全 文 ：Research Paper 研究报告
微生物学报 Acta Microbiologica Sinica
50(10):1320 － 1326;4 October 2010
ISSN 0001 － 6209;CN 11 － 1995 /Q
http:/ / journals. im. ac. cn / actamicrocn
基金项目:国家重点基础研究发展计划(973 计划)———生物固氮作用的分子机理研究(2010CB126500)
* 通信作者。Tel: + 86-27-87281685;Fax: + 86-27-87280670;E-mail:youguoli@ mail. hzau. edu. cn
作者简介:朱庆燕(1985 －)，女，山东省泰安市，硕士生，研究方向为固氮分子生物学。E-mail:qingyan0812@ 163. com
收稿日期:2010-04-27;修回日期:2010-06-19
与紫云英转脂蛋白 AsE246 相互作用靶蛋白的筛选及其基因
表达特征
朱庆燕，李一星，王宁，陈大松，李友国 *
(华中农业大学，农业微生物学国家重点实验室，武汉 430070)
摘要:【目的】AsE246 是我们首次报道的紫云英根瘤特异表达的非特异性转脂蛋白(nsLTP1:non specific
lipid transfer protein 1)编码基因。本实验旨在筛选和鉴定与 AsE246 相互作用的宿主植物靶蛋白，并分析靶
基因在共生和胁迫条件下的表达特征。【方法】利用酵母双杂交技术、小范围杂交技术及实时荧光定量
PCR，筛选与 AsE246 的相互作用蛋白，并定量分析靶基因在结瘤与固氮过程中的时空表达特性。【结果】获
取一个阳性克隆，其 cDNA 序列经 Blast 分析表明:候选靶蛋白是一个 DnaJ-like 蛋白，该蛋白相应基因命名
为 AsDJL1。AsE246 与 AsDJL1 在酵母体内确实相互作用。AsDJL1 在固氮根瘤中特异性增强表达，在 NaCl
胁迫下表达水平显著提高，在(NH4)2 SO4 胁迫下表达水平显著下降。【结论】本实验是筛选与 LTP 相互作用
蛋白的首次报道。获得了直接的实验证据表明互作基因 AsDJL1 与 AsE246 具有高度相似的表达特征和功
能，为深入研究二者的相互作用及其在共生固氮和应答环境胁迫中的调控机制，提供了一定的工作基础和理
论依据。
关键词:紫云英;DnaJ-like 蛋白;表达特性;nsLTP1;酵母双杂交
中图分类号:Q933 文献标识码:A 文章编号:0001-6209 (2010)10-1320-07
根瘤菌和豆科植物的共生固氮作用涉及到双方
基因的相互协调表达，基因信号的传递，营养物质的
交流和能量的供应。在结瘤过程中被诱导表达或表
达增强的植物基因命名为结瘤素基因，其编码产物
称为结瘤素(nodulin)。本室前期工作中，通过抑制
差减杂交技术，分离获得了紫云英根瘤特异或增强
表达的 13 个新结瘤素基因及其全长 cDNA。序列
分析表明，其中一个基因 AsE246 编码非特异性脂质
转运蛋白 nsLTP1［1］，与多种植物的 LTP1 氨基酸序
列具有较高同源性，含有 nsLTP1 蛋白特有的 AAI
(Alpha Amylase Inhibitor subgroup)和 AAI_LTSS 结
构域 (Alpha Amylase Inhibitor，Lipid Transfer and
Seed Storage proteins)，具有信号肽结构，N 端存在跨
膜结构域。AsE246 编码的蛋白分子量 12. 1 kDa、等
电点 pH 8. 66、氨基端带有疏水性的信号肽，这些特
点也都与已报道的 nsLTP1 类似［2］。采用 Real-time
RT-PCR 对该基因的器官组织和时空表达特征进行
检测。结果表明:AsE246 仅在紫云英根瘤中特异表
达，在感染植株的根茎叶等器官中、不接种对照根中
及与菌根真菌互作形成的菌根共生体中不表达。在
NaCl 及(NH4)2 SO4 胁迫下的表达检测表明:在
10 mmol /L(NH4)2 SO4 处理后，AsE246 基因转录量
显著降低;NaCl 处理后，AsE246 基因转录量显著提
高，表明 AsE246 可能参与植物对盐胁迫的反应［3］。
总之，AsE246 是我们首次报道的根瘤特异表达
nsLTP1 基因，明显区别于其它多数植物中存在的
LTP，分析表明 AsE246 与紫云英根瘤固氮和应答环
境胁迫具有密切关系。
DOI:10.13343/j.cnki.wsxb.2010.10.004
