全 文 ：植 物 学 报
A C T A B O T A I CNA S I NI C A
2 0 ( 3 )
1 9 7 8 , 9
用 乙 炔 还 原 法 测 定 满 江 红 的 固 氮 活 性
温 永 煌 汤 健 民
( 江西省农业科学研究院作物研究所土肥系 )
A M E A S U R E O F N I T R O G E N F IX A T I O N A C T IV I T Y O F
A Z O L L A l 讨B R I C A T A B Y A C E T Y L EN E R ED U C T IO N
Wen Y o n g
一
h u a n g a n d T a n g Ji a n
一
m i n
(D 。 户a r t , n e , 一 o f s o t l a o d F o r之 t l : z e , . , , : t i t t`纪 o f C r o P, J * a o g x , A c a d e 二夕 o t 才 g r , c u l t u r e )
满江红 〔左二 o l l a , 。 b , i ca z a ( R o x b · ) N a k a i ]属
水生藤类植物 。 满江红叶背的空腔和叶芽中 ,共生
着大量的固氮蓝藻— 满江红鱼腥藻 (才“ b“ “a z o l l a s t r a s b · ) , 因而它具有固氮能力。
对于满江红固氮量 , 以往采用无氮培养 , 用凯
氏定氮法进行分析测定 。 此法操作烦琐 , 需用时
间较长 。 自 1 9 6 6 年发现乙炔能代替分子氮 作为
生物固氮的底物 , 并证明这种还原能力与分子氮
的还原有平行关系以来 ,快速 、 灵敏的气相层析法
在国内外生物固氮的研究中得到广泛运用 。 本研
究的 目的在于测定满江红能否将 乙炔 还原 成 乙
烯 , 并进而确定其较适宜的反应条件 , 以求在实际
工作中运用 。
3 2
、
4 2秒左右 , 峰形尖锐 ,对称 ,分离良好 (图 1 ) 。
也可用氢气作载气 。 在载气 2H 32 毫升 /分 , 空气
65 0毫升 /分 , 柱温 75 ℃ ,气化 1 0 ℃ 、 氢焰 80 ℃的工
作条件下 , 乙烯 、 乙炔的出峰时间分别为 2 0 、 2 7 秒
左右 , 也能得到较高的灵敏度和良好的分离效果 。
乙炔 、 乙烯标准气的实验室制法
乙炔 : 乙炔气体从工业用电石置气体发生器
中加水产生 ,然后通过 20 % H a 溶液 , 20 % N a 0 H
溶液 , AJ , o : 和固体 Na 0 H 的干燥瓶后 , 便收集
e Z H Z ( 42
, ,
)
C Z H ; ( 32
` ,
)
材 料 和 方 法
仪器和工作条件
采用上海分析仪器厂生产的 1 02 G 型气相层
析仪 ,5 毫伏电子电位差计记录讯号 。 氮气为载气 ,
氢焰检测 。 空气由压缩机供给 。 上述气体均经过
按 l :2 混装的硅胶和 4 入分子筛的过滤管后进入
层析仪 , 层析柱为 必5 又 1长 l 米的盘形不锈钢柱 。
柱内装人 6 。一 80 目的 G D x 一50 1作为固定相 (天
津化学试剂二厂生产的一种有机高 分子 多孔微
球 ) 。 将充填均匀的层析柱装人层析 室 , 在柱 温
1 0 ℃ , 载气流速为 50 毫升 /分的条件下老化 1 0小
时 , 点燃氢焰进行检测 。 如记录器基线波动大 ,继
续通载气老化 , 直至基线走稳为止 。
在 N 2 5 0 毫升 /分 , H : 3 3 毫升 /分 ,柱温 8 0℃ 、
气化 80 ℃ , 氢焰 70 ℃ , 记录器走纸速度 20 毫米 /
分的工作条件下 , 乙烯 、 乙炔出峰的时间分别在 图 1 实验室内制备的乙烯 、 乙炔标准混合气体色谱留
2 7 4 植 物 学 报 2 0 卷
到球胆中备用 (将初发生的气体排空 1一 2 分钟 ) 。
乙烯 将优级纯 CZH, o H 和 优级纯 的浓
H声。 ; , 按 1 :2 的体积装入气体发生烧瓶 ,置电炉
上加热至 1 70 ℃ (混合液产生沸腾 ) , 将初发生的
乙烯气体排空 l一 2 分钟 ,再将产生的气体通过装
有蒸馏水的气体洗瓶收集到球胆 , 或用排水取气
法收集到带有皮塞的瓶中备用 。
用上法制备的气体 , 注入气相层析仪中测定 ,
除出现乙炔 、 乙烯峰外 ,无杂峰出现 。 由此可证明
气体纯度达到使用要求 (图 1 ) 。
层析仪刻度校正和相关系数测定
参照上海植生所方法进行川 。 在本试验条件
下 , 满江红还原乙炔产生乙烯的信号检测范围均
在 1 0 一 1 0 。。之内 (衰减为 l 夕。 因此 , 氢焰放大器
的灵敏度转换开关的实际转换 倍数 , 只需校 正
] 0一 ,一 l犷 , 之间 ,不必对仪器的刻度逐一校正 。 经
侧试 ,在我们使用的仪器上 , 1 0一 1 0 0 , 1 0 0一 1 0 0 0
(衰减为 l) 的实际转换倍数分别为 1 1 . 5 和 9 . 1 ,
