全 文 ：收稿日期:2007-01-04
基金项目:国家“ 863计划”资助项目(2002AA244031)
作者简介:石　磊(1973-　),男 ,博士研究生 ,主要研究方向:多糖生物化学.
＊通讯作者
　文章编号:1671-9352(2007)05-0074-05
柘树根多糖的分离纯化及组成初步研究
石　磊1, 2 , 傅佑丽3 , 陈靠山1＊
(1.山东大学　生命科学学院 , 山东　济南　250100;2.中国科学院　上海药物研究所 , 上海　201203;
3.曲阜师范大学学报编辑部 , 山东　曲阜　273165)
摘要:以柘树(Cudrania tricuspidata (Carr.)Bur.)的根为材料 ,经热水抽提 、木瓜蛋白酶-Sevag法除蛋白 、乙醇沉淀和
凝胶柱层析分离纯化 , 得到 1种水溶性的柘树根多糖(CTP)并研究了其单糖组成.采用紫外光谱和红外光谱法对
柘树根多糖进行了定性分析 , 结果表明 ,柘树根多糖具有多糖特征性的紫外和红外吸收峰 ,不含糖醛酸;高效凝胶
渗透色谱法测定结果表明 , 柘树根多糖的峰值分子量为 18 881;采用气相色谱法测定柘树根多糖中单糖的种类和
构成比例 , 结果表明 ,柘树根多糖主要由葡萄糖 、阿拉伯糖 、半乳糖 、木糖等 4 种单糖组成 , 并计算出 4种单糖的摩
尔组成比例.
关键词:柘树根多糖;分离纯化;紫外光谱;红外光谱;高效凝胶渗透色谱;气相色谱
中图分类号:Q533;Q935;Q949　　　文献标识码:A
Separation , purification and component research of a polysaccharide from
the roots of Cudrania tricuspidata (Carr.)Bur.
SHI Lei
1 ,2 , FU You-li3 , CHEN Kao-shan1＊
(1.School of Life Science , Shandong University , Jinan 250100 , Shandong , China;
2.Shanghai Institute of Materia Medica , Chinese Academy of Sciences , Shanghai 201203 , China;
3.Department of Journal of Qufu Normal University , Qufu 273165 , Shandong , China)
Abstract:A water-soluble polysaccharide(CTP)was obtained from the roots of Cudrania tricuspidata(Carr.)Bur., by water
extraction(70 ℃), deproteination using the enzymolysis-Sevag method , precipitation with ethanol , and fractionation through DE-
AE-Sephadex A-50 and Sephadex G-75 chromatography.Monosaccharide composition , preliminary structure , and molecular
weight of CTPwere studied by ultraviolet(UV), infrared(IR), gas chromatography(GC), and high performance liquid chroma-
tography(HPLC).CTP had characteristic UV absorption peaks , being identical with normal polysaccharides.High performance
gel permeation chromatography(HPGPC)was used to determine the molecular weight of CTP , and the result showed that the av-
erage peak molecular weight of CTP amounted to 18881.Four monosaccharides , i.e.arabinose , xylose , galactose , and glucose
were detected by gas chromatography from the CTP sample.The molar ratio of the four monosaccharides was measured.
Key words:Cudrania tricuspidata polysaccharide;isolation and purification;ultraviolet spectroscopy;infrared spectroscopy;
high performance gel permeation chromatography;gas chromatography
0　引言
柘树(Cudrania tricuspidata(Carr.)Bur.)为桑科
柘属植物 ,落叶灌木或小乔木 ,又名柘木 、刺桑 、柘
桑 、黄桑 、奴柘 、柞树等 ,分布在我国华东 、中南 、西南
至河北南部.柘树的根 、茎 、叶 、果实等均可入药[ 1] .
其中 ,柘树根性味淡凉微苦 ,具祛风利湿 、活血通经 、
　第 42 卷　第 5期
　Vol.42　 No.5 　 　 　 　 　
山　东　大　学　学　报　(理　学　版)
JOURNAL OF SHANDONG UNIVERSITY
　 　 　 　 　 2007年 5 月　
May 2007　
止咳化痰之功效.它可治疗风湿关节疼痛 、黄疸 、淋
浊 、闭经 、跌打损伤以及疔疮痈肿等症;近些年来又
用于食管癌 、胃癌等消化道癌症的治疗 ,并证明其疗
效显著[ 2] .国内一些制药公司将柘树根的水煎液浓
缩制成柘木糖浆 ,应用于临床取得了满意疗效[ 3] .