朱庆燕等:与紫云英转脂蛋白 AsE246-相互作用靶蛋白的筛选及其基因表达特征 . /微生物学报(2010)50(10)
目前国内外关于 LTP 与根瘤共生固氮的关系
报道极少，特别是对于 LTP 调节和作用机制的认识
还远远不够，尤其是在共生固氮过程中，是否还有其
它因子与其相互作用，它是如何调控固氮过程等问
题目前仍没有明确解释。为查明 AsE246 在共生固
氮过程中的调控和作用机制，本研究通过酵母双杂
交技术首次筛选与 AsE246 相互作用的宿主靶蛋
白，并研究靶基因的组织和时空表达特征，及其胁迫
环境条件下的表达变化。结合前期发表的有关研究
结果，预测靶蛋白和 AsE246 的相互作用机理，及其
在共生固氮和胁迫应答中的功能，为后续深入研究
AsE246 的功能调控机制提供一定的实验依据。
1 材料和方法
1. 1 材料
1. 1. 1 菌株和质粒:酵母 (Saccharomyces cerevisiae)
AH109 和 Y187 菌株，pGBKT7 和 pGADT7-Rec 质粒
均购自 Clontech 公司(美国，加利福尼亚)，华癸中
慢生根瘤菌(Mesorhizobium huakuii)7653R、大肠杆
菌(Escherichia coli)DH5α 和 DH10B 由农业微生物
学国家重点实验室(华中农业大学)保存。
1. 1. 2 主要试剂和仪器:Dnase I(Rnase-free)，
Reverse Transcriptase M-MLV，Ribonucleasa Inhibitor
(TaKaRa)，Taq DNA 聚合酶、ExTaq 酶、T4 连接酶
(TaKaRa);SYBR?Green Realtime PCR Master Mix
(Appllied Biosisterm);各种限制性内切酶、DNA 及
蛋白质分子量标准为 Fementas 公司产品。Step One
Real-time PCR Systerm(美国，ABI);微量核酸蛋白
测定仪 GeneQuant 100(美国通用公司);PCR 仪
(Bio-Rad)。
1. 2 紫云英组织材料采集
将饱满的紫云英种子进行消毒处理:先用 95%
无水乙醇处理 5 min，再用 3%次氯酸钠浸泡 5 min，
然后用无菌水漂洗 7 － 8 次，最后把种子平摊于 2%
的素琼脂培养基表面，22℃避光培养，待芽长出后移
栽至装有灭菌细沙的钵体中培养，待第一片真叶长
出后接华癸中慢生根瘤菌 7653R。培养期间，及时
补充无氮营养液。在不同时期按照计划采集根瘤等
器官组织材料，－ 80℃保存。
紫云英根瘤总 RNA 抽提:按照 Trizol 法提取接
种华癸中慢生根瘤菌及胁迫条件下，紫云英根瘤组
织总 RNA，经 DNase I 处理后，测定 RNA 纯度和浓
度。经 1. 2%甲醛变性凝胶电泳检测 RNA 完整性。
以纯化 RNA 为模板进行 RT-PCR，用紫云英组成型
表达的 Ubiquitin 基因做内参基因，检测分析目标基
因的表达特性和变化。
1. 3 诱饵基因扩增和诱饵质粒构建
根据本室在 NCBI 登记的 AsE246 基因序列
(DQ199648 ) 设 计 引 物， 上 游 引 物: 5′-
CGGAATTCATGAAATTTGCATATGTGGTT-3′ (含
EcoR I 克 隆 位 点 )，下 游 引 物: 5′-
CGGGATCCCTAGACCAACAAAGTTTGAAGTAT-3′
(含 BamH I 克隆位点)。提取紫云英固氮正常根瘤
的总 RNA，根据 RT 试剂盒说明书合成 cDNA 第一
链，以单链 cDNA 为模板扩增目的片段 AsE246。
PCR 扩增程序:95℃预变性 3 min;95℃变性 30 s，
50℃复性 30 s，72℃延伸 30 s，32 个循环;72℃最后
延伸 10 min。PCR 产物 AsE246 及 pGBKT7 质粒，以
EcoR I 及 BamH I 进行双酶切。利用 T4 连接酶构
建重组质粒 pGBKT7-AsE246，双酶切及测序分析鉴
定重组质粒的正确性。
1. 4 诱饵质粒筛选紫云英文库
将测序正确的 pGBKT7-AsE246 转化 Y187 酵母
感受态细胞，涂布于 SD /-Trp 平板上，28℃培养。通
过菌落 PCR 检测诱饵质粒是否转化成功，然后将转
化成功的菌株分别划线于 SD /-Trp + X-gal 和 SD /-
Trp /-Leu 的平板上，观察 SD /-Trp + X-gal 平板上
96 h内菌落是否变成蓝色以检查其自激活性。挑取
SD /-Trp 平板上的单菌落(直径大于 2 mm)接种于
