全 文 ：第 6卷 增刊
1 9 9 2年 1 0月
中 日 友 好 医 院 学 报
J《〕 t」R N A L ( )F C l l」N A一 JA PA N F R IEN D SH IP . H O S P工TA L
V o l
.
6
,
S u P P I
·
O e t o be r
,
1 9 9 2
蒲种壳免疫活性多糖
陈玉武 架 薛 智
(临床医学研究所药物药理室 )
摘要 自蒲种壳水提液醇析得到 的总多糖 ( L S C )P 中分离出酸性多糖 L S C 一 I 和 L S C 一 互 。 经
醋酸纤维素薄膜电泳和凝胶 柱层析证明 为均一组分 , 分子 量分别为 58 0 0 和 26 0 0 。 L S C -
I 和 sL c 一 l 均系蛋白多糖 , 其蛋白质含量为 n % 和 9% , 总糖含量为 87 % 和 90 % 。经 T L c
和 G c 一 M s 测定 , L s c 一 I 和 Ls c 一 ; 均由 鼠李糖 、 岩藻糖 、 木糖 、 甘露糖 、 荀萄糖 、 半乳糖
和 已糖醛酸组成 , 其分子比分别 为 1 . 34 : 0 . 61 : 0 . 20 : 0 . 53 : 1 . 0 : 1 . 12 : 1 . 20 : 和
0
.
7 6 : 0
.
5 6 : 0
.
2 0 : 0
.
9 7
: 1
.
0 0
: 0
.
9 2 : 1
.
4 7
。 体外实验发现 L s e P 具有明显的免疫增强
活性 。
关键词 蒲种壳 酸性多糖 蛋白多糖
IM M U N O A C T I V E P O L Y S A C C H A R ID E S F R O M P U
C h e n Y u w u
, e t a l
( D e aP
r t m e n t
A b s t r a c t
.
T w o a e i d iC
Of M a t e r i a M e d ica a n d P h a r m a e o l o g y
,
I n s t i ut t e o f C iln i
e a l
Z H O N G K E
1 9 9 2
,
6 ( S u P PI
.
)
: 2 5 0
M e d i e a S e i e n e e s )
P o l y s a e e h a r i d e s L S C
一
1 a n d L S C
一 皿 w e r e is o l a t e d f r o m aL g e n a r i a s ie e r a r i a
(M o li n a ) S ta n d l
.
v a r
.
e l a v a t a S
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.
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e y w e r e P r o t
e i n
一
b o u n d Po l y s a e e h a r i d
e s a n d w e r
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n e o u s a s ju d ge d b y
e l e c t r o Ph o r
e s is a n d ge l c h r
o m a t o g r a Ph y
.
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e i r m o le c u la r w e ig h t W e r e e s t im a et d
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e a b o u t 5 8 0 0 0 a n d 2 6 0 0 0
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e e t iv e ly
.
T h e p r o t e加 e o n t e n t s o r “ e 一 1 a n d L s e 一 亚 w e r e 1 1%
a n d g%
, a n d t h e e o n t e n ts o f t o t a l s u g a r w e r e 8 7% a n d 9 0%
, r e s p e e t i v e l y
.
T h e s e p o ly s a e e h a r i
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a r e e o m P o s e d o f L
一 r h a m n o s
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m a n n o s e : D
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一
g a l a e t o s e
:
h
e x -
u r o n i e a e i d i n t h e m o l a r r a t i o o f 1
.
3 4 : 0
.
6 1 : 0
.
2 0 : 0
.
5 3 : 1
.
0 0 : 1
.
1 2 : 1
.
2 0
: a n d 0
.
7 6 :
D
.
5 6 : 0
.
2 0 : 0
.
9 7 : 1
.
0 0 : 0
.
9 2 : 1
.
4 7
, r e s P e e t i v
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.
SL C I
〕
w a s f
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m u n o P o t e n t ia t i n g e f f e e t s
.