因此 ,从柘树根中开发抗肿瘤药物具有重要意义和
较好前景.综合国内外相关的文献报道 ,目前从柘
木中分离并鉴定的化合物主要为氧杂蒽酮(xantho-
ne)类和黄酮类成分.此外 ,还有生物碱 、木质素 、香
豆素等成分[ 4 ～ 10] .柘树根多糖(Cudrania tricuspidata
polysaccharide ,CTP)是从柘树根中提取的水溶性大
分子物质.研究发现 ,柘树根多糖具有显著的体外
免疫增强作用[ 11] .一般来说 ,多糖的功效作用与其
结构和组成有着密切的关系[ 12] ,而柘树根多糖结构
组成的研究 ,目前国内外尚未见报道.鉴于此 ,本文
将主要探讨柘树根多糖的分离纯化及单糖组成情
况 ,以期能够对柘树根多糖的研究和开发利用做一
些基础工作.
1　实验部分
1.1　仪器 、材料和试剂
柘树根购自安徽省亳州市中药大市场 ,经山东
大学生命科学学院徐誉泰教授鉴定为 Cudrania tri-
cuspidata(Carr.)Bur..将其自然晾干后 ,机械粉碎 ,
备用.
T 系列 Dextran 标准品 、DEAE-Sephadex A-50 、
Sephadex G-75(Pharmacia产品);D3520型树脂(南开
大学化工厂生产);高效硅胶 60GF254薄层板(青岛海
洋化工厂产品);标准单糖(Sigma 产品);DMSO(Flu-
ka产品);牛血清白蛋白(BSA)为中国医药集团上海
化学试剂公司进口分装;三氟乙酸 、甲醇 、硼氢化钠 、
乙酸 、乙酸酐 、甲苯 、氯仿 、无水硫酸钠等均为国产分
析纯.
Cintra 5紫外 -可见分光光度计(澳大利亚);
722S可见分光光度计(上海菁华科技仪器有限公
司);Waters 515 高效凝胶渗透色谱仪 , 配有Waters
2410示差折光检测器和Waters数据处理软件 Mil-
lennium
32(美国);NEXUS 470 FT-IR傅立叶变换红外
光谱仪(美国);岛津 GC-14B气相色谱仪(日本),配
备火焰离子化检测器;3 %OV-225 AW-DMCS-Chro-
mosorb(80-100 mesh)玻璃填充柱;Sartorius 电子分析
天平(德国);Bǜchi 461型旋转蒸发器(瑞士).
1.2　实验方法
1.2.1　柘树根多糖(CTP)的提取与分离纯化
取粉碎的柘树根 1.0 kg , 加 8 倍体积的水 ,于
70 ℃提取 3次 ,每次 2 h;合并提取液 ,离心 ,上清液
经 D3520型柱除去黄酮类等物质 ,通过柱的流出液
浓缩至原体积的 1 3;将浓缩液离心 ,收集上清液 ,用
4倍体积的 95%乙醇进行沉淀 ,静置过夜后离心 ,将
沉淀物依次用无水乙醇 、丙酮 、乙醚洗涤 ,红外干燥.
用水溶解沉淀 ,使之充分复溶 , 采用木瓜蛋白酶-
Sevag 法脱蛋白[ 13] ,重复5次直至液面交界处无胶状
物 ,除去残留有机溶剂 ,透析 ,冷冻干燥后得淡黄色
柘树根粗多糖.
取适量粗多糖溶于水 ,于室温进行 DEAE-Seph-
adex A-50凝胶柱层析 ,依次用水 , 0.1 mol L NaCl ,
0.2mol L NaCl和0.3mol L NaCl 溶液洗脱 ,分部收
集 ,苯酚-硫酸法跟踪检测.合并洗脱高峰部分 ,透
析后减压浓缩 、冷冻干燥 ,得各部分柘树根多糖.取
0.1mol L NaCl洗脱的部分适量溶于水 ,于室温进行
Sephadex G-75凝胶柱层析 ,用 0.1mol L NaCl溶液洗
脱 ,苯酚-硫酸法跟踪检测 ,合并单一高峰部分 ,透
析后减压浓缩 、冷冻干燥 ,得白色柘树根多糖纯品
(CTP).
