全 文 ：安徽科技学院学报，2015，29(5) :24 ～ 31
Journal of Anhui Science and Technology University
收稿日期:2015 － 07 － 01
基金项目:2015 年大学生创新训练计划项目(108792015051)。
作者简介:王茜(1993 －) ，女，安徽省宿州市人，在读本科生，主要从事药物提取与制剂研究。* 通讯作者:时维静，教授，E － mail:shiwj
@ ahstu． edu． cn。
响应面法与正交设计法优化黄蜀葵总黄酮闪提工艺比较
王 茜，王啟之，时维静* ，陈云香，张 阳
(安徽科技学院 食品药品学院，安徽 凤阳 233100)
摘 要:用响应面法与正交法两种方法优化黄蜀葵闪式提取工艺。以总黄酮提取率为指标，根据单因素试验
的结果，通过响应面法与正交法分别得出最佳的闪式提取总黄酮的条件。结果表明，响应面法确定最佳工艺
为提取溶剂 53． 42倍量、乙醇浓度为 75． 01%、提取时间为 93． 56 s、提取 2 次;正交设计确定最佳方案为提取
时间为 100 s、提取溶剂 50倍量、乙醇浓度为 75%、提取 2次。响应面法精确度略优于正交试验设计法。
关键词:响应面法;正交试验;黄蜀葵;总黄酮;闪式提取
中图分类号:R917 文献标识码:A 文章编号:1673 － 8772(2015)05 － 0024 － 08
Comparison of the Optimal Homogenate Extraction for Total Flavonoids
from Abelmoschus Manihot by Response Surface and Orthogonal Design
WANG Qian，WANG Qi － zhi，SHI Wei － jing* ，CHEN Yun － xiang，ZHANG Yang
(School of Food and Drug，Anhui Science and Technology University，Fengyang 233100，China)
Abstract:To study the optimum homogenate extraction process of Abelmoschus manihot by response surface and
orthogonal design，the best conditions of extracting total flavonoids from Abelmoschus manihot by homogenate ex-
traction were screened by orthogonal and response surface method based on single factor experiments and selec-
ting the amount of total flavonoids as index． The results show that optimal process obtained by response surface
was that the ratio of solid to liquid was 53． 42 ∶ 1，ethanol concentration was 75． 01%，extraction time was 93．
56s and homogenate extraction was done 2 times;while that by orthogonal design method was:the ratio of solid
to liquid was 1 ∶ 50，ethanol concentration was 75%，extraction time was 90s and homogenate extraction was
done 2 times． The response surface method accuracy was slightly better than the orthogonal design method．
Key words:Response surface;Orthogonal test;Abelmoschus manihot;Total flavonoids;Homogenate extraction