在前述工作条件下 , 1丁 i一 1 0一 , 之间的相关系数
为 0 . 5 2。
样品处理和称重装瓶
将满江红 ( 田间或盆养 )清水洗净 , 沥水 , 用滤
速上升 , 以后逐步减慢 , 六小时后基本不再增加
(图 2 ) ; 满江红的还原产物 ,在色谱图中除出现乙
烯 、 乙炔峰外 , 无未知峰 , 对照无乙烯峰出现 。 由
此可以看出 , 自注入乙炔后 7一 8 小时 , 取样测定
较为适宜 。
为摸索满江红固氮与光照的关系 , 我们将满
江红遮光处理后置于暗处 , 三小时后注人乙炔 , 定
时取样测定 ,发现其还原能力极其微弱 ,几乎处于
完全丧失的状态 。 这和浙江省农科院土肥所得出
的 “绿萍不仅在光合作用 中要光照 ,在固氮作用中
也要光 ,[ ” 的结论是一致的 ;与国外有关文献报道
的“ 蓝藻在暗处几乎不能固氮 , 已知固氮过程中必
须有光 ,t 3 1也是吻合的 。
(二夕水份和根系对乙炔还原的影响
试验发现 , 水份对满江红固氮活性的测定结
果影响较大 , 根系则无还原能力 (表 l , 图 3 ) 。 因
此我们认为 , 在有水的状态下测定满江红的固氮
活性 , 更加接近自然生态下的固氮状况 。
(三 ) 乙炔对萍体生长的影响
我们曾将在反应瓶中密闭了 30 个小 时的 满
江红取出 , 置培养皿中用自来水培养 ,不论是剪根
或不剪根的萍体 , 都仍然保持着较旺盛的活力 , 剪
l|l|卜厂|
.
|广|ól纸吸去表面的水份后
, 作剪根和不剪根两
种处理备用。 用 l八 。克感量天平 , 分别称
取 。 . 5 、 1 . 。克装入洗净烘干的 叨毫升血
清瓶中 , 旋即塞上橡皮塞 。 对照瓶注人 20
毫升蒸馏水 , 沸水煮 巧 分钟。
注人乙炔
用 5 毫升注射器准确抽取乙炔气体 3
或 月毫升 ,注人装有满江红样的瓶中 , 稍加
摇动后置于普通光照下 。
取样测定
用 l 毫升注射器从待测瓶中抽出 。 . 2
毫升气体 , 注人已走稳基线的气相层析仪
中进行测定 (进样气体体积不一定要求很
准确 ) 。 也可抽取一定量的气体 , 注入另一
洁净的备有橡皮塞的空瓶中 , 以供随时测
定 。
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
反应 (小时 )
图 2 不同反应时间对满江红固氮活性的影响
剪根 , 未加水 。 半小时后注人乙炔 , 置光照下 。
以功辉润兹帜\瑕冷闷众积担
l 2
9
6
不剪根加水
徽坦辉侧巷祝、眼闷斗众权握
结 果 和 讨 论
(一 )不同反应时间和光照对乙炔还原
的影响
多次测定的结果表明 , 满江红能将乙
炔还原成乙烯 。 其反应速率在三小时内迅
不剪根不加水
~ _ ~
_一 _ ~ _ 、 创闷白呻一 下一卞 ` 一十. 了 ` 叫犷 ’ 叮3 4 , 6 7 8 30
反应 (小时 )
水份对满江红固氮活性的影响
ō二,`.卜é一`,j
期 温永煌等 : 用乙炔还原法测定满江红的固氮活性 2 7 5
表 l 水份 、根系对满江红还原能力的影晌
(余江地方种 ) *
表 2 乙 炔对满江红 的影响 *
反应扣 小时
实验处理 剪根 剪 根不剪根 不剪根 萍根 水加水 不加水 加 水不加水 加水
产乙烯量 4. 582 2 . 08 0 4. 13 7 1. 7 1 0未检 出 未检出
( 微克分子 )
0
.
8 0
…一 -竺塑竺l….一兰l 一
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一江建
理一余新处一…验一重,匆一肛勘..一江6一满
* 各组萍重及萍根均为 。 , 5 克 , 水为 20 毫升蒸馏
水 , 均立即注入乙炔 , 8 小时后测定。
* 4。 毫升血清瓶中注入 3 毫升乙炔 ,未加水 , 剪根 ,
置普通光照下 , 30 ℃ 培养。
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J
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`卫一,`r. LL根的萍体也在 2 天之后长出新根 (表 2 ) 。
由于乙炔还原法可测定满江红的固氮 能力 ,
同时乙炔对满江红萍体生长的影响又较小 , 这就
为从活体中选育固氮能力强的满江红品种 , 提供
了有利的条件 。
[ 3 〕
参 考 文 献
上海植物生理研究所固氮研究 室 , 1 9 7:4 固 氮
研究中乙块还原定量 测定方法的简易化 。 植物学
报 , 16 ( 4 ) : 2 8 2一 2 8斗。
浙江省农业科学院土壤肥料研究所 , 19 7:5 绿萍
的养殖与利用 。 农业出版社 , 3 2 页。
渡道 笃 , 1 9 7:5 藻类的固氮 。 生物固氮译文集
(第二集 )科学出版社 , l 页。
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