K e y w o r d s : aL g
e n a r i a s i e e r a
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.
v a r
.
e la v a ta S e r ; a e i d ie p o l y sa e e h a r i d e ; P r o t e i n
-
b o u n d op l y s a e e h a r id e
蒲种壳为葫芦科植物抓子 〔L a g e n a r ia s i c e r -
a r ia ( M
o l i n a ) s t a n d l
.
v a r
. 。 l a v a t a s e r
. 〕 老熟的
干燥果皮 , “ 瓤子 ” 江南名扁蒲 , 故称蒲种壳 ,
有利水 、 消肿 、 治腹胀之功用 。 我所免疫室在
进行增进免疫功能中药的研究中 , 发现蒲种壳
多糖对小鼠脾淋 巴细胞增殖有显著刺激作用 ,
腹腔注射对环磷酞胺降低脾细胞数有一定拮抗
作用 。 lj[ 因此我 们对蒲种壳多糖进行 了化学
研究 。
l 材料与仪器
1
.
1 原料
蒲种壳购自浙江省杭州览桥花园蔬菜良种
场 。
* 女 , 45 岁 , 主管技师
增刊 陈玉武 : 蒲种壳免疫活性多糖
1
.
2 仪器
s
一
3钟罩式超过滤器 , 上海兴华 电子仪器
厂产品 ; 日立 2 2 0一 A 型分光光度计 ; 8 3 5一 5 0 氨
基酸自动分析仪 ; P ye 20 4 型气相色谱仪 , 7 0 7 。
H 型质谱仪 。
1
.
3 试剂
o E A E
一纤维素 ( d ie th y la m i n o 一 e t h y l c e l l u l“ e ,
o E
一
5 2 ) w h a tm a n 公司产品 (进 口分装 ) ; eD x -
t r a n 标准品和 eS p h a d e x G 一 10 0 、 G 一 2 0 0 为 P h a r -
m ac ia 公司产品 ; 醋酸纤维素薄膜 , 浙江黄岩曙
光化工厂产品 ;硅胶 G F 2 54 预制板 , M er ck 公司
产品 ; 岩藻糖 , se r v a B R ; 半乳糖 , F一u k a A G ;
其他糖标准品为国产试剂 。
2 方法与结果
2
.
1 提取 、 分离和纯化
蒲种壳 I kg , 加 95 % 乙醇连续回流提取 ,
药渣凉干 。 水煎提 , 水提液浓缩至 I O0 0 ml , 加
3 倍量 95 % 乙醇沉淀 。 沉出物用乙醇 、 丙酮反
复洗涤 、 干燥 , 得粗多糖 17 · g5
取粗多糖 10 9 , 用 S e v a g 法 [ , 〕脱蛋 白至三
氯醋酸反应阴性 。 取上清液 , 除去氯仿和异戊
醇 , 加蒸馏水稀释 , 超滤 (滤膜截留分子量 1
万 ) 。 取截留部分浓缩 、 醇析 , 得不含游离蛋白
质且分子量在 1 万 以上 的总 多糖 l( ag en ar ia
s i e e r a r i a e la v a t a op l y sa e e h a r i d e s
,
L S C P ) 4
.
3 6 9
。
L s e P 用 A l e ia n b l u e 染色阳性 , 表明为酸性多
糖 。 紫外光考邹 s n m 有吸收 , inA n` o ” a` c k一 ` “ “染色阳性 , 又表明为蛋白结合多糖 。
取 SL C P 3 9 , 用蒸馏水溶解 , 通过 D E 一 52
纤维素柱 (硼酸型 , 4 e m x 4 5 e m ) 。 分别用 H Z o 、
0
.
o l M
、
0
.
0 5 M
、
0
.
I M 硼砂和 0 . I N 、 0 . S N
N a 0 H 溶液洗脱 ,每份 50 m l 收集 ,苯酚 一浓硫酸
试剂检出 。 将 0 . 01 M 和 0 . I M 硼砂洗脱部分
按检出曲线合并 、 浓缩 , 透析后醇析得蒲种壳
多糖组分 ( aL g e n ar 纽 s i e e r a r ia e l a v a at , SL C ) 一 I
和 l 粗品 , 再通 se hP ad ex G 一 1 0 柱得到精品 。
2
.