黄蜀葵花为锦葵科秋葵属植物黄蜀葵 Abelmoschus manihot(L．)Medicus 的干燥花［1］。《本草纲目》记
载:其花味甘、无毒、主治小便淋与催生，治疮必需之药 ［2］。近年来研究表明黄蜀葵花的黄酮类成分有广
泛的药理活性，具有抗癌、抗肿瘤、抗氧化、防治心脑血管疾病等作用［3］。黄蜀葵花总黄酮的提取方法主
要有:溶剂法、超声波法、回流法、常温浸泡法［4］等，闪式提取法是一种较新的提取方法，具备方便快捷，提
取率较高，大大缩短提取时间，节约能源等优点，有着很好的应用前景［5］。
响应面法(response surface methodology，RSM)最早由数学家 Box 和 Wilson 于 1951 年提出，与传统的
正交试验相比具有更加直观、精确等优点［6］。目前，响应面法在提取工艺优化中应用越来越多，本试验根
据单因素试验的结果，分别使用响应面法与正交设计两种方法优化黄蜀葵花提取工艺，以总黄酮的提取率
为指标进行对比，比较两种试验方法的差异。
1 材料与方法
1． 1 仪器与试药
TU －1810 紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限公司) ;JHBE － 50S 型闪式提取器(北京金鼐
科技发展有限公司郑州公司) ;JV4001 电子天平(上海精密科学仪器有限公司) ;HH － 6 恒温数显水浴锅
(金坛杰瑞尔电器有限公司)。
芦丁对照品(100080 － 200905) ，购自中国药品生物制品鉴定所;硝酸铝、氢氧化钠、乙醇、亚硝酸钠等
试剂均为分析纯;黄蜀葵花样品采自安徽省黄山歙县桂林镇黄蜀葵生产基地，经安徽科技学院时维静教授
鉴定为锦葵科黄蜀葵干燥花。
1． 2 方法
1． 2． 1 对照品溶液制备 精密称取芦丁对照品 5mg 用体积分数 70%的乙醇溶液溶解，定容至 25mL，摇
匀静置，即得。
1． 2． 2 测定波长的选择 以 70%乙醇为空白溶液进行基线扫描，以芦丁对照品溶液，在 400nm ～ 600nm
波长内扫描。
1． 2． 3 标准曲线的绘制 准确吸取上述溶液 0mL、0． 5mL、1． 0mL、1． 5mL、2． 0mL、2． 5mL。分别置于
10mL量瓶，加 5%NaNO2 溶液 0． 3mL，摇匀放置 6min，再加入 10%Al(NO3)3 溶液 0． 3mL，摇匀放置 6min，
最后加入 4%NaOH溶液 4． 0mL，用 30%乙醇定容至刻度，摇匀静置 15min［7］。测吸光度，芦丁的浓度(C)
为横坐标，吸光度(A)为纵坐标绘制方程。
1． 2． 4 黄蜀葵花总黄酮待测液制备 将干燥的黄蜀葵花置于粉碎机内粉碎，制成黄蜀葵花粗粉，称取粉碎
后的粉末1． 0g若干份，在不同料液比、乙醇浓度、提取时间、电压等单因素下进行闪式提取试验，提取两次，过
滤、除渣、合并滤液，70℃水浴浓缩，用 70%乙醇定容至 100mL，摇匀，静置。为黄蜀葵花总黄酮提取液。
1． 2． 5 黄蜀葵花总黄酮含量的测定 用移液枪准确移取不同条件下制备的待测液 0． 1mL 于 10mL 容量
瓶中，参照“1． 2． 3”标准曲线绘制的显色方法，在 510nm波长测得吸光度与黄蜀葵总黄酮质量浓度。
1． 2． 6 闪式提取单因素试验 根据预试验和大量文献资料，确定闪提次数为 2 次效果最佳，选取液料比、
乙醇浓度、提取时间与电压 4 个因素，设置不同的水平，进行单因素试验，筛选影响因素。
1． 2． 7 正交试验设计 采用正交设计助手Ⅱv3． 1 软件处理数据，根据单因素试验结果，选取液料比(A)、
乙醇浓度(B)、提取时间(C)作为试验因素，采用 L9(3)
4 正交表，以黄蜀葵花总黄酮提取率为指标安排闪
式提取的正交优化，见表 1。
表 1 正交试验因素水平表
Table 1 Experimental factors and levels in orthogonal test
水平
因素
液料比(倍)A 乙醇浓度(%)B 提取时间(s)C
1 40 65 80
2 50 75 90
3 60 85 100
1． 2． 8 响应面法试验设计 采用 Design － Expert 8． 0． 5b 软件设计和处理数据，根据单因素试验结论，同
样选取液料比(A)、乙醇浓度(B)、提取时间(C)为因素，以提取率为响应值，设计试验，见表 2。
52第 29 卷第 5 期 王 茜，等 响应面法与正交设计法优化黄蜀葵总黄酮闪提工艺比较
表 2 响应面试验因素水平表
