMP and 50 mmol·L-1 Al stress for 8 hours．
图 1 在无铝和铝胁迫下添加 AMP对 ＲB根的相对生长率(ＲＲG)影响
Fig． 1 Effects of AMP application on the ＲＲG of ＲB roots under Al stress and non-Al stress
以上的结果说明低浓度(10 和 50 mmol·L-1)
的 AMP处理对 ＲB 根生长的抑制效果不显著，当
AMP浓度增加到 100 ～ 200 mmol·L-1以上时对 ＲB
根生长的抑制作用才比较明显(达到 50% ～ 65%) ，
并且在整个处理时期(2 ～ 24 h)内的抑制效果类似。
在 50 mmol·L-1的 Al胁迫下添加 AMP 同时处理对
ＲB 根生长的抑制效 果 更 为 明 显，因 为 100
mmol·L-1的 AMP处理 8 h 时就能产生稳定的抑制
效果，故后续试验中 AMP的浓度为 100 mmol·L-1，
处理时间为 8 h。由图 1C 在无铝和有铝胁迫下添
加 100 mmol·L-1的 AMP处理 8 h 后 ＲB 根 ＲＲG的
变化可知，单独的 AMP 处理 8 h 后 ＲB 根的生长大
约被抑制 50%，50 mmol·L-1的 Al单独胁迫处理8 h
时 ＲB根的生长被抑制 30%，在 Al胁迫下添加 AMP
处理8 h时对 ＲB根生长的抑制增加至 60%。
2． 2 铝胁迫下添加 AMP 对 ＲB 根尖质膜 H + -ATP
酶与 14-3-3 蛋白互作及其活性的影响
用磷酸化质膜 H + -ATP酶抗体做 Co-IP分析 50
mmol·L-1铝胁迫下添加 100 mmol·L-1 AMP 处理
ＲB根 8 h 后质膜 H + -ATP 酶的磷酸化水平及与之
结合的 14-3-3 蛋白量的变化(图 2A)。结果说明与
对照 CK相比，ＲB经铝胁迫处理后质膜 H + -ATP 酶
磷酸化水平显著增高(图 2A) ，结合的14-3-3蛋白量
增加(32%) (图 2B);而 ＲB 经 AMP 处理后质膜
H + -ATPase磷酸化水平显著下降，结合的 14-3-3 蛋
白量也减少(16%) (图 2B);用铝和 AMP 同时处理
ＲB时，根尖质膜 H + -ATP酶的磷酸化水平下降至低
于对照的水平(图 2A) ，且与之结合的 14-3-3 蛋白
量也显著降低至低于对照的水平，说明铝胁迫下添
加 AMP降低铝对质膜 H + -ATP 与 14-3-3 蛋白互作
的诱导作用。
对 50 mmol·L-1铝胁迫下添加 100 mmol·L-1的
AMP处理 ＲB根 8 h 后根尖质膜 H + -ATP酶的活性
(图 2C)进行研究，结果表明:ＲB 根尖质膜 H + -ATP
酶的活性变化与质膜 H + -ATPase 磷酸化水平变化
一致，与 CK相比，单独的铝胁迫处理使 ＲB 根尖质
膜 H + -ATP 酶的活性提高 50%;AMP 单独处理后
ＲB根尖质膜 H + -ATP 酶活性降低 34． 4%;Al 和酶
AMP同时处理后其活性降低 43． 7%，说明铝胁迫下添
加 AMP降低铝对质膜H+ -ATP酶活性的诱导作用。
2． 3 铝胁迫下添加 AMP 对 ＲB 根尖质膜 H +泵活
性和柠檬酸分泌的影响
在 50 mmol·L-1铝胁迫下添加 100 mmol·L-1
AMP处理 ＲB根 8 h后根尖的的 H +泵活性(图 3A)
及 H +分泌作用(图 3B)结果表明:与对照 CK相比，
1 期 郭传龙等:AMP对铝胁迫诱导丹波黑大豆柠檬酸分泌及其铝耐受性的影响 85
铝胁迫处理(+ Al)使 ＲB 根尖的 H +泵活性显著提
高至对照的 157． 9%。在溴甲酚酯染色实验中，ＲB
根周围黄色比 CK的重，说明铝诱导 ＲB 的 H +外排
作用。在铝胁迫处理时添加 AMP 下(Al + AMP)使
ＲB 根尖的 H +泵活性降低至对照的 39． 5%，在溴甲
酚酯染色实验中也观察相应的变化，ＲB 根周围黄
色变浅，范围变小，说明铝胁迫下添加 AMP 抑制质
膜 H + -ATP酶的活性的同时也降低 ＲB 根尖的氢泵
活性及 H +分泌作用。在质膜提取液中加入短杆菌
肽后显著消除了 H +泵的活性，这证实所提取的质
膜纯度比较高，能够用于 H +泵活性的分析。
A:在 50 μmol·L-1铝胁迫处理下添加 100 μmol·L-1的 AMP处理 8 h后根尖质膜H + -ATP酶的磷酸化水平变化;(B)质膜 H + -
ATP和 14-3-3 蛋白互作的相对定量;(C)质膜 H + -ATPase活性。
A:Change of PM H + -ATPase in root tips of ＲB treated with 50 μmol·L-1Al and 100 μmol·L-1AMP for 8 hours;B:Ｒelative amount
