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短序落葵薯根多糖提取工艺及其生物活性



全 文 :第41卷 第2期
2013年3月
河南师范大学学报(自然科学版)
Journal of Henan Normal University(Natural Science Edition)
  Vol.41 No.2
  Mar.2013
  文章编号:1000-2367(2013)02-0131-05
短序落葵薯根多糖提取工艺及其生物活性
赵金莉,张亚如,顾晓阳,刘 斌,金跃婷
(河北大学 生命科学学院,河北 保定071002)
摘 要:通过正交试验研究短序落葵薯根多糖水提过程中提取温度、提取时间和料液比对多糖得率的影响,采
用苯酚-硫酸法对多糖进行含量测定,选出较为理想的提取条件,即加20倍水,在100℃下浸提4h,得率15.72%.
短序落葵薯根多糖能有效清除活性氧,对·OH,O-2 ,DPPH·的半清除率IC50分别为2.89,1.99和1.89mg/mL;对
脂质过氧化的半抑制率为0.038mg/mL;在还原力的测定中,1mg/mL多糖在700nm下吸光值为0.696 7.
关键词:短序落葵薯;根多糖;提取;生物活性
中图分类号:Q946.3 文献标志码:A
短序落葵薯[Anredera scandens(L.)Moq.]是落葵科落葵属多年生蔓生肉质藤本植物[1].该属植物全
世界约有5~10种,我国栽培2种即落葵薯和短序落葵薯,其中落葵薯[Anredera cordifolia (Tenore)
Steenis]一直作为绿色蔬菜供观赏和食用,是一种药食兼用的新兴保健蔬菜[2-4].近年来,与之同属的短序落
葵薯在民间也有作为药食同源植物利用的,但是对其营养和药用价值的现代研究甚少.短序落葵薯块根多糖
含量较高[5],大量资料表明多糖具有较强的抗氧化、抗肿瘤、抗衰老、抗炎和抑菌活性等[6,7].目前关于短序落
葵薯根多糖的研究报道较少.因此本实验对短序落葵薯根多糖的提取工艺和体外抗氧化活性进行了较为系
统的研究,以期为短序落葵薯根多糖的进一步开发利用提供参考.
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 材料 短序落葵薯:采自河北顺平,10月底收获块根,烘干备用.
1.1.2 试剂 二苯基苦味酰基苯肼(1,1-dipheny,1-2-picrylhydrazyl,DPPH·)为Sigma产品;氯化硝基
四氮唑蓝(NBT),上海研域生物科技有限公司;维生素C,三羟甲基氨基甲烷(Tris),葡萄糖,浓硫酸,苯酚,
盐酸,氯仿,正丁醇,三氯乙酸,双氧水,硫酸亚铁,核黄素,邻菲罗啉,磷酸二氢钾,磷酸氢二钾,铁氰化钾,卵
磷脂均为分析纯试剂,购于保定华新试剂公司.
1.2 主要仪器与设备
三用电热恒温水箱(HW-W21),北京市场风仪器仪表;台式高速离心机(TGL-20B),上海安亭科学仪器
厂;循环水式真空泵(SHZ-Ⅲ),上海亚荣生化仪器;电热鼓风干燥箱(101-3AB),天津市泰斯特仪器有限公
司;型旋转蒸发器(RE-52A),上海亚荣生化仪器厂;酸度计(pHS-3CW),上海般特仪器制造有限公司;紫外
可见分光光度计(UV-2450),日本岛津;电子天平(FA1004),上海精密科学仪器公司.
1.3 方法
1.3.1 短序落葵薯根多糖提取工艺 短序落葵薯块根→粉碎,过筛→石油醚回流脱除脂类→干燥得脱脂样
品→加适量蒸馏水,100℃浸提4h→离心取上清液→沉淀加蒸馏水再提取一次(连续提取2次),合并2次
上清液 减压浓缩(55℃,80r/min)加入乙醇,使其体积分数为80%→冰箱中静置过夜→离心得粗多糖,加
适量蒸馏水溶解→Sevage法除蛋白质→离心,上清液进行醇沉 沉淀用丙酮洗涤3次,60℃烘干得短序落葵
收稿日期:2012-10-20
基金项目河北大学博士基金项目(2009-166)
作者简介:赵金莉(1973-),女,河北景县人,河北大学副教授,博士,主要从事土壤微生物与植物间相互作用研究.