Table 2 Experimental factors and levels in response surface test
因素
水平
－ 1 0 + 1
料液比(倍) 40 50 60
乙醇浓度(%) 65 75 85
提取时间(S) 80 90 100
2 结果与分析
2． 1 黄蜀葵花总黄酮含量的测定
经光谱扫描确定最大的吸收波长为 510nm 。照“1． 2． 3”项方法，以芦丁的浓度(C)为横坐标，吸光度
(A)为纵坐标得方程 A = 0． 01334C － 0． 01299(r = 0． 9997)。芦丁浓度在 0． 0mg /L ～ 50． 0mg /L 范围内线
性关系良好。
2． 2 单因素试验结果与分析
单因素试验选择提取次数、闪提电压、乙醇浓度、料液比和提取时间进行试验。结果分析表明，提取次
数以 2 次最佳;闪提电压从 80 ～ 120V，对总黄酮提取率的影响不大，以 100V较好(图 1) ;试验过程中发现
当乙醇浓度过低时黄蜀葵花中的糖份与粘液质会大量浸出，严重影响滤过效率。提取浓度以 75%时提取
率最高(图 2) ;料液比对提取率有影响，随着溶剂量的增加，提取率明显的提升，50 倍量基本平稳(图 3) ;
提取时间的延长总黄酮提取率缓缓上升，以 90s时的提取率最高(图 4)。
图 1 提取电压对总黄酮提取率的影响
Fig． 1 Effects of voltage on extraction yield of flavonoids
图 2 乙醇浓度对提取率的影响
Fig． 2 Effects of ethanol concentration on extraction yield of flavonoids
62 安徽科技学院学报 2015 年
图 3 料液比对提取率的影响
Fig． 3 Effects of liquid － solid ratio on extraction yield of flavonoids
图 4 提取时间对提取率的影响
Fig． 4 Effects of extraction time on extraction yield of flavonoids
2． 3 黄蜀葵花总黄酮闪提正交优化结果与分析
根据单因素的结论，故选取液料比(A)、乙醇浓度(B)、提取时间(C)作为因素，采取 L9(3)
4 正交表，
结果见表 3。
表 3 正交设计试验表与结果
Table 3 Arrangement and experimental results of orthogonal test
试验数
因素
A B C 空白
提取率(%)
1 1 1 1 1 5． 443
2 1 2 2 2 6． 034
3 1 3 3 3 6． 011
4 2 1 2 3 5． 929
5 2 2 3 1 6． 682
6 2 3 1 2 6． 342
7 3 1 3 2 5． 932
8 3 2 1 3 6． 343
9 3 3 2 1 6． 024
K1 5． 839 5． 768 5． 976 6． 028
K2 6． 296 6． 275 6． 006 6． 113
K3 6． 033 6． 126 6． 187 6． 028
R 0． 457 0． 507 0． 211 0． 085
72第 29 卷第 5 期 王 茜，等 响应面法与正交设计法优化黄蜀葵总黄酮闪提工艺比较
结果分析:根据表 3 中极差 R的大小排序，可得各个因素对黄蜀葵花闪式提取总黄酮的影响大小为 B
＞ A ＞ C，即溶剂浓度为最主要的因素，其次分别为提取液料比与时间。直观分析得到的最佳提取工艺组
合为 A2B2C3。
方差分析:根据正交设计助手软件得到方差分析数据见表 4。由该表可见乙醇浓度与液料比对提取
率的影响显著，综合直观分析可以确定提取工艺为乙醇浓度 75%、液料比为 50 倍进行闪式提取，提取时
间为 90s，100V电压下提取 2 次。
表 4 正交试验方差分析
Table 4 Results of variance analysis
误差来源 偏差平方和 自由度 F值 F临界值 显著性
A 0． 316 2 22． 571 19． 000 *
B 0． 407 2 29． 071 19． 000 *
C 0． 078 2 5． 571 19． 000
误差 0． 01 2
注:“* ”统计意义显著(P ＜ 0． 05)
验证试验:确定正交优化法的最佳工艺后进行 3 次验证试验，计算结果平均提取率为 6． 59%，RSD =