SD /-Trp 的液体培养基中摇床培养(200 r /min)，观
察 24 h 内 OD600能否超过 0. 8，以检测诱饵蛋白的毒
性。将无自激活、无毒性的 pGBKT7-AsE246 /Y187
菌株与已构建的含有紫云英 cDNA 文库 pGADT7-
cDNA /AH109 菌 株 进 行 杂 交，28℃ 摇 床 (30 －
50 r /min)培养 20 － 24 h 后，在 SD /-Trp /-Leu /-His /-
Ade 的平板上筛选阳性克隆子，同时在 SD /-Trp、SD /-
Leu 和 SD /-Trp /-Leu 平板上涂布计算杂交效率。
1. 5 阳性克隆子鉴定
将初筛获得的阳性克隆接种于 SD /-Trp /-Leu /-
His /-Ade + x-gal 平板，观察克隆子是否显蓝以复筛
确证。将复筛获得的阳性克隆进行菌落 PCR，检查
插入片段大小。抽提酵母菌株阳性克隆质粒并转化
大肠杆菌，利用载体抗性不同分离出克隆有文库插
入片段的阳性文库克隆，将含文库质粒的阳性克隆
进行 PCR，再次检测扩增的插入片段大小。最后，
抽提大肠杆菌阳性克隆质粒进行酵母回转、小范围
杂交等再次验证阳性克隆。将最终确定的阳性克隆
进行测序，结果与 NCBI 数据库比对，用 DNAMAN
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Qingyan Zhu et al. / Acta Microbiologica Sinica(2010)50(10)
等软件进行生物信息分析。
1. 6 目标基因的表达检测分析
采用 Real-time RT-PCR 检测目的基因在根瘤等
组织器官中、以及胁迫条件下根瘤中的表达水平。
有关引物序列见表 1。
表 1 目标基因 RT-PCR 和 Real-time PCR 引物
Table 1 The primers used for RT-PCR and Real-time RT-PCR of target genes
Target genes and use of primers Sequences of primers (5′→3′) Sizes / bp
DnaJ domain of AsDJL1 PCR
left:ATGATTCAACAAATGCAGCATCC
right:TCAGTGAGGGACAATGTGTGCTC
300
AsDJL1 Real-time PCR
left:TGACTCACTTGGATGGCAGAC
right:GGCCTTGGTGGCAGAATAG
214
18S rRNA gene Real-time PCR
left:GTATGGTCGCAAGGCTGAAAC
right:TTAGCAGGCTGAGGTCTCGT
232
2 结果和分析
2. 1 诱饵质粒 pGBKT7-AsE246 构建
用高保真性 ExTaq 酶扩增出 AsE246 的整个编
码区 (399 bp)。用 EcoR I 及 BamH I 双酶切
pGBKT7 质粒及 PCR 扩增出的 AsE246，利用 T4 连
接酶构建重组质粒 pGBKT7-AsE246，双酶切鉴定重
组质粒正确，测序结果与已知序列一致，诱饵质粒构
建成功。将诱饵质粒 pGBKT7-AsE246 转化酵母菌
株 Y187，在 SD /-Trp + X-gal 平板上显白色，在 SD /-
Trp /-Leu 上不生长，鉴定其无自激活性，并且在培养
过程中发现其能正常生长，确定诱饵质粒对于宿主
酵母菌株没有毒性，可用于酵母双杂交进行互作靶
蛋白的初步筛选。
2. 2 紫云英 AD-cDNA 文库质量检测
按照有关操作标准和计算方法，我们检测了所构
建文库的质量。结果显示转化效率为:每 3 μg
pGADT7 有 1. 02 × 106 转化子。从紫云英 AD-cDNA
文库中随机挑取部分文库酵母克隆，抽取其质粒进行
PCR 检测插入片段大小(图 1)，电泳结果可见:插入
片段集中在 500 bp － 1. 5 kb 范围内，表明构建文库覆
盖较好，空载率为 7. 8%，所构建的文库达到了预期的
质量要求，可以作为酵母双杂交的靶基因文库。
图 1 AD-cDNA 文库克隆随机 PCR 检测插入片段
Fig. 1 Insert size detection by PCR for random clones chosen from AD-
cDNA library. M. Marker V;1 －12:Inserts of random cDNA clones.