DOI:10.16366/j.cnki.1000-2367.2013.02.027
薯根多糖→以葡萄糖为对照品,用苯酚-硫酸法测得提取物中多糖含量为96.82%.
1.3.2 短序落葵薯根多糖提取工艺的正交试验设计 影响短序落葵薯根多糖得率的主要因素有提取温度、
提取时间和料液比等.根据预试验结果,选择浸
提时间、浸提温度、料液比3个因素为考察因
素,每个因素各取3个较优水平,做三因素三
水平正交试验设计(见表1).
短序落葵薯多糖得率计算公式:短序落葵
薯多糖得率=多糖质量/短序落葵薯根粉质量
×100%
表1 短序落葵薯根多糖提取正交试验因素水平表
水平
因素
A(浸提温度/℃) B(料液比) C(浸提时间/h)
1  80  1∶20  3
2  90  1∶30  4
3  100  1∶40  5
1.3.3 多糖含量测定及提取率的计算方法 以葡萄糖为标准品,采用苯酚-硫酸法测定多糖含量[8].
1.3.4 短序落葵薯根多糖生物活性研究
1.3.4.1 清除羟自由基(OH)活性的测定 采用 Feton反应即邻菲罗啉-Fe2+-H2O2法测定[9].向1mL
质量浓度范围在0.1~5mg/mL短序落葵薯根多糖样品溶液中依次加入1mL PBS缓冲溶液(pH 值为
7.4,0.4mol/L),1mL 2.5mmol/L邻菲罗啉溶液,1mL 2.5mmol/L FeSO4,0.5mL 20mmol/L H2O2,混
匀后37℃水浴中准确反应1h,536nm处迅速测定吸光度,以VC为对照.空白组中用1mL去离子水代替样
品溶液;对照组中用1.5mL去离子水代替样品溶液和 H2O2 溶液.按下式计算·OH 清除率.
·OH清除率(%)=[(A2-A1)/(A0-A1)]×100,
式中:A1 为空白组吸光度值;A2 为样品组吸光度值;A0 为标准对照组吸光度值.
1.3.4.2 清除超氧阴离子自由基O2活性的测定 采用光照核黄素[10]的方法.向1mL质量浓度范围在0.1
~5mg/mL短序落葵薯根多糖样品中依次加入1.67×10-5 mol/L核黄素、0.01mol/L蛋氨酸、4.6×10-5
mol/L氯化硝基四氮唑(NBT)(均用pH=7.4,0.05mol/L的PBS缓冲液配制),2支空白管都以1.0mL
缓冲液代替样品溶液.1支空白管置于黑暗中处理,其它管都置于光照箱中光照30min,取出后以黑暗处理
的溶液调零,于560nm处测定各溶液的吸光度.清除率按下式计算:
O-2 ·清除率(%)=(A0-A1)/A0×100%,
A0 为光照处理的空白管的吸光度,A1 为样品管的吸光度.
1.3.4.3 对DPPH 的清除作用[11,12] 取2mL不同质量浓度的多糖样品溶液,加入2mL 0.1mmol/L
DPPH·有机溶液,立即混匀,静置30min后,在517nm处测定吸光度.以等体积乙醇代替 DPPH 溶液为空
白,以等体积无菌水代替多糖溶液为对照.多糖对DPPH·的清除率由下面计算式计算:
DPPH·清除率(%)=[1-(A2-A1)/A0]×100,
式中,A0 为对照吸光度值;A1 为空白吸光度值;A2 为 DPPH 与样品溶液反应后的吸光度值.
1.3.4.4 对脂质过氧化抑制活性的测定[13,14] 取0.5mL卵磷溶液(用200mg卵磷溶解于30mL10
mmol/L PH=7.4的PBS,冰浴震荡),加入pH=7.4PBS缓冲液1.0mL,不同浓度的样品溶液1mL,2.5
mmol/L的EDTA-Fe(Ⅱ)1.0mL,混匀后于37℃水浴中反应45min,再加入28%(W/V)的TCA 2.0mL,
1%(W/V)的TBA 1.0mL,混匀后置于100℃沸水浴中加热10min,冷却后在532nm处测定吸光度,用
PBS缓冲液调零,空白管用PBS缓冲液代替样品测吸光度,并按下式计算抑制率:
抑制率=(A0-A1)/A0×100,
A0 是空白管中溶液的吸光度,A1 是样品管中溶液的吸光度.
