全 文 ：收稿日期:2008-05-04;修回日期:2008-06-02
基金项目:国家自然科学基金(30770221)
作者简介:林颖(1984-),女 ,四川省成都 ,硕士研究生 ,研究方向为园林植物与观赏园艺.E-mail:linying1225@yahoo.com.cn
通讯作者:白洁.E-mail:baijie@scu.edu.cn
文章编号:　0490-6756(2008)06-1527-06
黄蜀葵查尔酮合成酶基因 AmCHS
克隆及序列分析
林　颖 , 郭秀莲 , 朱勋路 , 林　莎 , 白　洁 , 陈　放
(四川大学生命科学院 , 成都 610064)
摘　要:从黄蜀葵(Abelmoschus manihot)花瓣中通过简并引物克隆得到查尔酮合成酶基因
cDNA 核心序列 ,根据核心序列设计特异引物 ,再应用 5′RACE 和 3′RACE 技术分别扩增该序
列的 5′末端和 3′末端序列 ,最后通过序列拼接获得黄蜀葵查尔酮合成酶基因(AmCHS)cDNA
全序列.序列分析结果表明 AmCHS cDNA编码区长 1170 bp ,编码 389个氨基酸.其氨基酸序
列与其它已知高等植物 CHS 基因具有很高的同源性 ,并且包含了 CHS 具有的活性位点和催
化位点等保守性位点.
关键词:黄蜀葵;查尔酮合成酶基因(CHS);RACE 技术;序列分析
中图分类号:Q78　　　文献标识码:A
Cloning and analysis of chalcone synthase gene from
Abelmoschus manihot (Linn.)
LIN Y ing , GUO Xiu-Lian , ZHU Xun-Lu , LIN Sha , BAI Jie , CHEN Fang
(College of Life Sciences , Sichuan University , Chengdu 610064 , China)
Abstract:With degenerated primers designed acco rding to repo rted sequence of CHS gene , a fragment about
243 bp from Abelmoschus manihot f lower cDNA was isolated by PCR.The gene specific primers were de-
signed and synthesized f rom the co re sequence , and then the full-leng th cDNA was obtained by 5′-and 3′-
RACE , which contained a single open reading f rame of 1170 bp , encoding a polypeptide of 389 amino acids.
The deduced amino acid sequence show ed 87%～ 93%homology to CHS of other higher plants and included
almost all the conservative sites of CHS.
Key words:Abelmoschus manihot (Linn.), chalcone synthase gene(CHS), RACE , sequence analysis
1　引　言
查尔酮合酶(Chalcone Synthase , CHS)是植物
花色素苷等类黄酮物质合成途径中的一个关键酶 ,
它催化丙二酰辅酶 A(malony CoA)的三个乙酸基
与对羟基苯丙烯酰辅酶 A(coumaryc CoA)的一个
乙酸基的缩合 ,生成基本结构为一个三碳环连接两
个芳香环的四羟基查尔酮(naringenine chalcone),
再经过异构后能导致花色素苷 、黄酮 、异黄酮 ,黄酮
醇等类黄酮物质的合成[ 1] .查尔酮合成酶的表达
受 UV 照射[ 2] 、真菌侵染等条件诱导[ 3] ,且在花中
特异性表达[ 4] ,其表达量的改变可能导致植物花
色的变异[ 5] .目前 ,通过调控 CHS基因的表达量来
改变花色在矮牵牛中研究得比较深入 ,但在黄蜀葵
(Abelmoschus manihot)中未见报道.
黄蜀葵系锦葵科 ,秋葵属 1年生或多年生粗壮
直立草本 ,叶掌状深裂 、花大 、单生叶腋和枝端 ,花
冠 5瓣 ,淡黄色或白色 ,内面基部紫色 ,具有较高的
2008年 12月 　
第 45卷第 6期　
四川大学学报(自然科学版)
Journal of Sichuan University (Natural Science Edit ion)
　 Dec.2008
Vol.45　No.6
观赏价值 ,可作为园林观赏花卉.黄蜀葵原产我国 ,
适应性较强 ,但花色较为单一 ,若能使花色多样化 ,
则可以更好的用与花坛 ,花镜等园林应用中.
据《本草纲目》记载:其花:气味甘 、寒 、滑 、无
毒 ,主治小便淋及催生 ,治诸恶疮脓水久不瘥者 ,作
末敷之即愈 ,为疮家要药 ,消疽肿 ,浸油涂汤火伤
等[ 6] .近年来 ,随着对黄蜀葵有效成分 、药理病理
等研究的逐渐深入 ,黄蜀葵潜在的药用开发价值已
愈来愈受到重视 ,发现黄蜀葵总黄酮具有治疗心血
管疾病 、抑菌 、抗炎和对脑缺血损伤起保护的作
用[ 7] .