of pGHA and 14-3-3 protein;C:Activety of PM H + -ATPase．
图 2 铝胁迫下添加 AMP对 ＲB质膜 H + -ATP酶磷酸化及其活性的影响
Fig． 2 Effects of AMP application on the interaction between PM H + -ATPase and 14-3-3 protein，
and activity of PM H + -ATPase in root tips of ＲB under Al stress and non-Al stress
A:ＲB根尖 H +泵活性;B:H +分泌的溴甲酚酯染色;C:ＲB根柠檬酸分泌水平。
A:Ｒoot tip H + activity;B:Bromocresol ester dyeing;C:Citrate secretion level of ＲB root．
图 3 铝胁迫下添加 AMP对 ＲB根尖 H +泵活性和 H +分泌的影响
Fig． 3 Effects of AMP application on H + pump activity，H + efflux，and citrate
secretion in ＲB under Al stress and non-Al stress
对 ＲB根柠檬酸分泌的检测结果说明柠檬酸分
泌量的变化(图 3C)与质膜 H + -ATP酶的活性一致，
ＲB 经铝处理后柠檬酸的分泌量大约是 CK 的
1． 6 倍，AMP单独处理后其柠檬酸的分泌量仅达到
CK的 56%。Al 和 AMP 的同时处理使 ＲB 根柠檬
酸的分泌量降低为 CK 的 60%，说明铝胁迫下添加
AMP降低质膜 H + -ATP酶的活性的同时导致 ＲB根
柠檬酸分泌水平下降。
3 结论与讨论
在 14-3-3 蛋白的第 4 个和第 5 个螺旋中有
86 大 豆 科 学 1 期
AMP的结合位点［8］，因此 AMP 是 14-3-3 蛋白的一
个普遍调控因子。有 AMP结构的类似物 AＲCIＲ 可
以穿过细胞膜被吸收进入细胞内，具有 AMP 的功
效［8-9］。Paul 等［10］的研究表明 AＲCIＲ(5-aminoimid-
azole-4-carboxamide ribonucleoside monophosphate)在体
内环境中能与 14-3-3 蛋白结合，因而能抑制 14-3-3 蛋
白与靶蛋白的结合。体内和体外实验结果说明 AMP
抑制 14-3-3 蛋白与质膜 H + -ATPase C 末端的结合。
虽然还没有研究报道 AMP 处理是否抑制植物细胞
的生长或伸长，但 Zhao 等［11］的研究说明转基因烟
草中质膜 H + -ATP酶的共抑制表达影响转基因植物
的生长，PMA4 是烟草中表达最广泛的质膜 H + -ATP
酶亚型，其表达被抑制后转基因植物气孔开度减少，
光合作用水平下降，生长受抑制，植株矮小，因此不
难理解本研究观察到 AMP 处理抑制 ＲB 根的生长
作用。AMP的作用效果与质膜 H + -ATP 酶的共抑
制表达相似。铝胁迫增加 ＲB 根中质膜 H + -ATP
酶与 14-3-3 的结合［6］，在铝胁迫下添加 AMP 减少
二者的结合，降低铝对质膜 H + -ATP 酶与 14-3-3
互作的诱导作用，从而抑制 ＲB 根的生长作用，使
ＲＲG下降，耐铝能力减弱。由于 AMP 是细胞的正
常代谢中间产物，在细胞内可被代谢，因此需要较
高的浓度其作用效果才较显著，低浓度时其作用
效果很小。
VA因为可以和 ATP竞争结合质膜 H + -ATP 酶
的催化位点，所以也是质膜 H + -ATP 酶的一种抑制
剂，铝胁迫下添加 VA的处理显著降低质膜 H + -ATP
酶的活性，因此也降低大豆柠檬酸的分泌作用［3］，
在磷缺乏条件下 VA的存在也降低白羽扇豆羽根质
膜 H + -ATPase 的活性和柠檬酸分泌量［12-13］。AMP
因为具有 14-3-3 蛋白的结合位点，所以可以抑制
14-3-3 蛋白与质膜 H + -ATP 酶的相互作用，从而降
低质膜 H + -ATP酶的活性，本研究结果证实 AMP的
添加确实降低了无铝条件下 ＲB根中 14-3-3 蛋白与
质膜 H + -ATP酶的结合及质膜 H + -ATP 酶的活性，
抵消铝胁迫对 14-3-3 蛋白与质膜 H + -ATP 酶互作
的诱导，减少质膜 H + -ATP 酶的活性和质子的外排
作用及柠檬酸的分泌作用，可见 AMP虽然与 VA 作
用机制不同，但都有相似的作用效果。
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