全 文 ：第 、 23卷
19 8 1年
第 4期
月
植 物 学 报
A C TA B OTA NIC A SI NC IA
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1 9 8 1
满江红 [A z o la im石r i e a at ( R o xb ) N a k a i ]
和藏状满江红 LA z o la if il cu lo ide , L a m . ]
固氮作用和光合作用的研究*
施定基 李佳格 钟泽璞 王发珠 朱丽萍
(中国科学院植物研究所 )
G
.
A
.
P d e r s
(美国凯特林研究所 )
摘 要
用满江红 [A z o l l a io b厅 c a t a ( R o x b ) N a k a i ] 和藤状满江红 [A z o l l o ifl i c 二 l` d o L a m . ] 研
究了固氮酶催化的 C Z H : 还原和放 H Z , 光合吸收 C o : 以及在封闭系统中同时侧定了 ct H : 还
原 、光合作用和呼吸作用。 结果如下 :
1
. 固氮酶催化的 C Z H : 还原基本需光。 满江红的光饱和点大约在 I D , 。0 勒克司 。 气相中
C尹 : 分压为 10 % 时 , C : H : 还原已达饱和 。 1% C O 已抑制 C Z H : 还原 , 同时有 H : 的释放。
2
. 测定了 水 ” 厉 , ca at 和 法 jil cu ilo d “ 的 C : H : 还原活性随叶片年龄的变化 。 这两种满江
红的顶端活性是极微的 , 随着叶片年龄的增长 , 活性明显提高 , 接着出现一个活性高峰的 “ 平
台” ,然后随叶片衰老而活性下降 。 这种活性梯度由于形态上的差异 , 乙 流 b icr at a 比 击 ilj i -
踢ilo d。 的更陡。 3 . 汉 . 瀚 .bl i ca 匆 固氮酶催化的放 H Z , 在氢气中未能检出 , 但在氢中含 巧%
C : H
, 和 2% C O 时可以测到 。 在后一种气相中还测定了放 H : 随叶片年龄的变化。 这些结果
说明存在着一种吸氢酶。 4 . 水 撒厉 I ca ” 和 .A jlt i`耐 口心。 在空气中的光合 C o Z 补偿点在 30
P m 左右 。 5 . 用 乙 浏br t ca at 同时侧定光合作用 、 呼吸作用和 C , H : 还原 , 证明固氮酶活性
直接依赖于光合作用捕获的光能 ,而不是直接依赖于 C O : 固定 。
满江红 ( A oz la ) 是一类水生旅类植物 , 在中国用作稻田绿肥和饲料已 有 悠久的 历
史山 。 它的绿色背裂片中有一个特化的共生腔 , 内含一种具异形胞的蓝藻 (蓝细菌 ) (城“ -
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。
) 作共生者 。 这些共生体能进行光合作用 , 共生藻的固氮作用可为共生体提
供氮源 。 光合作用摄取的光能为固氮酶提供了 A T P 和还原剂 ,而固氮酶还能催化质子还
原成 H Z , 把非生理底物 q H Z 还原成 C Z玉I飞。 因此这类共生体对于阐明光合作用同化的能
量在各种代谢过程中的利用效率 、 调节和控制是很有意义的 〔, ,s] 。
eP et sr 等用卡州满江红 ( A oz al ca or il瓜邵 ; w il d ) 研究了这种共生体的固氮 、 放氢和
光合作用 〔14, 16] 。 H il 关于藤状满江红中满江红鱼腥藻 ( A洲 b a o a 二 ol ae ) 发育的研究曾
经指出即洲 ,藻体分化的发育模式是与旅体相平行的 。 这说明在共生过程中有一种与发育
相关的调节。
本文于 19 80 年 , 月收到 。
. 本研究得到汤佩松教授和阎龙飞教授的指导 ,特致衷心的感谢 。
弓期 施定基等 :满江红和旅状满江红固氮作用和光合作用的研究 37 0
中国自然分布的满江红只有 Az ol l a汤 r i bo a t( Rx o b. ) Nk ai a。 一个种闭它是九膘满江