1.2.2　纯度及分子量测定
采用 HPLC法测定多糖的纯度及分子量[ 14] .用
标准分子量的 Dextran T-2000 ,T-110 ,T-70 ,T-40 ,T-20
和葡萄糖做标准曲线 ,洗脱液为 2.5×10-3mol L ,pH
为 6.0的磷酸缓冲液 ,标准品及样品的进样浓度均
为 1%(w v),进样量20μL ,流速 0.7mL min.根据样
品的峰形判断其纯度 ,样品分子量由标准曲线求得.
1.2.3　标准单糖衍生物的制备
采用改进的 Blakeney法[ 15] .准确称取标准单糖
样品(阿拉伯糖 、木糖 、甘露糖 、半乳糖 、葡萄糖)各
4.0mg 于50mL鸡心瓶中 ,加入2.0mL 水 ,使单糖完
全溶解.加入28.0 mg 硼氢化钠 ,振荡溶解 ,于室温
反应 2.0 h ,间歇振荡.然后用乙酸中和过量的硼氢
化钠 ,至溶液不再产生气泡为止 ,此时溶液的 pH 值
应在 4.0 ～ 5.0之间.加甲醇 5次(每次 2.0 mL),减
压蒸干以除去硼酸根和水分.反应物在 100 ℃烘箱
中加热15min以充分除去水分 ,加入乙酸酐2.0mL ,
密塞 ,100 ℃反应 1.0 h.冷却 ,加甲苯5次(每次 3.0
mL),减压蒸发除去多余的乙酸酐 ,直至完全干燥.
将乙酰化产物用 10.0mL氯仿溶解 ,等体积水洗涤4
次 ,用无水硫酸钠干燥氯仿相 ,浓缩至约 0.1mL ,取
0.4μL进行GC分析.
1.2.4　多糖样品的水解和衍生化
(1)多糖的水解:准确称取柘树根多糖(CTP)
4.0mg ,溶解于 4.0mL 2.0mol L 三氟乙酸(TFA)溶
　第 5期 石　磊 , 等:柘树根多糖的分离纯化及组成初步研究 75　 　
液中 ,将溶液转移到安瓿中 ,充 N2 后封口 ,置于 110
℃烘箱中加热水解 2.0 h.取出 ,冷却.(2)多糖的衍
生化:将上述水解后的柘树根多糖 ,按照 1.2.3单糖
衍生化的方法 ,依次加入各种试剂进行衍生化反应 ,
取0.4μL 衍生化产物进行GC分析.
1.2.5　气相色谱条件
载气 N2 流 速 为 20 mL min;H2 流 速 为
30mL min;空气流速为200mL min;进样温度240 ℃;
柱温 210 ℃;检测器温度 250 ℃.
初始柱温 110 ℃(5 min)5 ℃ min 190 ℃(5 min)
3 ℃ min
210 ℃(20min)
2　实验结果
2.1　紫外光谱分析
取一定量的柘树根多糖(CTP),加水溶解 ,配制
成浓度为 2.0 g L的多糖水溶液 ,采用紫外可见分光
光度法190 ～ 400 nm 范围内扫描.光谱显示 ,CTS仅
在190 nm 处有一吸收峰(见图 1),这是多糖特征性
的紫外吸收峰 ,在 260 nm 和 280 nm 处无明显吸收.
结果表明 ,纯化的柘树根多糖不含有核酸 、蛋白质 、
多肽及其他杂质成分.另外 ,柘树根多糖溶液的碘
-碘化钾反应呈阴性 ,表明不含淀粉;双缩脲反应呈
阴性 ,表明不含蛋白质 ,与紫外扫描结果一致.