鉴于此 , 本研究希望通过克隆得到黄蜀葵
CHS基因序列 ,对黄蜀葵进行品种改良.一方面可
使其花色多样化 ,在园林上有更好的观赏价值;另
一方面 ,黄蜀葵花的总黄酮有重要的医疗保健作
用 ,用基因工程方法提高总黄铜的含量 ,将对黄蜀
葵的综合利用乃至黄蜀葵产业发展具有重要意义.
2　材料与方法
2.1　材　料
以黄蜀葵(Abelmoschus manihot)为试材 ,以花
瓣制备 RNA ,花瓣取自本实验室栽培的黄蜀葵花.
RNA提取试剂盒(RNeasy Mini)购自 QIAGEN 公
司;Reverse Transcriptase XL (AMV)酶 , Taq DNA
聚合酶 , TDT 酶 , RNase H 购自 TaKaRa 公司;胶
回收试剂盒购自 TIANGEN 公司;引物由 Invitro-
gen公司合成;测序由博瑞克公司以及 Invit rogen
公司进行.
2.2　方　法
2.2.1　总 RNA提取和 cDNA第一链的合成　以
黄蜀葵黄色花瓣制取总 RNA ,提取与纯化按照
Q IAGEN公司 RNeasy M ini试剂盒推荐方法进行.
cDNA 第一链的合成使用 Reverse Transcriptase XL
(AMV)酶 , 以黄蜀葵总 RNA 为模板 , oligo (dT)
18为逆转录引物 ,在冰上进行操作.反转录体系
为:1 μg 总 RNA 、4 μL 反应缓冲液(5 ×)、1 μL
dNTPs、0.5 μL RNase inhibi tor 、1 μL OligodT18 、
0.3 μL AMV (200 U/L),用 DEPC 处理过的水补
足体积至 20 μL.反转录条件为 72 ℃水浴 10 min ,
冰上急冷 2 min ,42 ℃反应 1 h.
2.2.2　黄蜀葵 CHS cDNA 核心片段的克隆　根
据已知植物CHS核甘酸序列(mRNA)的保守区域
设计合成下述 4 个正向或反向简并引物做槽式
PCR.L1:5′GA(G/A)A A(G/A)TTCAAGCG-
CATGTG 3′;L2:5′AT(C/A/T)A(G/A)GAA(G/
A)(C/A)G(G/A)TACATG 3′;F1:5′G TAGTC
(G/A)GC(G/C)CC(G/A)GGCATGT3′;F2:5′CA
(G/A)CC(C/A/ T)T G(T/C)TGGTAC ATCAT
3′.其中 L1与 F2为一对外侧引物 , L2 与 F1 为一
对内侧引物.
引物 L2与 F1 ,预期 PCR产物片段大小分别
为 197 bp ～ 233 bp左右.以上述 cDNA为模板 ,用
Taq DNA 聚合酶进行巢式 PCR扩增 ,以引物 L1 ,
F2进行巢式 PCR的首轮扩增 ,反应体系为 cDNA
1μL 、10×PCR缓冲液(无Mg2+)2μL 、dNTP (2.5
mmol/L)2.4 μL 、Taq 酶 0.25 μL (2 U/L),以及
L1 、F2(100 mol/L)各1 μL ,Mg2+(25 mmol/L)2.4
μL ,加 ddH2O 至 20 μL.扩增条件为:94 ℃预变性
5 min ,94 ℃50 s , 49 ℃50 s ,72 ℃1 min ,共 30个
循环 ,最后 72 ℃延伸 10 min.取首次扩增产物 1
μL ,稀释 20倍作为第二轮扩增的模板 ,用引物 L2 、
F1进行巢式 PCR的第二轮扩增 ,反应体系与巢式
PCR的首轮扩增相同 ,扩增条件为:94 ℃预变性 5
min , 94 ℃50 s ,50 ℃50 s ,72 ℃1 min ,共 30个循
环 ,最后 72 ℃延伸 10 min.
2.2.3　黄蜀葵 CHS 5′端 cDNA 扩增　根据克隆
得到的黄蜀葵 CHS 的 cDNA 核心片段以及巢式
PCR的特征设计 5′RACE 反转录引物 chs1:5′
TCGTTTGGGCTGCCGATACAAG 3′,一对 5′RACE
巢式 PCR 特 异 引 物 chs2:5′AACCGCAGT-
GATTTCCGAGCAA 3′;chs3:5′CGAAACAACCCT-
GTTGGTACATC 3′以及 5′端锚定引物 TONG1:5′
GCTGTCAACGATACGCTACGTAACGGCATGACAG
TGTTTTTTTTTTTTTTTTTT 3′;TONG2:5′GT-
CAACGATACGCTACGTAAC 3′.