红亚属 ( R厉z Ds声 r m习 中的一员 , 而卡州满江红和旅状满江红属于三膘满江红亚属 (瓜。 -
BD la )
。 它们在形态上有差异 。 用乙炔 ( C ZH Z) 还原法来研究 A . 俪 b icr at 。 的固氮作用还
刚开始 味` , , 对于它的固氮酶催化放氢和光合作用特性尚无定论。
本文报道关于满江红的固氮作用 ( C尹 2 还原和固氮酶催化的放 H Z ) 和光合作用特性
的初步研究 , 并与威状满江红作比较 。
材 料 和 方 法
培养条件
实验用的满江红和旅状满江红从田间收集 , 用自来水冲洗后培养在 20 一25 ℃ 下的无
氮 xR班 培养液中 〔` , , , 液层 2一 3 厘米 ,每天照光 1斗小时 ,光强 1斗, 0 0 0一 2 0 , 0 0 0 勒克司 。 培
养一周 。
内共生满江红鱼腥藻的分离
用温和的滚压法得到单株的蓝藻丝状体叫 , 用酶解法得到完整的藻团 (在一层外套膜
中含有整个叶腔中的共生蓝藻丝状体 )川 , 。
满江红单叶的分离
将侧枝从主轴上切下 , 把主轴的顶端切下作为零点 ,将紧挨着顶端又未展开的叶片作
为第一片 , 以下顺次为第二 、三 、 四片等 。 威状满江红每 2 片或 斗片单叶成一组连续分离 。
测定乙炔还原或放 践 时 , 把同年龄的单叶或叶片组放在同一个测量瓶中。
乙炔 ( C ZH Z ) 还原的测定
在体积为 6 . 6 毫升的测量瓶中 , 加人 2 毫升无氮 I R IR 培养液 , 放人 2一 3株完整的满
江红或适量的单叶 (或叶片组 ) 。 注人 q H Z 前 ,将测量瓶抽真空和充氨 5 次 , 气相中 q H :
的最终浓度如图注中所示 。 在 巧 , 0 0 勒克司 、 30 ℃ 下保温 30 分钟 , 不振荡。 保温后用
连接氢火焰检测器的 1 02 G 气相色谱仪测定乙烯的产生。
放 H : 的测定
在上述测量瓶中加 3 毫升无氮 IR RI 液 , 气相如图注中所示 。 在测 C ZH Z 还原同样条
件下保温 3一 4 小时 。 用连接热导池检测器的 rF ac t vo aP 2 4 0 0 T 气相色谱仪 , 以 rA 为载
体基本按文献 [ 1 3] 的条件测定 H : 的释放。
C O
, 交换的测定
在封闭系统中满江红植株的光合速率和呼吸速率以及 C q 补偿点 , 都用 QG D一盯 型
红外线 c o Z 分析器 (北京分析仪器厂 出品 )检测。 植株放在有机玻璃的同化室 内 , 内盛适
量无氮的 IR uI 培养液 , 气相在一个封闭系统中循环 。 为了减少水汽对仪器的干扰 , 同化
室连接一个冷凝装置 。
叶绿素的分析 按 rA on n 法 `7 J进行。
1) 有人认为它与羽叶满江红 ( A . 对。 。盯 a .R Br ) 是同一个种 ,但也有不同的看法 。
8 3 0植 物 学 报 3 2卷
结 果
( 一 )满江红完整植株的固氮特性
1
.如图 1所示 ,在所测范围内 , 植株量和乙炔还原量之间是线性关系 , 这说明在这个
植株量范围内乙炔还原速率是恒定的 。 因此以后的测定中植株鲜重都在这范围内。
2
.
C ZH
: 还原的时间曲线 如图 2 所示 , 在我们的实验条件下 , 最初 1 . 5 小时内乙快
还原呈线性增加 , 以后稍有下降 。 下降的原因尚不清楚 , 其中在 1 . 5 到 3 小时内可能与从
侧定瓶中取 出样品影响压力有关 。
3
. 光强对 C ZH : 还原的影响 如图 3 所示 , 满江红的厌氧 C ZH , 还原是需光的 。 才 -
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图 1 满江红在测量瓶中的不同植株量 (鲜重 )对乙炔还原的影响。 光强 15 , 0 0
勒克司 ;温度 30 ℃ ;气相氖气中含 10 % C : H :
图 2 满江红 C : H : 还原的时间进程 (累加测定法 ) 。 光强 20 , 0 0 勒克司 ;温度
31 ℃ ;气相氢气中含 10 % C : H :
F 19
.
