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Isolation of polysaccharides from tea and their hypoglycemic activity

茶叶中多糖的分离及降血糖活性的研究



全 文 :中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第10期2006年10月
FareChineseherbsAnoectochilusmburghiiDNAfingerprint—
ingsusingRAPDEJ3 ChinTraditHerbDrugs(中草药),
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茶叶中多糖的分离及降血糖活性的研究
王元凤,金征宇’
(江南大学食品学院,江苏无锡214036)
摘 要:目的 对茶叶中的水溶性中性多糖(NTPS)和酸性多糖(ATPS)进行分离,以探讨不同结构的茶多糖的降
血糖活性。方法采用弱碱性的大孔阴离子交换树脂D315分离出两种带不同电荷的茶多糖N’IPS和ATPS,采用
气相色谱和离子色谱分析其单糖组成.并采用DEAESepharoseFF对其作进一步分离,通过HPGFC法分析其分
离产物主要级分的相对分子质量。通过四氧嘧啶Ip造成高血糖模型,连续培茶多糖12d,对比研究两种茶多糖的
降血糖括性。结果NTPS和ATPS都是杂聚糖。NTPS以中性糖为主,古质量分数为6.82%半乳糖醛酸,中性糖
部分主要由半乳糖组成}ATPS以酸性糖为主.古质量分数为33.02%半乳糖醛酸,中性糖部分主要由鼠李糖、阿拉
伯糖和半乳糖组成。两种茶多糖相对分子质量均小于3×104。NTPS、ATPS按照200和400mg/kg。d的剂量连续
给四氧跨睫糖尿病小鼠jg12d.发现都能抑制四氧跨睫糖屎病小鼠血糖的升高。结论首次采用D3】S阴离于交换
树脂从茶叶中分离出了不同结构的多糖NTPS和ATPS,两种多糖都有很好的降血糖效果。
关键词:茶叶}中性多糖;酸性多糖}四氧嘧啶;糖尿病小鼠
中固分类号:R284.1 文献标识码:A 文章编号:0253—2670(2005)10—1453—05
Isolationofpolysaccharidesfromteandtheirhypoglycemica tivity
WANGYuan—fen91.JINZheng—yu2
(FoodSchoolofSoathernYangtzeUniversity·Wuxi214036,China)
Abstract:ObjectiveToisolatewater—solubleneutralpolysaccharides(NTPS)andacidicpolysaceha—
rides(ATPS)framtea,investigateheirhypoglycemiceffects,andelucidatether lationshipbetween
structureandactivity.MethodsWeakbasemacroporousanion—exchangeresinD315wflsusedtoisolate
twokindsofteapolysaccharidesNTPSandATPSbasedonelectricchargeofteapolysaccharides.Their
monosaccharidecompositionswerea alyzedbygaschromatographyandionc romatography.NTPSand
ATPSwerefurtherisolatedbyDEAE—SepharoseFF.Molecularweightsofthemainfractionswereana—
lyzedbyHPGPC.Themod lofdiabeticmellituswaestablishedbyipalIoxaninmice.Thebloodsamples
werecollectedwithtailveinpuncturetod terminebloodglucose.Thehypoglycemiea tivityb tweenneu—
tralandacidicpolysaccharidesw scomparedafterigteapolysaccharidesfo12d successively.Results
t作睫者a筒[]M舟{t王20元05-风04(109474一),女。湖北宜昌人,江南大学食品学院200l级博士生,研究方向为碳水化合物
*通讯作者盒征字’Fel{(051015816950





印[}[[
万方数据
·1454· 中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第10期2005年10月
BothNTPSandATPSwereheteropolysaccharides.NTPSw smainlycomposedofnetltralpo yssccharide
andiramainmonopolysaccharl如WB.SD—galactoae.NTPScontalned6.82%galacturonicacid.Whereas,
ATPSwasmainlycomposedofacidicpolysaccharideandcontained33.02%D—galactose,whoseneutral
polysaccharidewasmostlyL—rhamnose,D—arabinosendD—galactose.ThemolecularweightsofbothtWO
kindsofteapolysaccharideswe elessthan3x104.ContinuousigadministrationofNTPSandATPSE200
and400mg/(kg·d)]for12dwasfoundtOdepressglucoseincreasesinanoxan—dependentdiabeticmodel
mice.ConclusionTWOdifferentstructuresoft aD01vsaccharidesNTPSandATPSareisolatedbyanion—
exchangeresinD315firstly.Bothteapolysaccharidesshowgoodhypoglycemiceffect.