1.3.4.5 多糖还原力的测定 采用三氯乙酸法测定[15,16].分别取1mL多糖样品溶液,加2.5mL pH=6.6
PBS和2.5mL 1%铁氰化钾溶液,混合后,于50℃下放置20min,加入2.5mL质量分数为10%的三氯乙
酸溶液,4800r·min-1离心10min.取2.5mL上清液,加入2.5mL蒸馏水和2.5mL 0.1%三氯化铁溶液,
混匀,静置10min,在700nm测定吸光度.吸光度越高,抗氧化性越好,还原力越强.
2 结果与分析
2.1 提取短序落葵薯根多糖的正交试验结果
231 河南师范大学学报(自然科学版)                2013年
提取短序落葵薯根多糖的正交试验结果与分析见表2和表3.由直观分析结果(表2)可以看出,RA>
RC>RB,说明3中因素对多糖得率的影响大小为浸提温度>料液比>浸提时间.在试验设定的范围内,最
佳提取方案为A3B2C1,即加20倍水,100℃下提取4h.方差分析(表3)表明,因素A(浸提温度)和因素C
(料液比)对多糖的得率影响显著;因素B(浸提时间)影响不显著,说明了短序落葵薯根多糖提取过程中对多
糖得率影响较大的因素是浸提温度和加水倍数,而浸提时间的影响相对较小.
表2 短序落葵薯根多糖提取工艺优化的正交试验结果
编号 A(浸提温度/℃) B(浸提时间/h) C(料液比) 多糖得率/%
1  1(80) 1(3) 1(1:20) 10.96
2  1(80) 2(4) 2(1:30) 8.38
3  1(80) 3(5) 3(1:40) 7.62
4  2(90) 1(3) 2(1:30) 11.44
5  2(90) 2(4) 3(1:40) 12.78
6  2(90) 3(5) 1(1:20) 13.06
7  3(100) 1(3) 3(1:40) 13.98
8  3(100) 2(4) 1(1:20) 15.72
9  3(100) 3(5) 2(1:30) 14.47
T1 26.96  36.38  39.74 -
T2 37.28  36.88  34.29 -
T3 44.17  35.15  34.38 -
R  17.21  1.73  5.45 -
优水平 A3 B2 C1 -
主次顺序 A>C>B
表3 各因素方差分析表
变异来源 自由度 均方 F值 显著性
SSA  2  161.778  38.760  P<0.05
SS B  2  4.267  1.022  P>0.05
SS C  2  19.524  4.678  P<0.05
误差 2  4.174 - -
SST  8 - -
2.2 短序落葵薯根多糖的生物活性
2.2.1 短序落葵薯根多糖对·OH 的清除作用 由图1可看出,随着多糖浓度的增加,对·OH的清除率
逐渐增大.在多糖质量浓度0.1~5mg/mL范围呈良好的量效关系.使用 Microcal Origin软件对短序落葵
薯根多糖的曲线进行拟合,经计算短序落葵薯根多糖的IC50为2.89mg/mL.与维生素C对OH的清除能力
相比,短序落葵薯根多糖清除OH的能力略弱.
2.2.2 短序落葵薯根多糖对O-2 ·的清除作用 由图2可以看出,在多糖质量浓度0.1~5mg/mL范围,
O-2 ·的清除率与短序落葵薯根多糖的浓度呈量效关系,符合4次多项式.其拟合方程:E=11.263+
97.584C-74.716C2+22.382C3-2.178 2C4,R2=0.977 1,IC50=1.99mg/mL.与维生素C清除O2 的能力
相比,在0.1~2.8mg/mL范围内,短序落葵薯根多糖清除 O2 的能力强于维生素 C,但质量浓度超过
2.8mg/mL后,维生素C对O2 的清除能力迅速增强.