2. 3 阳性克隆筛选和验证
利用诱饵菌株从 AD-cDNA 文库中初筛获得 3
个阳性克隆，并在 SD /-Trp /-Leu /-His /-Ade / X-α-
Gal 平板上进行(设置正负对照)复筛，阳性克隆在
筛选平板显蓝色。最后仅获得一个阳性克隆(图 2-
A 箭头所指克隆)。抽提阳性克隆质粒，利用 AD 质
粒上 的 同 源 引 物 (5′-CTATTCGATGATGAAGATA
CCCCACCAAACC-3′ 和 5′-AGTGAACTTGCGGGG
TTTTTCAGTATCTACGA-3′)进行 PCR，电泳结果显
示目标插入片段，即编码靶蛋白基因片段约为
1. 1 kb。将该目标质粒转化大肠杆菌，利用质粒上
的抗性分离纯化目标质粒。并采用双酶切验证(图
2-B)目标质粒后进行酵母回转，与诱饵菌株进行小
范围杂交，结果显示所有酵母克隆全部显蓝。最后
将通过验证的阳性 cDNA 克隆片段提交公司测序。
图 2 阳性克隆复筛结果及质粒双酶切验证
Fig. 2 Results of re-screening for positive clones and confirmation of
positive clone plasmid digested by EcoR I and Xho I. A:1. positive
AD cDNA clone; + . positive control，BD-53 /Y187 strain mated
with AD-SV40 /AH109;-. negative control. B:MV. Marker V;
M1. λDNA /Hind Ⅲ;3. plasmid of positive clone digested by EcoR
I and Xho I.
2. 4 阳性克隆 cDNA 序列分析和功能域验证
将阳 性 文 库 质 粒 的 cDNA 测 序 结 果 通 过
DNAMAN 整理，输入 NCBI 中进行 Blast 分析。发现
该 cDNA 片段编码一个含有 DnaJ-C super-family 结
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朱庆燕等:与紫云英转脂蛋白 AsE246-相互作用靶蛋白的筛选及其基因表达特征 . /微生物学报(2010)50(10)
构域的蛋白。为了更加有依据地推测靶蛋白功能及
与诱饵蛋白的互作关系，我们将靶蛋白与其同源蛋
白的相同长度同源区域进行了比对分析(表 2)。结
果显示:阳性克隆编码蛋白特别是其 DnaJ 结构域与
大豆 PM37 (AAD51625. 1)、拟 南 芥 ATJ2 (NP _
568412. 1)等 DnaJ-like 蛋白具有很高的同源性，因
而我们将从文库中钓取的该互作蛋白相应编码基因
命名为 AsDJL1(HM064455)。同源分析结果表明:
AsDJL1 的氨基酸比同源蛋白少，但是与包含相同结
构域、同等大小的同源蛋白比对，同源性很高。由此
推测:AsDJL1 可能是完整蛋白中一部分包含了 J 结
构域的蛋白片段，也有可能属于 DnaJⅠ蛋白，而
DnaJⅠ型蛋白所具有的 Zn 指模型有可能像拟南芥
中的 Zn 指模型一样，调节与多种细胞活动有关的
蛋白和蛋白的相互作用并且作为 ABA 信号传导的
重要调节子［4 － 6］，与 LTP 的参与信号传递的功能相
似［7］。DnaJ-like 蛋白除了能转运折叠蛋白外，也能
和 LTP 一样参与植物对生物或非生物因素的抗性
反应［8 － 9］。AsDJL1 与 AsE246 的功能相似性，使我
们的继续研究有了一定的理论依据。
实验证明:AsDJL1 没有自激活性，自身间也不
发生相互作用，也不能与空 AD、BD 载体发生作用。
为研究 DnaJ-C 结构域是否与 LTP 相互作用以再次
证实 AsDJL1 与 AsE246 的相互作用关系，我们以紫
云英 cDNA 为模板，扩增出整个 DnaJ-C 结构域的编
码框序列。将单独构建的 AD-DnaJ 质粒转 入
AH109 酵母菌株，再次与诱饵菌株 BD-AsE246 /
Y187 小范围杂交，发现阳性融合子显示的蓝色更
深，因而确证了 AsDJL1 中所含有的 DnaJ-C 结构域
与诱饵蛋白 AsE246 存在的体内相互作用。
表 2 AsDJL1 编码蛋白的同源比对结果