2 纯度检查及分子量测定
.2 .2 1 醋酸纤维素薄膜电泳
L S C
一
I 和 L S C 一 l 用缓冲液 A ( 0 . Z M 巴 比
妥 , I N 盐酸 , p H 8 . 8 ( 2 5 0 v , 15 m i n ) 、 B ( 0 . 2
M 硼砂 , 0 , Z N K o H ) , l : 1 混合 , p H g . 2 ( 1 0 0
V
,
3 0m in )
。
1% A l c ia n b l u e 醋酸溶液染色 , 均
显示出单一斑点 。
.2 2
·
2 凝胶柱层析
L S e
一
r 和 SL C 一 亚各 1 m g , 用 0 . 5 m l 0 . 0 5
M N a C I 溶液溶解 , 上 eS p h a d e x 一牙一 2 0 0 柱 ( l , 3
e m X 3 7 e m
, 用 0 · 0 5 M N a C I 溶液 , 以 6 m一/ h 流
速平衡 d2 ) 。 用相同盐溶液以相同流速洗脱 , 2
m l/ 份 自动收集 ,苯酚 一浓硫酸试剂检出 ,均得到
均一对称峰 。
.2 .2 3 分子量测定
将分子量 1万 、 4 万 、 7 万标准葡聚糖相继
上柱 (平衡的 s e p h a d e x o 一 2 0 0 柱 , 1 . 3 。 m 又 3 7
e m )
, 以 6 m z / h 流速 , 用 0 . 0 5 M N a C I洗脱 , 2
m l/ 份收集 , 苯酚 一浓硫酸试剂检出 , 分别得到洗
脱体积 V e 。 再将蓝葡聚糖 2 0 0 0 上同一柱 , 求出
柱 的空体积 v o 。 根据 v e/ v o 与 log M 之间的线
性关系绘制标准 曲线 。 最后将 sL c 一 I 和 比c -
万按上述相同条件上柱 , 求得 v e , 通过标准曲
线上的 V e / V 。 , 查出其分子量对数 , 进而求出
sL c
一
I 分子量 约 为 5 . 8 万 , L s C 一 l 约为 2 . 6
万 。
3 分析 、 鉴定
3
.
1 含量测定
3
.
1
.
1 蛋白质含量测定
用 L o w yr 法 3j[ 测定 sL C 一 I 蛋 白质含量 为
n %
, L sc
一
l 为 9% 。 其氨基酸组成见表 l 。
3
.
1
.
2 总糖含量测定
用苯酚 一浓硫酸法叫测定 sL c 一 I 总糖含量
为 8 7% , SL C 一 l 为 90 % 。
3
.
1
.
3 已糖醛酸含量测定
L S C
一
I 和 L S C 一 l 与硫酸一咔哇试剂呈阳性
反应 , 呈色后的吸收曲线在 5 2 6 、 4 0 0 n m 处出
现 已糖醛酸的特征吸收阁 , 与半乳糖醛酸的吸
中 日 友 好 医 院 学 报 6 卷
表 1 S LC一 I和 l另 C es亚所含蛋白质的氨基酸组成 %
LS C一 1 1万 C一 l S LC 1 S LC一 l
As皿r t i e a e id 1 1. 0 1 10 . 6 4 M et hion n i e 18 . 6 2 1 5, 4 7
1 飞r eo n i n e 6 . 7 9 8 11 l s o l e u c i n e 4 . 2 3 5 . 3 0
eS r i n e 5
.
4 7 5
.
4 0 此u e in e 1 2 . 5 8 9 . 3 6
G l u at m i e ac i d 1 1
.
4 7 1 1
.
3 6 P r o l in
e
2
.
9 8
`
2
.
6 6
G 】y助e 5 . 3 5 6 . 0 7 P h e n y l a la n in e 4 . 3 5 4 . 1 6
A l a n i n e 6
.
6 2 8
.
8 2 L y s i n e 2
.
1 4 2
.
2 7
C 》 , s t in e 一 0 . 8 0 H is t i d l n e 0 . 3 4 0 . 3 6
V a l i n e 5
.
8 7 5
.
8 0 A r g i n i n e 2
.
4 5 2
.
9 8
表 2 水解还原乙酷化衍生物的气相层析滞留时间和质谱的主要碎片
滞留时间 质谱主要碎片 m e/标准品 1石C 一 I 1名 C 一 亚
鼠李糖 1 9m in 1 7 s
19 m勿 3 65
1 9m i l 5 9 s
3 0m i l〕 0 95
3 0m in 4 8
s
3 1m in 2 4 s
1 9m i n 2 2 s
1 9m i n 3 8 s
1 9m i n 5 9 s
3 0m i n 0 4 s
3 0m i n 4 8 s
3 1m in 2 4 s
19 m in 2 3 s
1 9m i n 4 5 s
2 0 m i n 02 s
3 0m in 07 s
3 0tn i n 4 4 s
3 0m in 2 0 s
2 3 1
,
1 8 7
,
1 7 0
,
15 7
, 1 4 5
, 12 8
,
岩藻糖木 糖甘露糖葡萄糖
2 1 7
, 1 8 7
, 1 7 0
, 15 7
, 1 4 5
, 1 2 8
,
2 8 9
,
2 5 9
,
2 1 7
, 18 7
, 1 7 0
, 15 7 ,
6 8
, 4 3 ( 1 0 0% )
6 8
, 4 3 ( 1 00% )
9 7 , 7 3 , 4 3 ( 1 0 0% )
半乳糖
11 5 , 1 0 3
,
8 5
,
同上
1 1 5
,
1 0 3
,
8 5
,
1 3 9
,
1 15
,
10 3
,
同上
同上
_ 刃
U
.