1． 33%。证明该最佳提取条件稳定可行。
2． 4 黄蜀葵花总黄酮闪提响应面法优化结果与分析
根据单因素试验结论，选取液料比(A)、乙醇浓度(B)、提取时间(C)作为自变量，提取率作为目标值，
进行响应面分析，采用 Box － Behnken设计的结果见表 5。
表 5 Box － Behnken 试验结果
Table 5 Results of Box － Behnken
实验号
液料比
X1(倍)
乙醇浓度
X2(%)
提取时间
X3(s)
提取率
Y(%)
1 50 75 90 6． 774
2 50 65 100 6． 065
3 40 75 80 5． 917
4 50 75 90 6． 779
5 60 65 90 6． 008
6 40 75 100 6． 121
7 40 65 90 5． 308
8 50 85 80 5． 909
9 50 85 100 5． 987
10 50 65 80 5． 501
11 40 85 90 5． 898
12 50 75 90 6． 698
13 60 75 80 6． 296
14 50 75 90 6． 728
15 60 85 90 5． 908
16 60 75 100 6． 599
17 50 75 80 6． 751
82 安徽科技学院学报 2015 年
用 Design － Expert 8． 0． 5b 软件对上述数据进行分析，其回归方程的方差及显著性检验分析结果见表 6。
表 6 Box － Behnken试验方差分析
Table 6 Analysis of variance of the Box － Behnken
方差来源 平方和 自由度 均方 F
P值
(P ＞ F)
显著性
模型 3． 38 9 0． 38 207． 01 ＜ 0． 0001 ＊＊＊
X1 0． 31 1 0． 31 169． 11 ＜ 0． 0001 ＊＊＊
X2 0． 084 1 0． 084 46． 31 0． 0003 ＊＊＊
X3 0． 17 1 0． 17 90． 92 ＜ 0． 0001 ＊＊＊
X1* X2 0． 12 1 0． 12 65． 58 ＜ 0． 0001 ＊＊＊
X1* X3 2． 450E － 003 1 2． 450E － 003 1． 35 0． 2834
X2* X3 0． 059 1 0． 059 32． 53 0． 0007 ＊＊＊
X12 0． 38 1 0． 38 207． 22 ＜ 0． 0001 ＊＊＊
X22 1． 87 1 1． 87 1030． 89 ＜ 0． 0001 ＊＊＊
X32 0． 19 1 0． 19 106． 11 ＜ 0． 0001 ＊＊＊
残差 0． 013 7 1． 815E － 003
失拟项 8． 179E － 003 3 2． 762E － 003 2． 41 0． 2075
纯误差 4． 526E － 003 4 1． 131E － 003
总和 3． 39 16
注:“＊＊＊”统计意义极其显著(P ＜ 0． 001) ，R2 = 0． 9963，R2adj = 0． 9914
结果分析:采用响应面法分析结果，参照软件建立二次回归模型，闪式提取率为响应值的回归方程为:
提取率 = 6． 75 + 0． 20* A +0． 10* B + 0． 14* C － 0． 17* A* B + 0． 025* A* C － 0． 12* B* C － 0． 30
* A2 － 0． 67* B2 － 0． 21* C2
根据表 6 可知，该拟合模型显著性较高，且失拟项 P = 0． 2075 ＞ 0． 05，失拟项显著，表明符合统计要
求，可以用该模型对实验数据进行分析处理。且由表可见，料液比、乙醇浓度、提取时间这 3 个因素对提取
率影响较大和交互项 X1* X2、X3* X4 的 p 值均小于 0． 0001 统计学意义极其显著，同时证明了单因素结
果的合理性。模型的调整系数 R2adj = 0． 9914，进一步说明了该模型拟合度良好，可以用来确定黄蜀葵花闪
式提取的最佳提取工艺。3 个因素之间的交互作用见图 5 ～ 7。
图 5 液料比与乙醇浓度对总黄酮提取率的响应曲面和等高线
Fig． 5 Response surface and contour of liquid － solid ratio and ethanol concentration