Table 2 Comparison of protein encoded by AsDJL1 and homologous proteins
GenBank No. Homologous protein Homology /%
AAD51625. 1 seed maturation protein pm37［glycine max］ 89. 83
XP_002316479. 1 predicted protein［populus trichocarpa］ 88. 14
NP_001149958. 1 DnaJ protein［Zea mays］ 86. 02
ABB16989. 1 DnaJ-like protein［solanum tuberosum］ 85. 17
NP_568412. 1 ATJ2;protein binding［Arabidopsis thaliana］ 77. 97
2. 5 目标基因 AsDJL1 在紫云英器官组织中的表
达特征
图 3 AsDJL1 在紫云英不同器官组织的表达特征
Fig. 3 Expression pattern of AsDJL1 in different organ / tissue of A.
sinicus . R:root;S:stem;L:leaf;N:nodule;CK:no inoculation;
N + F － :invalid nodule (P < 0. 05).
抽提紫云英共生条件下不同时间和不同器官组
织的总 RNA，调整至一致浓度反转录成 cDNA，进行
Real-time-PCR 检测靶基因 AsDJL1 在器官组织中的
表达特征(图 3、图 4)。由图 3 可见:AsDJL1 在正常
固氮根瘤中表达量最高，在感染根、茎和叶中表达量
较低，在不接种根瘤菌的对照根和不固氮无效根瘤
图 4 AsDJL1 在紫云英根瘤发育和固氮过程中的表达
特征(P < 0. 05)
Fig. 4 Dynamic expression pattern of AsDJL1 in the program of root
nodule development and nitrogen fixation of A. sinicus (P < 0. 05).
中表达量几乎为零，经过统计学分析证明 AsDJL1 在
固氮有效根瘤中呈特异性增强表达，这与 AsE246 在
根瘤中特异性表达特征具有高度的一致性［1］，从一
个侧面说明了该靶蛋白和 AsE246 可能相互作用而
参与结瘤固氮过程。由图 4 还可见:在根瘤发育固
氮的过程中，随着时间的推移，靶基因 AsDJL1 在根
瘤中的表达量在后期呈明显上升趋势，我们推测该
基因可能还与共生固氮后期的根瘤衰老有关。
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Qingyan Zhu et al. / Acta Microbiologica Sinica(2010)50(10)
2. 6 目标基因 AsDJL1 在根瘤应对胁迫条件下的
表达变化
以接种华癸中慢生根瘤菌的紫云英植株为正对
照，不接菌处理为负对照，胁迫处理为实验组。采用
2 种胁迫处理方式:80 mmol /L NaCl 和 10 mmol /L
(NH4)2 SO4。在接菌第 15 天后开始实施胁迫处理，
在胁迫处理 15 d 后收获根瘤材料，抽取其总 RNA
并调至一致浓度。采用实时荧光定量 PCR 技术进
行 AsDJL1 基因的相对定量分析(图 5)，使用相同的
试剂、引物及相同浓度的模板，测定分析实验重复 3
次，每个样品设置 3 个重复。结果表明:NaCl 胁迫
处理的紫云英根瘤中的该基因表达量高于正对照，
(NH4)2 SO4 处理根瘤中其表达量明显低于正对照，
经过表达差异性分析得到两种胁迫处理下的
AsDJL1 表达量都具有显著性差异。NaCl 处理后
AsDJL1 表达增高，推测 AsDJL1 与 NaCl 胁迫应对机
制有关，(NH4)2 SO4 处理后 AsDJL1 表达降低，这与
根瘤固氮活性明显降低相一致。总体看来在相同的
胁迫条件和处理方式下，AsDJL1 的表达变化与
AsE246 的表达变化［3］具有高度的一致性，进一步说
明了这两种蛋白的相互作用关系。
图 5 胁迫条件下紫云英根瘤中 AsDJL1 的表达
变化(P < 0. 05)
Fig. 5 Expression changes of AsDJL1 in root nodules of A.