Keywords:tea;neutraIpolysaccharide(NTPS)}acidicpolysaccharide(ATPS);alloxan;diabetic
目前,糖尿病的发病率日益增高,严重危害人类
健康,已成为人类的第5位死亡原因。糖尿病是一种
多病因的内分泌代谢紊乱性疾病,尚无理想的治疗
方法。传统磺酰腮类和双胍类降糖药,久用具依赖性
和不良反应。近年来,国内外学者开始从天然产物中
筛选降糖成分,取得了一些进展。国内对知母、薏苡
仁、刺五加、米糠、紫菜、茶叶等降血糖植物多糖的研
究表明,这些多糖基本上都是杂多糖Ct~s3。国内外研
究表明,茶多糖具有降血糖功能““],但不同结构的
多糖与降血糖活性的关系报道甚少。实验发现D315
树脂可以有效地对茶多糖溶液进行脱色和脱蛋
白o]。并发现,茶多糖除含有中性糖之外,还含有相
当量由己糖醛酸组成的酸性糖,采用弱碱性阴离子
交换树脂D315可分离出几种不同结构的茶多糖。
本实验探讨了D315树脂分离出的两种不同结构的
茶多糖的单糖组成、相对分子质量,并采用DEAE
柱色谱分析其组分的质量分数.比较了两种多糖的
降血糖活性,为茶多糖的进一步研究提供依据。
1材料与方法
1.1材料、试剂与仪器;粗老茶叶购自湖北宜昌,经
粉碎后过60目筛备用;复合纤维索酶(Viscozyme
L,丹麦诺维信公司);D315大孔阴离子交换树脂
(上海华震科技有限公司);DEAE—SepharoseFF
(Pharmaeia公司);四氧嘧啶(Sigma公司)}鼠李
糖、葡萄糖、木糖、半乳糖(上海生化试剂公司)、阿拉
伯糖、核糖、岩藻糖、葡萄糖醛酸(Sigma公司);半乳
糖醛酸(Fluka公司);DextranT系列(Pharmacia
公司);其他试剂均为国产分析纯。
DBS--100电脑全自动部分收集器、LH一2s恒
流泵(上海沪西仪器厂);日本岛津GC一14A气相
色谱仪;Waters600高效凝胶色谱仪(配24lo折光
检测器和M32工作站);美国Dionex2010离子色
谱仪等。
1.2方法
1,2.1茶多糖的分离提取;粗老绿茶800g.80%体
积分数工业乙醇70C提取1.5h,提取后的茶渣先
用去离子水65C提取2.0h,再用复合纤维索酶在
茶叶与水的质量比1:10、温度40C、pH值5.5、加
酶量质量分数为0.5%条件下提取3h,合并两次滤
液,55C减压浓缩,3倍体积工业乙醇沉淀,沉淀物
用丙酮、乙醚、乙醇交替洗涤2次,沉淀复溶于水,稀
释至合适的浓度,以一定的速度流过D315大}L阴
离子交换树脂,先用去离子水洗脱,洗脱液经醇沉后
溶于水,透析脱盐,冻干后得多糖样品NTPS;再用
0.5mol/LNaCl洗脱树脂柱上的剩余活性成分,洗
脱液再醇沉,再溶于水,透析脱盐,冻干后得多糖样
品ATPS。
1.2.2NTPS和ATPS的DEAE—SepharoseFF分
离:NTPS和ATPS分别过DEAE—SepharoseFF阴
离子交换柱(2.6am×50cm)。称取300mg多糖溶
解于25mLpH6.0的磷酸缓冲液中。上柱,先用
pH6.0的磷酸缓冲液进行梯度洗脱,再用0~0.6
mol/LNaCIpH6.0的磷酸缓冲液进行梯度洗脱.