7
比 C一 I
L sc
一
I
一半乳粉一介二d J任:nó日ù
收 曲线一致 (图 1 ) 。 用此方法测定 sL c 一 I 的已
糖醛酸含量为 17 % , 占总糖含量的 20 % ; L S C -
亚 已糖醛酸含量为 23 写 , 占总糖的 25 % 。
.3 2 糖基的鉴别
.3 .2 1 完全酸水解
取 SL C 一 I 、 L S C 一 l 各 6 m g ,分别加入 Z M
三氟醋酸水溶液 l ml , 封管 , 105 ℃甘油浴水解
h1
。 减压除去三氟醋酸 ,用 甲醇溶解后点样 ,行
硅胶薄层层析 。 展开剂 A (正丁醇一毗吮 一水 ) (8
: 1 , l)
、
B ( 乙酸乙酷一 甲醇一醋酸一水 ) ( 1 2 : 3 :
3 : 2 )
。 苯胺一邻苯二 甲酸试剂显色 ,检出斑点与
鼠李糖 、 岩藻糖 、 甘露糖 、 葡萄糖 、 半乳糖 、 葡萄
糖醛酸和半乳糖醛酸标准品 R f 值一致 。
.3 .2 2 水解产物的还原 、 乙酞化
上述 sL c 一 I 、 L s c 一 五水解产物各 5 m g 加
入蒸馏水 Z ml 溶解 ,各加入 50 m g 硼氢化钠室
温还原 h2 。 反应液通过 7 3 2 ( H+) 树脂柱 中和 ,
中和液减压蒸馏 , 并反复加甲醇数次带走硼酸 。
还原产物加醋配一毗睫 (1 : 1) l ml , 沸水
浴反应 ZOm in , 反应液减压抽干 , 得 SL c 一 I 和
SL C
一
l 水解 、 还原 、 乙酸化产物 。
依据水解物薄层层析结果 , 取鼠李糖 、 岩
藻糖 、 甘露糖 、 葡萄糖和半乳糖标准品各 工m g ,
加 2 m l蒸 馏 水 溶 解 , 照 上 法 还 原 、 乙 酞 化 ,
习 .
0
.
2卜了厂~ \ 、 尹产/ 一 、 \ 产 、
3 5 0 4 5 0 5 5 0 6 5 0 n m
附图 sL c 一 I 、 sL c 一 l 硫酸咔哇反应后的吸收光谱
得到标准糖的还原 、 乙酞化产物 。
将上述产物进行 G c 一M S , S E一 54 柱 (0 · 32
. 、 一 一 组℃ / m in
e m 又 3 0 e m ) , 柱温 15 0 oC一 2 2 0℃ , N : 0 . 5k g / e m Z 。结果 (表 2 ) L S e 一 I 、 SL e 一 l 有 5个锋与标准鼠李糖 、 岩藻糖 、 甘露糖 、 葡萄糖和半乳
糖的滞留时间一致 。除此之外 , 在 19 m in 5 95 还
有一峰 , M s 主要碎片具五碳糖特征 , 并根据木
糖薄层 层析 比移值与岩藻糖非常相 近 , 因此
增刊 陈玉武 :蒲种壳免疫活性多糖
推测这个峰可能为木糖 。 又取木糖标准品进行
还原 、 乙酞化 , 乙酞化产物 G c (单独进样和与
sL c
一
l 反应产物一起进样 ) ,结果证 明这个峰为
木糖 。
4 讨论
从蒲种壳分离纯化得到的多糖组分 SL C -
I 和 sL c 一 ; 均含有一定 比例的蛋白质 , 其单糖
组成中都含有已糖醛酸 , 表明它们是含有蛋白
质的酸性杂多糖 。
在单糖组成分析中 , 气相层析结果比薄层
层析多检 出一个木糖 。这可能是 由于木糖含量
较低 , 薄层层析的灵敏度和分离效果比气相层
析差的原因所致 。
在薄层层析和硫酸 一咔哇反应中 , 均确证
sL c
一
I 和 sL c 一 ; 含有已糖醛酸 , 而气相层析中
未能检出 。 主要是 由于已糖醛酸中的梭基在一
般条件下不易被硼氢化钠还原 , 因此 已糖醛酸