2.2.3 短序落葵薯根多糖对·的清除作用 如图3所示,短序落葵薯根多糖有显著的清除DPPH的能力,
且表现出良好的剂量依赖关系.在质量浓度为0.1mg/mL时,短序落葵薯根多糖对DPPH的清除能力虽然
低于VC,但随着质量浓度的升高其清除能力增强,IC50=1.89mg/mL.当质量浓度达到5mg/mL时,短序
落葵薯根多糖的清除率达到84.28%,接近于VC.
2.2.4 短序落葵薯根多糖对脂质过氧化的抑制活性 硫代巴比妥酸(TBA)可与丙二醛(MDA)反应生成粉
红色物质,该物质在532nm处有最大光吸收,利用TBA反应可定量检测卵磷脂被氧化时产生的 MDA量,
加入抗氧化物质可间接测出卵磷脂被氧化的抑制率.短序落葵薯根多糖对脂质过氧化的抑制作用见图4.利
331第2期             赵金莉等:短序落葵薯根多糖提取工艺及其生物活性
用 Microcal Origin软件对短序落葵薯根多糖的曲线进行拟合,经计算短序落葵薯根多糖对脂质过氧化的半
抑制率为IC50=0.038mg/mL,当短序落葵薯根多糖质量浓度为1mg/mL时,抑制率达到69.05%,随后,
抑制率趋于平稳.
2.2.5 短序落葵薯根多糖的还原力 物质的还原能力与其抗氧化活性之间有着明显的相关性,还原能力的
高低可以间接反映抗氧化能力的强弱,故一种物质的还原能力可以作为潜在的抗氧化活性的一个重要指标.
由表4可知,短序落葵薯根多糖具有较强的还原能力,且还原能力随多糖浓度(0.1~5.0mg/mL)的升高而
增强.相关分析表明,短序落葵薯根多糖的还原能力(E)与多糖浓度(C)呈极显著正相关(E=0.245 5C+
0.459 9,r=0.999 6).
3 结 论
(1)本实验采用正交试验法优选得出短序落葵薯根多糖的最佳提取工艺条件:料液比1∶20、提取温度
100℃,提取时间4h,多糖得率15.72%.
(2)短序落葵薯根多糖体外抗氧化活性在实验范围内有明显的量效关系,对 ·OH,·O2,·DPPH 的
半清除率IC50分别为2.89,1.99和1.89mg/mL;对脂质过氧化的半抑制率为0.038mg/mL;在还原力的
测定中,1mg/mL多糖在700nm下吸光值为0.696 7.
表4 短序落葵薯根多糖还原力的测定结果
多糖浓度/(mg·mL-1) 还原力(Abs700nm)
0.1  0.490 0±0.026
0.3  0.510 0±0.010
0.5  0.590 0±0.043
1  0.696 7±0.023 E=0.245 5C+0.459 9;r=0.999 6
2  0.950 0±0.087
3  1.183 3±0.073
5  1.696 7±0.072
431 河南师范大学学报(自然科学版)                2013年
参 考 文 献
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Extracting Technology Optimization of Polysaccharides from
Anredera Scandens and Its Biological Activity
ZHAO Jinli,ZHANG Yaru,GU Xiaoyang,LIU Bin,JIN Yueting
(Colege of Life Sciences,Hebei University,Baoding 071002,China)
Abstract:The paper investgates the effect of extracting temperature,extracting time,and material-medium-rade on ex-
traction of polysaccharides from stem of Anredera scandens with orthogonal design.The combination of adding 20times of wa-
ter,at the temperature of 100℃and with etracting time of 4his recommended.Total polysaccharides in Anredera scandens
was 15.72%.Root polysaccharides in Anredera scandens can effectively eliminate reactive oxygen species.The semi-clearance
rate of·OH-,O-2 ·and DPPH was 2.89mg/mL,1.99mg/mL and 1.89mg/mL.The semi-inhibition rate of Lecith in lipid
peroxidation was 0.038mg/mL.Absorbance at 700nm of reducing power was 0.6967when the concentration of polysaccha-
ride was 1mg/mL.
Key words:Anredera scandens;root polysaccharides;extraction;biological activity
531第2期             赵金莉等:短序落葵薯根多糖提取工艺及其生物活性