取 5 μL 总 RNA (约 5 μg),以 chs1为引物按
上述反转录体系合成 cDNA第一链后 ,加入 RNase
H ,37 ℃水浴 30 min 分解 mRNA ,接着用 TDT 酶
在单链 cDNA的 5′端加上一段 polyA 结构.为后续
的巢式 PCR创造条件(polyA 可与 TONG1的一段
TT TTTTT TTTTTT TTTTT 碱基互补结合).用
TONG1 , chs2引物进行巢式 PCR的首轮扩增 ,反
应体系为 cDNA加尾产物 1 μL 、10×PCR 缓冲液
(无 Mg2+)2.5 μL 、dN TP (2.5 mmol/L)2μL 、Taq
酶 0.25μL(2 U/ L)、以及引物 TONG1 , chs2(100
mol/L)各 1 μL 、Mg2+(25 mmol/L)1.5 μL 、加
ddH2O 至 25 μL.PCR反应条件为:94 ℃预变性 5
min , 94 ℃50 s ,58 ℃50 s ,72 ℃1 min ,共 30个循
1528 四川大学学报(自然科学版) 第 45卷
环 ,最后 72 ℃延伸 10 min.取首次扩增产物 1μL ,
稀释 20 倍作为第二轮扩增的模板 , 用引物
TONG2 , chs3 进行巢式 PCR的第二轮扩增 ,反应
体系与巢式 PCR的首轮扩增相同.扩增条件为:94
℃预变性 5 min , 94 ℃ 50 s , 60 ℃ 50 s , 72 ℃ 1
min ,共 35个循环 ,最后 72 ℃延伸 10 min.
2.2.4　黄蜀葵 CHS 3′端 cDNA 扩增　根据克隆
得到的黄蜀葵 CHS 的 cDNA 核心片段设计 3′
RACE反转录引物 TONG1:5′GCTGTCAACGAT-
ACGCTACGTAACGGCATGACAGTGTTTTT TT
TTTTT TTTTTT3′和一对 3′RACE 巢式 PCR特
异引物 f1:5′GAAAGAAGCCGCTACCAA 3′;f2:
5′CTGGTGTAGACATGCCCG3′,以及 3′端锚定引
物 TONG3:5′TACGTAACGGCATGACAGTG 3′.
首先以 TONG1 为引物按上述反转录体系进
行逆转录反应 , 合成 cDNA 第一链.然后以
TONG3和 f1为引物进行巢式 PCR的首轮扩增 ,
反应体系与 5′RACE巢式 PCR的首轮扩增相同.
扩增条件为:94 ℃预变性 5 min , 94 ℃50 s ,49 ℃
50 s , 72 ℃1 min ,共 30个循环 ,最后 72 ℃延伸10
min.巢式 PCR第二轮扩增所用引物为 TONG3和
f2 ,PCR反应体系与 5′RACE巢式 PCR的首轮扩
增相同 , 扩增条件为:94 ℃预变性 5 min , 94 ℃
50 s , 50 ℃50 s , 72 ℃1 min ,共 35个循环 ,最后72
℃延伸 10 min.
2.2.5　黄蜀葵 CHS 核苷酸序列分析 、同源比对和
系统树构建 　PCR 产物经测序后 , 利用 Vector
N TI 软件包对蜀葵CHS基因核心片段以及3′末端
和 5′末端序列结果进行拼接 ,获得全长 cDNA ,命
名为AmCHS.对其进行 ORF 分析 ,推导氨基酸序
列;对推导的蛋白质氨基酸序列进行生物学意义的
分析;利用 NCBI 上的 Blast 工具以及 DNAMAN
软件将黄蜀葵中克隆得到的 CHS 基因与数据库中
的其他CHS 序列进行同源序列比对;利用 MEGA4
软件的 NJ法构建系统树.
3　结　果
3.1　黄蜀葵 CHS cDNA核心片段的扩增
采用简并引物 L1和 F2进行巢式 PCR第一轮
扩增仅得到 1条模糊的条带 ,进一步采用内侧锚定
简并引物 L2和 F1进行巢式 PCR的第二轮扩增到
1条约 240 bp的 DNA片段 ,与预计的目的片段相
似(图 1).回 收 后 克 隆 至 pMD18-T 载 体
(TaKaRa)[ 8] ,转化感受态 DH5α, 利用 L2 、F1 引
物 ,将通过菌落 PCR反应检测得到阳性克隆进行
测序 , 得到 243 bp 的 cDNA 片段.测序后通过
NCBI上的 BLAST 工具分析 ,证实为 CHS序列.