1 A e e t y l e n
o r 二l u e t i o n a s a t u n e t i o n o f t h e a m o u n t ( f r e s h w e ig h t )
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峪 期 施定基等 :满江红和旅状满江红固氮作用和光合作用的研究 3 09
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2 3
光强又1口勒克司 ) L i` h , i n t e n o i钾 ( L u x l o 4)
图 3
图 3 满江红 C Z H : 还原的 光强曲线 。 温度 30 ℃ ,
图 , 在满江红中 , p C , H : 对 C : H : 还原的影响 (
c( 担 , 为 15 % )的影响 ( 0 ) 保 温条件同图 3
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.
3 A e e t y l e n e r e d u e t i o n b y 汉 . 1功 b r i c a t a a s a
图 4
气相氢气中含 10 % zC H :
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, 和 p C O 对 C : H : 还原
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3
图 5
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图 5 用酶解法从满江红 ( a) 和旅类满江红 ( b ) 得到的满江红鱼腥藻藻团
F 19
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萝。 br t’c at a 的光饱和点大约在 10 , 0 0 勒克司。
4
.
C尹 2 还原随 pq H Z 的变化和 p C O 对乙炔还原的影响 A . 俪 br ic at a 的固氮酶活
性在气相中 pC ZH : 为 10 多 时已达饱和 。 如图 4 所示 , c o 能抑制固氮酶催化 zC玩 还原 ,
但不抑制质子还原成 zH 。 cP o 为 1务 时已抑制 95 多 的 q H : 还原 。
(二 ) 内共生满江红鱼腥藻的固氮酶活性和形态
用酶解法从 A . i m br ic at 。 和 A . ilj io l of 面 的叶片中得到满江红鱼腥藻的藻团 , 它们
的大小略有差别 , 都呈长卵形 , 都包有一层外套膜 , 其内含有高频率的异形胞 (图 5 ) 。用温
和的滚压法从两种满江红的叶腔 中分离出的蓝藻是断裂的丝状体 。 表 1 比较了这些制备
物与完整共生体的乙炔还原活性 。 内共生满江红鱼腥藻分离后活性降低的原因尚不清楚 。
植 物 学 报 3 2卷
表 1满江红和旅状淆江红共生休及从其分离的内共生满江红鱼腥旅乙块还原活性的比较
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C Z H
: 还原活性
材 料 M a t e r i a l (毫克分子 C
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共 生 体
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满江红 (刁 . 1二 b r i c a 才a )
内共生藻
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9士 8 . 0
共 生 体
A s s o e i a t i o n
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.
6土 13 . 8
威状满江红 ( A . f i l i c o l o id 。 ` )
内共生藻
E n d o P h y t e
57
.
8士 8 . 4
(三 ) 单叶的满江红乙炔还原活性
1
. 满江红乙炔还原活性随叶片年龄的变化 由图 6 可见 , 顶端的蓝藻未能被检测到
活性 ,第 3 片叶的活性迅速上升 , 第 5 片叶活性最大 , 以后随叶片衰老而下降 八
2
.藤状满江红的分枝方式与茎轴长度与满江红不同 , 因此 , 它随叶片年龄而变化的乙
炔还原活性梯度比 A . im 扮i ca at 平缓。 用叶片组测定 ,其乙炔还原活性在第 5一 8片叶中
有明显的增长 ,一直到第 2 4 片叶呈一个高峰平台 , 随后下降 (图 7 ) 。
比较满江红和旅状满江红不同年龄叶片乙炔还原活性 (图 8 )表明 , 这两种植株的总
趋势相同 ,但 A . ifl i哪ilo de , 的活性较高 , 可能的一个原因是 A . 加 b八 c a t a 用单叶测定 ,而
A
.