sinicus under stress conditions(P < 0. 05).
3 讨论
本文利用构建的 pGBKT7-AsE246 /Y187 诱饵菌
株，从紫云英 AD cDNA 文库中钓取了与 AsE246 相
互作用的靶蛋白，靶蛋白含有 DnaJ-C 结构域，属于
DNA 蛋白家族。研究发现 DnaJ 蛋白有 3 种，I 型为
真正 DnaJ 蛋白，II 和 III 型蛋白是 DnaJ-like 蛋白。
DnaJ 蛋白是 Hsp70 伴侣分子系统的辅助蛋白，除了
参与蛋白的折叠、积累、转运和修复外［10 － 11］，也参与
细胞对压力的抗性反应等［12 － 14］。诱饵蛋白 AsE246
是一种特殊的转脂蛋白 (Lipid Transfer Protein，
LTP)，在植物地下部分且只在根瘤中表达。实验证
明，LTP 除了可以转运脂类物质，还具有诸多作用:
参与植物对真菌抗性的反应过程［15］，增强植物抵抗
和适应性如水胁迫、盐胁迫、金属胁迫、热激和冷处
理等恶劣环境，也会由于稳定的四个二硫键成为食
物过敏原［16］。虽然体外实验对于 LTP 研究比较透
彻，但其在体内具体作用和调节机制还不清楚。
本文通过酵母双杂交系统，获得与 AsE246 相
互 作 用 的 DnaJ-like 蛋 白 AsDJL1。 AsE246 和
AsDJL1 所属的蛋白家族，在功能上具有很大的相似
性，从侧面说明它们之间可能有相互调节的作用。
二者均与生物或者非生物因素的抗性有关，可对热、
盐和氧化等多种胁迫产生应答使植物增强抗逆境胁
迫能力［17］。首先，LTP 与 DnaJ 蛋白都在植物病理
防御机制中有着重要作用。LTP 作为抗菌肽，除了
参与防御信号转导及角质形成来抵御病菌侵染，自
身也具有一定的真菌致死性，透过改变细胞膜通透
性杀死真菌，但毒性不影响宿主［18］。DnaJ 蛋白可能
会参与某些蛋白的合成或是错误蛋白的修复来阻止
病菌的侵入，两者也可能会共同协作产生防御应答。
其次，LTP 与 DnaJ 蛋白可增强宿主对盐、热、冷等非
生物胁迫的抗性，使植物在逆境中能够生存。LTP
被多次试验证明可增强宿主对盐、热、冷和水等多种
胁迫的抗性［3，8］;DnaJ 蛋白作为 Hsp70 蛋白的辅助
蛋白，参与细胞对压力的抗性反应，调节胆固醇合成
以接收细胞对外界的热、缺氧等不适环境做出的适
应性反应，HSP70 能通过 DnaJ 蛋白识别、结合及提
供多肽底物来保护酶结构，增强生物抗性，使细胞膜
免受重金属伤害。Geetha 等(2009)通过在对花生
进行缺水和干旱实验，证明了 nsLTP 和 DnaJ 蛋白的
表达量在缺水胁迫中都呈现上升趋势，两者对胁迫
都表现出抗性［19］。
本文还通过实时荧光定量 PCR 分析，结果显示
AsDJL1 和 AsE246 的组织和时空表达、以及胁迫条
件下的表达变化等特征，确实存在着高度的一致性。
基于由本实验结果和文献报道，我们可以分析诱饵
蛋白 AsE246 与靶蛋白 AsDJL1 相互作用的可能途
径。首先，实验证明 LTP 中存在着与 CaM 相似的位
点，可能会参与脱落酸、茉莉酸的调节过程参与信号
的传导［19］;而 DnaJ 蛋白也推测参与信号的转导，可
为 HSP70 分子伴侣系统提供蛋白信号;2 种蛋白都
具有 ABA 信号传导的功能［21 － 22］，推测它们之间可
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朱庆燕等:与紫云英转脂蛋白 AsE246-相互作用靶蛋白的筛选及其基因表达特征 . /微生物学报(2010)50(10)
能存在着信号的间接联系，共同参与根瘤发育、共生
固氮和衰老过程。其次，DnaJ 蛋白能调节脂类合
成［23］，LTP 蛋白能转运脂类物质，那么我们预测这
两种蛋白可以来完成脂类加工转运的一系列过程。
DnaJ 蛋白作为一种分子伴侣的辅助蛋白，能够参与
LTP 蛋白折叠、转运及修复，LTP 作为一种分泌性蛋
白，极有可能与 DnaJ 蛋白存在相互作用。
总之，本文首次报道了与 LTP 相互作用的靶蛋
白 AsDJL1，我们分析认为 AsE246 与 AsDJL1 蛋白可
能形成复合物共同协作，参与根瘤共生固氮作用和
胁迫应答机制。但它们在共生固氮体系的具体功能
及机制，还需要进一步的深入研究，如可通过 RNAi
技术研究目标基因沉默后的共生表型，通过双分子
荧光互补(BiFC)技术研究目标蛋白在活细胞内的
互作和亚细胞定位等等。
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Screening of target protein interacting with lipid transfer
protein AsE246 of Astragalus sinicus and expression
characteristics of corresponding encoding gene