图 1　CHS 基因 cDNA核心片段 RT-PCR产物
Fig.1　RT-PCR products of part of cDNA
o f CHS gene
M:DL 2000 DNA marker;1:引物 L2和F1扩增产物
3.2　黄蜀葵 CHS 5′端的扩增
根据克隆的黄蜀葵 CHS cDNA 核心片段设计
3个特异引物 chs1 、chs2 和 chs3 ,采用 5′RACE 的
方法扩增 CHS的 5′端.经巢式 PCR两轮扩增得到
1条约 300 bp的 DNA 片段(图 2),回收后克隆至
pMD18-T 载体(TaKaRa),转化感受态 DH5α,利用
chs3 、TONG2引物 ,将通过菌落 PCR反应检测得
到阳性克隆测序得到 346 bp 的 cDNA 片段.测序
后通过 NCBI上的 BLAST 工具分析 ,证实该序列
为 CHS 5′端序列 ,且含有开放阅读框的 5′端完整
序列.
图 2　CHS 基因 cDNA 5′端 RT-PCR产物
Fig.2　RT-PCR products of part of cDNA 5′end
of CHS gene
M:DL 2000 DNA marker;1:引物 chs3和TONG2扩增产物
3.3　黄蜀葵 CHS 3′端的扩增
根据克隆的黄蜀葵 CHS cDNA 核心片段设计
1529第 6期 林颖等:黄蜀葵查尔酮合成酶基因 AmCHS 克隆及序列分析 　
2个特异引物 f1和 f2 ,采用 3′RACE 的方法扩增
CHS 的 3′端.经巢式 PCR两轮扩增得到 1条大约
1 000 bp的 DNA 片段(图 3), PCR 产物回收后克
隆至 pMD18-T 载体 ,转化感受态 DH5α,利用 f1 、
TONG3引物 ,将通过菌落 PCR反应检测得到阳性
克隆进行测序得到约 919 bp 的 cDNA 片段.测序
后通过 NCBI上的 BLAST 工具分析 ,证实为 CHS
基因的 3′端序列.
图 3　CHS 基因 cDNA 3′端 RT-PCR产物
Pig.3　RT-PCR products of part o f cDNA
3′end of CHS gene
M:DL 2000 DNA marker;1:引物 f1和TONG3扩增产物
将扩增得到的 CHS 基因的 cDNA核心片段及
其3′端序列和 5′端序列进行拼接 ,处理后的序列
在GenBank 数据库中利用 ORF Finder 进行阅读
框搜寻 ,最终得到黄蜀葵 CHS基因完整的 ORF 序
列为 1170 bp ,命名为 AmCHS.
3.4　黄蜀葵 CHS氨基酸序列的分析
CHS有较多的保守位点 ,如 4个在所有 CHS
和类 CHS 的酶中均相同的活性位点 Cys164 、
Phe215 、His303和Asn336;5个组成底物(对羟基苯
丙烯酰辅酶 A)结合口袋的位点 Ser133 、Glu192 、
Thr194 、Thr197和 Ser338;7个组成环化反应回袋
的位点 Thr132 、Met137 、Phe215 、Ile254 、Gly256 、
Phe265 和 Pro375 都是保守位点[ 9] .利用 DNA-
MAN软件对 AmCHS 序列进行分析 ,发现该基因
最大开放阅读框为 1170 bp ,编码 389个氨基酸序
列.对其编码蛋白质的特征分析表明 ,AmCHS 氨
基酸序列在上述 16个位点上 ,都是保守无变异的;
并且还有特别保守的信号序列G372FGPG[ 10] .
3.5　黄蜀葵 CHS的同源比对与系统树构建
AmCHS编码的氨基酸序列与 GenBank 中随
机抽样的物种矮牵牛(Petunia ×hybrida , gi:
20542)、覆盆子(Rubus idaeus , gi:22086369)、草莓
(Fragaria×ananassa , gi:62766610)、葡萄(Vitisv
ini fera , gi:18376653)、德国鸢尾(Iris germanica ,
gi:83281124)、陆地棉(Gossypium hirsutum , gi:
153805696)的 CHS 基因的同源性 ,分别为 91%、
91%、91%、93%、87%和 97%,据此可以说明获得
的基因为 CHS.GenBank登录号为 EU573212.