图 1　柘树根多糖的紫外-可见光谱
Fig.1　UV-visible spectrum of CTP
2.2　红外光谱分析
称取经过干燥的柘树根多糖(CTP)2.0 mg ,与
150 ～ 200 mg经干燥的 KBr粉末在红外灯下研磨均
匀 ,压成薄片 ,进行红外光谱扫描(见图 2).如图所
示 ,柘树根多糖具有一般多糖在红外光谱图中的特征
性结构 ,有以下几组特征峰:3 405.7 cm-1处的强吸收
峰是糖分子中O—H键的伸缩振动吸收 ,2 929.4 cm-1
处的峰是 C—H键的伸缩振动吸收 ,1 612.2 cm-1处的
峰是糖分子中结合水的吸收 ,1 419.4、1 195.7 cm-1的
峰是糖分子中 C—H 键的变角振动吸收 , 1 143.6、
1 093.5 、1 024.0 cm-1的峰是 C—O 键的变角振动吸
收.另外 ,红外光谱在 1 730 cm-1附近无糖醛酸对应
的吸收峰 ,表明该多糖不含有糖醛酸.
图 2　柘树根多糖的红外光谱
Fig.2　IR spectrum of Cudrania tricuspidata polysaccharide(CTP)
2.3　柘树根多糖纯度和分子量的测定
多糖样品的纯度和分子量用高效凝胶渗透色谱
法(HPGPC)测定[ 16] .根据在凝胶柱上多糖的分子量
与洗脱体积的关系 ,先用不同分子量的 T 系列标准
葡聚糖(Dextran)制作标准曲线 ,然后将样品的洗脱
体积(由于流速一定 ,所以实际上用的是保留时间)
与标准曲线进行对照 ,即可计算出多糖的分子量.
取已知分子量的 Dextran T 系列标准品(T-2000 ,
T-500 ,T-110 ,T-70 , T-40 ,T-20),分别用流动相溶解 ,
配成一系列标准溶液 ,以标准品分子量的对数值和
　76　 山　东　大　学　学　报　(理　学　版) 第 42卷　
保留时间进行线性回归计算.将样品用流动相溶
解 ,配成 1%的溶液进行HPGPC色谱分析(图3).柘
树根多糖(CTP)在 HPGPC中为单一对称峰 ,表明其
为均一组分.根据洗脱时间 ,从标准曲线上求得该
多糖峰值分子量为 18 881 u.说明柘树根多糖经提取
纯化后 ,分子量分布比较窄 ,不含有小分子量的单糖
和寡糖.
图 3　柘树根多糖的 HPGPC图
Fig.3　HPGPC of CTP
2.4　气相色谱分析结果
图 4为混合标准单糖糖醇乙酸酯衍生化后的气
相色谱分析结果 ,图 5为柘树根多糖水解后各种单
糖糖醇乙酸酯衍生化后的气相色谱分析结果.根据
柘树根多糖样品的 GC 图谱和各种单糖标准品的
GC图谱比较 ,可以确定在柘树根多糖(CTP)中含有
4种单糖组分:阿拉伯糖 、木糖 、半乳糖和葡萄糖.
根据气相色谱所得的各单糖衍生物的峰面积值 ,各
峰面积的比值即为各单糖的摩尔比 ,计算得出各种
单糖组成的摩尔比例为:葡萄糖∶阿拉伯糖∶半乳糖∶
木糖 =11.7∶3.4∶3.0∶1.0.另外 , 保留时间为
3.18min和 1.79min的两个峰疑是在柘树根多糖水
解和衍生化过程中产生的杂质峰.因为在气相色谱
分析上 ,不论是五碳糖还是六碳糖 ,通常出峰的保留
时间都要大于 4.0min[ 17] .
本工作为柘树根多糖的研究和开发利用提供了
参考依据.
图 4　混合标准单糖气相色谱图谱
Fig.4　Gas chromatogram of mixed standard Monosaccharides
阿拉伯糖(Ara , 7.26 min);木糖(Xyl , 8.90 min);
甘露糖(Man , 17.20 min);半乳糖(Gal , 18.83 min);
葡萄糖(Glc, 20.51 min).
图 5　柘树根多糖水解产物气相色谱图谱
Fig.5　Gas chromatogram of the hydrolyzed CTP
阿拉伯糖(Ara , 7.37 min);木糖(Xyl , 8.99 min);
半乳糖(Gal , 19.10 min);
葡萄糖(Glc , 20.99 min).
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(编辑:于善清)
　　(上接第 68页)
　　致谢:感谢山东大学生命科学院张怀强教授 ,杨炜华博士对本
工作的无私帮助和给予本人的悉心指导 ,感谢山大威海国际生物技
术研发中心的梁浩 、宋淑亮 、王伟莉老师 ,宋迪等同学在工作和学习
中给予我的支持和鼓励.
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