的还原 乙酞化产物仍含有梭基 , 极性大 , 在本
实验条件下不易气化而未能出峰 。 .e[ ’ 〕
多糖组分水解还原乙酞化产物 G C 一 M S , 质
谱的主要碎片 , 基峰 43 以后为放大三倍所能检
出的碎片峰 。 sL c 一 I 和 sL c 一 l 所含单糖裂解的
主要碎片与标准糖的主要碎片一致 , 符合甲基
五碳糖 、 五碳糖和六碳糖的裂解规律 。阁 质谱
数据支持了薄层 层析和 气相层析 对 SL C 一 I 、
L S C
一
l 单糖组成的分析结果 。
瓤子青嫩的果实在我国南方江苏 、 浙江 、 江
西和四川等地常做为蔬菜食用 , 老熟的果皮作
为药用 。 蒲种壳多糖增强免疫功能活性的发现 ,
对提高其食用和药用价值有一定参考意义 。
(致谢 植物样品 由浙江杭 州觅桥花 园蔬
菜 良种场代为收 购 。 氛基酸分析由 中国药材公
司质量监测站代为测定 。 G c 一 M s 由 中国中医研
究院 中药所测试 中心测定 。 )
5 参考文献
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( 19 9 2
一
0 3
一
0 9 收稿 29 9 2一 0 6一 1 5 修回 )
一卜 加一卜一于 一卜 一刊卜 . 十一牛 一十 ”一卜 . 月卜. 」卜 一伟 . 斗 . 州 卜侧 月卜 创 州卜 ~ ~十 . 日卜润 叫卜 一州卜 , 州卜一卜一十 . 一卜 . 州卜 . 州卜 . 州卜 “ 」一侧 州卜 . 斗. . 州卜一十 . 一卜一卜 ·州卜 . 州卜 . 州卜 ” 一卜 ~ 干翻 州卜 . ~卜 . . 一十 . 一卜 . 刁一 · 刊卜·
· 期刊文摘 ·
应用 T 人细胞抗原受体可变区抗体研究皮肤 T 细胞淋巴瘤
(摘自 : s t e v e n J H , e t a 鱼. 伽ant eo u s T 一 e e l l l y m hP oma
: U t j l i t y of an ti卜川 ies t o ht e v ar i a b 一e 、 ig o n s o f th e h u m an
T 一沈 1 a n t i g e n r e eC P t o r . J A m A ca d eD r ma t of , 19 9 2 , 2 6 : 5 52 )
T 细胞抗原受体为 2 个二硫键连接 、 90 kb 糖蛋白的 iT 异二聚体 , 主要由 a 链及 日链构成 , 每条链由可变区
( v )
、 连接区 ’ ( )J 及恒定区 ( )C 组成 , 日链尚有多样性区顺序 ( D ) , 其基因重排表现的多样性的别于 B 细胞 。 抗
v 区抗体免疫组化能提示是否为 T 细胞及其克隆性质 。
作者用 7 种针对 v 区 (附 s a , 四 s b , 日v s e , 日V 6 , 叩 s , 阴一2 及 a v Za ) 的抗体作姗 e 免疫组化法 , 研究了 1 3
例皮肤 T 细胞淋巴瘤皮损 (7 例为斑块期 M F 、 3 例为肿瘤期 M F 、 3 例 se az yr 综合征 ) , 其中 2 例阳性 (l 例斑块期
M F 针对 卿 a5 抗体 、 1 例 S七z a r y 综合征针对 四 c5 抗体 ) , 呈致密或弥漫性染色 , 而正常外周血仅有 1% ~ 5% T 细胞
显示部分散在弱阳性 , 易于鉴别 。 作用认为 v 区抗体有助于皮肤 T 细胞淋巴瘤的诊断及病情随访 。
(皮肤科 刘永生摘译 赵武述校 ) ( 19 92 一 06 一 15 收稿 )