Qingyan Zhu，Yixing Li，Ning Wang，Dasong Chen，Youguo Li*
(State Key Laboratory of Agricultural Microbiology，Huazhong Agricultural University，Wuhan 430070，China)
Abstract:［Objective］AsE246 was a novel nodule-specific expressed nodulin gene encoding non-specific lipid transfer
protein 1 (nsLTP1)of A. sinicus. We screened and identified host plant target protein interacting with AsE246，and
characterized the expression patterns of target gene under symbiotic and stress conditions. ［Methods］Yeast two-hybrid
system，small-scale yeast hybridization test and real-time PCR technique were used to capture the host target protein that
interacts with the bait protein AsE246，and to quantitatively analyze the temporal and spatial expression characteristics of
target gene during root nodule development and nitrogen fixation process. ［Results］One positive clone was obtained，its
cDNA insert sequence and Blast analysis showed that:the target protein was a DnaJ-like protein，thus the corresponding
encoding gene was named as AsDJL1 . AsDJL1 was specifically-enhancing expressed in nitrogen-fixing root nodules，and
significantly increased under NaCl stress while significantly decreased under (NH4)2 SO4 stress. ［Conclusion］This work
was the first report on the isolation of proteins interacting with LTP. The work obtained some direct and convincing
evidences to show the interacting gene demonstrated high similarity as AsE246 in expression patterns and functions
involved. The present progress provided a basic foundation and theoretical basis to undertake any further investigation into
their interaction，and regulation mechanism associated with symbiotic nitrogen fixation or response to environmental stress.
Keywords:A. sinicus;DnaJ-like protein;expression characteristics;nsLTP1;yeast two-hybrid
(本文责编:张晓丽)
Supported by the Major Project of Chinese National Programs for Fundamental Research and Development (2010CB126500)
* Corresponding author. Tel: + 86-27-87281685;Fax: + 86-27-87280670;E-mail:youguoli@ mail. hzau. edu. cn
Received:27 April 2010 /Revised:19 June 2010
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