根据随机抽样物种的查尔酮合成酶基因氨基
酸序列的同源程度比较 ,用 MEGA4软件的 NJ 法
构建它们系统进化树(图 4).发现克隆得到的 Am-
CHS与陆地棉亲缘关系最近 ,这与它们同属一个 q
科(锦葵科)有关;与德国鸢尾亲缘关系最远 ,这与
它们系属不同纲(德国鸢尾为百合纲 ,黄蜀葵为木
兰纲)有关.
图 4　根据查尔酮合成酶氨基酸序列构建的进化树
Fig.4　Phylogeneitc tree based on the amino acid sequences of CHS
1530 四川大学学报(自然科学版) 第 45卷
3　讨　论
CHS是一个多基因家族 ,有 8 ～ 10个成员 ,其
具有较多的保守位点 , CHS 表达一般为花特异性 ,
只有紫外线照射或植物病原体侵染等条件下才能
在叶 、茎等组织中诱导表达.本试验克隆的黄蜀葵
查尔酮合成酶基因 AmCHS具有 CHS基因所特有
的 4活性位点;5个组成底物(对羟基苯丙烯酰辅
酶A)结合口袋的位点;7 个组成环化反应回袋的
位点 , 在同源分析中与随机抽样的其他物种的
CHS基因的同源性高达 87%～ 97%,并且在系统
进化树中与花组织中特异表达的基因 CHS-A ,
CHS-J 聚为一类[ 11 , 12] .这些结果表明 AmCHS 为
查尔酮合成酶基因 ,并可能在花色形成中发挥作
用.
花色是决定花卉观赏价值的一个重要因素.花
色突变品种的获得 ,传统的方法是通过人工育种获
得 ,而现在则可用花卉基因工程研究方法:当 CHS
有多拷贝导入植物体内时 ,植株的内源 CHS 则局
部或全部不能表达 ,从而形成白色花或图案变化十
分丰富的彩瓣花.邵莉等[ 13]把 CHS 的植物正义表
达载体转化矮牵牛后 ,转基因植物的花色不但发生
了明显的变异 ,其育性也受到了影响 ,不能产生正
常花粉粒 ,成为雄性不育植株.利用正义 RNA 技
术 , Tanaka等[ 14]将 CHS 导入矮牵牛 、玫瑰和康乃
馨 ,得到了它们的花色变异株.Davis等[ 15]利用反
义 RNA技术将 CHS 转入白色和深紫色的矮牵牛 ,
得到花色为淡黄和淡紫的矮牵牛.1999 年 Mol
等[ 16]将 Hf1和 DFR基因导入康乃馨 ,成功地使其
白色花变异成紫色花.近年来 ,双链 RNA 干扰技
术的发展为基因功能研究提供了更为有效的手段 ,
RNAi效率高 、特异性强 ,可使 90%以上转化植株
的目的基因沉默[ 17] .因此 ,AmCHS 克隆为得到花
色改良的转基因黄蜀葵新品种奠定了坚实的基础.
查尔酮合酶是次生代谢的关键酶 ,编码该酶的
基因发生抑制后 ,既不会影响植物生长 ,又能引起
易于观察的表型 ,一直是研究共抑制机理的理想基
因.因此本研究获得的AmCHS 为我们深入开展共
抑制机理的研究奠定了一定的基础.
另一方面 ,黄蜀葵花的总黄酮提取物有诸多药
理作用:黄蜀葵花总黄酮对心肌损伤有一定的保护
作用[ 18] ;并能通过抗脑细胞凋亡发挥脑缺血损伤
保护作用[ 19] ;是治疗缺血性心脏病和缺血性脑血
管病等新型中药.除此之外黄蜀葵花醇提物有提高
红细胞免疫粘附功能 ,从而减轻 CIC 介导性肾损
伤的作用[ 20] ;对阿霉素肾病综合征模型大鼠的肾
小管间质损害也具有保护作用[ 21] .王先荣[ 22]等人
对黄蜀葵花总黄酮进行化学成分的研究 ,分离到 4
个黄酮醇单糖苷 ,分别鉴定为棉皮素-3′-O-β-葡萄
糖苷(Gossypetin-3′-O-β-glucoside , 1), 异槲皮苷
(Isoquercetin , 2),金丝桃苷(Hyperoside , 3)和槲皮
素-3′-葡萄糖苷(Quercet in-3′-g lucoside , 4).在这四
个黄酮醇单糖苷的合成过程中 ,查尔酮合成酶起着
至关重要的作用.黄蜀葵 CHS 基因的克隆为用基
因工程方法提高黄蜀葵黄酮类成分的含量奠定了
坚实的基础 ,对黄蜀葵产业发展具有重要意义.
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[责任编辑:白林含]
1532 四川大学学报(自然科学版) 第 45卷