ft’l ic ul io * , 用叶片组侧定 。
(四 ) 固氮酶催化的放 H Z
1
. 完整植株的放 zH 在不同气相中检测了固氮酶催化的放 H , (图 9 ) 。 在氢 士 2多
c o 或空气中含 2多 c o 时 , 未能检测到放 践 。 而在氢或空气中含有 巧 多 q 玩 + 2多 c o
条件下 , 有较高的放 H Z 速率 。 S m iht l8[] 和 OBt he 等 a[] 曾报道 C O 和 q H Z 存在时 , 对吸氢
酶活性有抑制 。 eP et sr 等 L13) 也发现 , 生长在无结合态氮培养液中的卡州满江红在这种气相
条件下能放 H Z , 但仅为乙炔还原速率的 50 外 左右 。 我们观察到 , 在氢 + 巧务q H Z + 2务
c o 条件下 , A . :’m br i~ 的平均放 玩 速率为无 C O 乙炔还原速率的 60 多 。 因此 , 在氢士 c o 或空气中含 c o 条件下尚未检测到放 H Z , 这可能与共生体中存在吸氢酶有关 。 至于
在空气 十 巧 多 q 氏 + 2务 c o 气相中的平均放 从 速率比在氢 + 巧 务 q H : 十 2 务 c o 气
相中的高 , 尚待进一步验证和分析 。
2
. 放 残 随叶片年龄的变化 根据上述结果 , 选择在氢 + 巧多 q 玫 + 2务 c o 气相
中 ,测定 A . im ;.b icat a 随叶片年龄而变化的放 H Z , 所用的 q 氏 中含有少量的 H ; 。 当校正
了这个含 玩 量以后 , 从顶端区和第 1 片叶得到了负值 。 这个结果是初步的 , 但是这些结
果暗示 , 在顶端区存在的吸氢酶比固氮酶活性先 出现 (图 10 ) , 并且不为 c o + q H Z 所
抑制 。 而在较老的叶片中这种吸氢酶的活性逐渐降低 , 也可能 q H : 十 c o 逐渐增加对
它的抑制 。
1 1 3
月 施定基等 :满江红和旅状满江红固氮作用和光合作用的研究期
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随满江红叶片年龄而变的 C : H , 还原 。 保温条件同图 3
随脓状满江红叶片年淤而变的 C : H : 还原 。 保温条件同图 3
满江红和蔽状满江红的不同叶位叶片乙炔还原的比较
满江红在不同气相中的固氮酶催化放 H : 和 C ZH Z 还原 。 光照 20 , 00 勒
,温度 30 ℃ , 保温 4 小时 。 1 , 显 , 2 . 氖中含 15 % C : H Z , 3 . 氢中含 15 呱
和 2% C o , 4 . 显中含 2肠 C o , 5。 空气中含 15肠 C ZH ; 和 2% C o ,
了O勺矛n乃Q,图
6
. 空气中含 2帕 C o
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3
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(五 ) 光合作用
图 n 和 12 分别表明了 A ` 枷 brt’ ca ta 和 A . ifl i哪oI id “ 在封闭系统中的光合吸收 C q 。
两者吸收 c q 的速率都随 c q 浓度亏缺而下降 , 当其达到补偿点时 , 光合吸收 C q 速率
为零 。 这就是说 ,在这种 c q 浓度下 ,光合作用与呼吸作用处于动态平衡 。 在封闭系统中
没有 C q 的净变化。 A . im b ir c` 4 和 A . if ilc “ IO id e , 的补偿点实际上相似 , 分别为 ”
p pm 和 2 8 p p m o
31 2植 物 学 报3 2卷
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满江红中随叶片年龄而变的固氮酶催化放 H : 。气相氢气中含 巧% c: H .
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时间 (分 )
7 9
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图 U 封闭系统中满江红植株的光合作用 。 加 , 0 0 勒克司 , 27 ℃ 气相为空气
图 12 封闭系统中旅状满江红的光合作用 。 反应条件同图 1 1 , 气相为空气
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呼 期 施定基等 :满江红和簇状满江红固氮作用和光合作用的研究
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图 13 封闭系统中满江红植株的光合 ( C O : 吸收 ) 、固氮 ( C妇 , 还原 )和呼吸 c( 。 :
释放 ) 。 1 5 、 。 0 勒克司 , 2 7℃ , 10 肠 C : H , (占气相体积) , 气相总体积为 35 。 毫升
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(六 ) 光合作 用 、呼吸作用和 q 践 还原的关系
在一个封闭系统中同时用红外线 c q 分析器和气相色谱仪取样测定 A . 枷 b厅。 t : 的
乙炔还原活性 、光合速率和暗呼吸速率 , 有可能对它们之间的关系作一些分析 (图 1 3 ) 。 光
合作用的数据与图 1 一致 , 但是 , 当 c q 下降到补偿点以后 , 用直接外加 c q 或暗呼吸增
加 C q 浓度 , 都能使光合速率随 c q 浓度增加而增高 , 重新被检出 。 图 13 还表明 , 乙炔
还原活性并不立即随 c q 浓度的变化而变化 ,但如果植株从光下转到暗中 , 其活性立即明
显下降 。
讨 论
A
. 俪 b icr at 。 乙炔还原的饱和光强大约为 10 , 0 0 勒克司 , 培养条件和叶绿素含量都
会影响它 。 例如 , 用 左 . ca or il in an 。 曾发现其光饱和点在 5 , 0 0 勒克司左右 L14) 。 但最 近
p e t e r s 等 Ll , ,指出 , 生长在适宜条件下的 汪 . c a r o zi , i a 。 ` 、 才 . f i zi c u zo i J 。 , 、 才 . m e x i ca , 。 和 月 .