92第 29 卷第 5 期 王 茜，等 响应面法与正交设计法优化黄蜀葵总黄酮闪提工艺比较
图 6 液料比与提取时间对总黄酮提取率的响应曲面和等高线
Fig． 6 Response surface and contour of liquid － solid ratio and extraction time
图 7 乙醇浓度与提取时间对总黄酮提取率的响应曲面和等高线
Fig． 7 Response surface and contour of ethanol concentration and extraction time
根据图 5 可知，黄蜀葵花总黄酮的提取率随乙醇浓度和液料比的增大逐渐上升，二者对提取率有着显
著的影响，液料比增大到一定程度时，提取率变化不大，增速趋缓。根据图 6 可知，液料比与提取时间的交
互对提取率未产生明显影响，其等高线圆心几乎成圆形，而一般情况下为椭圆形则代表其有显著的影
响［8］。随着二者的增大，提取率有比较小的提升，总体变化不是很大。根据图 7 可知，随着溶剂浓度的增
加提取率明显提升，乙醇浓度的增大到 75%左右时却开始呈现缓慢下降的趋势。根据相似相容的理论，
也许是因为提取溶剂的浓度过大，反而影响黄酮类成分活性，从而降低了提取率。
通过 Design － Expert 软件的数据处理优化得到最佳闪式提取条件为:液料比 53． 42 倍、乙醇浓度为
75． 01%、提取时间 93． 56s。软件预测最佳提取率为 6． 81%。为了方便地用于实际生产将最佳条件近似
修改为液料比为 53 倍、乙醇浓度 75%、100V电压下闪提 2 次每次 94s。
验证试验:根据上述实际控制条件最佳方法试验 3 次，测得吸光度并计算出提取率。经计算得到平均
提取率为 6． 76%，RSD =1． 56%。与预测提取率接近，证明该回归模型与实际情况拟合度较高。
3 结论与讨论
正交设计法可以综合考察多水平与多因素，方法简单易操作，试验次数也比较少，准确可信等优越性，
可以根据结果选出显著的影响因素，进而优化出最佳条件［9］。但是无法挑出整个区域中最佳组合和响应
值是其不足，并且模型是线性模型，只适合处理一系列未集中的水平值，会造成与实际情况的偏差［10］。如
本次试验中正交法优化得出的最佳条件液料比为 50 倍，提取时间为 90s，而通过响应面法优化得出为 53．
42 倍和 93． 56s，存在一定的差异。由此可见正交法的精确度比较低。
响应面法是集试验设计、统计、优化为一体的一种综合运用方法。它是以多元回归方法作为函数估算
数据统计的，用多项式近似表达。把因素与指标的关系函数化处理，可在整个大区域中找出影响因素与响
03 安徽科技学院学报 2015 年
应值之间的函数表达方程式，从而进一步得到最优值，具有良好的预测性［11］。
从两种方法对各因素的影响程度分析结果来看，二者基本一致，都显示出液料比与乙醇浓度影响显
著，其次是提取时间。从方差分析结果可以看出，响应面的分析较正交法详细。正交法只是简单的计算方
差与极差，响应面法考虑方面更多更广，对于试验结果分析的准确度更高，并且具有三维立体图展现试验
数据更加直观。但响应面法也存在缺点和局限，就是选择的试验点应包括最佳的条件，若选择不当也无法
得到很好的优化成果［12］。
目前关于黄蜀葵花总黄酮闪式提取的报道较少，闪式提取法作为一种较为新型的提取方法，具有方便
快捷、省时节能，提取率高的优点，同时在中药提取过程中可以使药物内的有效成分不会遭受热破坏，但其
消耗提取溶剂量较大，且实验过程中温度的影响无法准确精密控制等因素可能会造成试验结果不稳定和
引起误差。
本次试验通过单因素试验筛选影响因素，分别采用正交设计法与响应面法进行黄蜀葵总黄酮闪提工
艺的优化，以总黄酮提取率为评价指标进行比较，对二者的异同点、优缺点分析。正交试验最终优化计算
出的提取率为 6． 59%，响应面法优化得提取率为 6． 76%，在本次试验中可见二者优化结果相差不大，响应
面法则表现更为准确精确和直观，但是正交法试验简单快捷。故二者相比较各有优势，具体选择哪种方法
还应根据自身试验条件与试验目的。如果对于数据要求较高，则选用响应面法，一般情况下若无较高要
求，选用正交法优化即可。
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(责任编辑:马世堂)
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