户 。 。 at “ , 其乙炔还原活性大约在 10 ,。 0 到 巧 , 0 0 勒克司达到饱和 。
本研究指 出 ,气相中含 10 外 乙炔对满江红的固氮活性已达饱和 ,而 1% c o 几乎完全
抑制 q H Z 还原 。 因此 , 在氨 士 c o 条件下 , 从水中来的质子是固氮酶仅有的底物 , 而在空
气十 C O 中 , 放 H Z也是可能的 (因为 c o 可抑制固氮酶的 N Z 还原和 C Z从 还原 , 但不抑制
质子还原 ) 。 但在我们实验中都未测到放 H Z。 而放 H Z 仅在有 C ZH Z + c o 存在的条件下
检侧到 , 这与用卡州满江红在这种气相下能增加放 H , 是一致的 `13 .15] 。 这些说明 , 可能存
植 物 学 报 23 卷
在着一种单方向的吸氢酶 a I .la o j
固氮酶催化的放H: 随叶片年龄而变化 , 这在过去尚未有报道 。 我们的测定结果 指
出 , 在 A . 俪扮 i ca at 的顶端区吸氢酶的活性可能先于固氮酶 , 并且这种酶的活性不为 C : H 刁
所抑制 。 这需要进一步验证和探索 , 如果确实如此 , 这说明 A . 俪厉 i ca at 这种旅 一藻共生
体在氢代谢上有其特点 。
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i m加 ic al “ 和 A . 川ic 以。沁 , 在空气中的光合 C 0 2 补偿点在 30 P m 左右 。 这与 aR y
等用 A . ca or il 爪 a1z 召 的观测是一致的叫 , 说明这类蔗类植物是 c 3 植物 。
光合与固氮的关系曾经用蓝藻和光合细菌研究过 L , .0zJ 。 本研究中同时测定这些过程
的结果是与用同样技术对 月 . 。 ar iol 厉 a 。 口 测得的结果是一致的 t 16] 。 根据这些结果可以证
明 : ( 1 ) 如果光合产生的碳架有足够的贮存可作还原剂的来源 , 则固氮活性不立即取决
于 c 0 2 固定 ; ( 2 )固氮酶活性直接依赖于光合产生的 A T P , 它们大部分可能来 自环式光
合磷酸化 ; ( 3 ) 暗呼吸推动的固氮酶活性可能受 A T P 的限制 。 这种技术将为继续研究
光合 、呼吸和固氮酶催化的反应之间的生物力能学关系 , 提供线索 。
参 考 文 献
[ 1 5 ]
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[ 1 7 1
浙江省农业科学院土肥研究所 , 1 9 7 5: 绿萍的养殖和利用。 农业出版社 。
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A 九 a b a e 件 a e o m p l e x a s a 位 tr o g e n f e r t U让 e r f o r ir e e 还 : I R丑1 r e s e a r比 P即 e r s e r i e s . N O . 1 1 .
Y o比 , D . C . , 1 9 7 8 : N i t r o g en f返a t io n an d h y d r o g e n 几 e t a b o il s m b y p h o t o s” l ht e州e b a e te r i a i n :
T h e P b o t o盯 n t l l e t i e B a 。 士e r i a . E 氏 场 凡 K 口盯ot n & W . R . , is s t r o m , lP e n u m P r e s s N e w Y o r k
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o n f o r e n e r g y
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