平均体积流量2.5mI。/rain,每2min收集一管,每
间隔3管测486nm吸光度值,每管取250HL,用硫
酸一苯酚法跟踪检测,以吸光度值对洗脱体积作图,
得出洗脱蓝线,收集吸收峰区域的洗脱液,透析,
冻干。
l,2.3茶多糖单糖组成分析“⋯:称取茶多糖样品
20mg,加入2mol/I。H2SO。2mL,105C水解8h,
水解液用碳酸钡中和,离心,上清液减压浓缩燕干。
往蒸干后的水解样品中加入2mg肌醇,10mg盐酸
羟胺,0.5ml。吡啶,90C反应30’min,不断振摇,取
出室温冷却。加入0.5ml。醋酸酐,90C反应30
min后取出,气相色谱分析。分析条件:oVl701弹
性石英毛细管柱(25mm×0.33mm),FID检测器,
万方数据
中草药ChineseTraditionaIandHerbalDrugs第36卷第10期2005年10月· 455·
载气N2:2ml。/rain,H2:40mI,/rain,空气:550mI√
min,程序升温方式:180C(5rain)升温240C(25
min),升温速度为3c/min,气化室温度280c,检
测器温度260C,进样量10pI。。
1.2.4茶多糖相对分子质量测定:采用高效凝胶渗
透色谱法,HPGPC法[1“⋯,将酸性茶多糖ATPS溶
于o.1tool/I。NaNO。溶液中,使其质量浓度为10
mg/mI。,离心(1000r/min)10min,取上清液进行
色谱分析,迸样量为20pI.。色谱条件为:色谱柱Ul—
trahydrogel“I,inear(300mm×7.8mm.2“m),流
动相0.1mol/I。NaNO。,体积流量0.9mL/min,柱
温45C。对照校正曲线,根据茶多糖的保留时间求
出其相对分子质量。
1.2.5糖醛酸的鉴定及质量分数测定“”]:采用离
子色谱法,离子色谱仪型号:Dionex2010.产地:美
国,淋洗液:0.15mol/I,NaOH一0.15mol/I.NaAC.
分析柱:CarboPac“PAl柱,脉冲安培检测器:Au
电极。进样量t50I。,体积流量0.7m1./min。
1.2.6茶多糖对四氧嘧啶糖尿病小鼠降血稽作用
实验08]:健康雄性昆明种小鼠,体重18~22g,分
笼,标记,称质量,禁食12h后ip四氧嘧啶200mg/
kg,3d后,禁食5h剪尾尖取血测血糖,血糖值在
9.5mmo]/I。以上者为糖尿病小鼠(DM)模型。将实
验型糖尿病小鼠随机分成5组,模型对照组(DM)、
NTPS(200和400mg/kg·d)和ATPS(200和400
mg/kg·d)组。同时设正常对照组(contr01)。其中正
常组及模型组灌生理盐水,各组ig给药1次/d×
12,末次给药后禁食5、11h剪尾尖采血测血糖,并
记录体重变化。
1.2.7血糖测定和统计学分析:血糖测定采用邻甲
苯胺超微量法。用SPSS软件分析,所用指标以z±
s表示,采用LSD法进行多重比较。
1.2.8指标的测定:中性糖质量分数:苯酚一硫酸比
色法o”;茶多酚质量分数:酒石酸亚铁比色法:”1;咖
啡困质量分数;HPI。C法口”;蛋白质质量分数:考马
斯亮兰法”⋯。
2结果
2.1 分离纯化:800g低级粗老绿茶,经大孔阴离
子交换树脂D315分离,得到带很少负电荷的多糖
样品NTPS9.26g,得率为1.16%,总糖质量分数
为82.7%,半乳糖醛酸质量分数为6.82%,葡萄糖
醛酸质量分数为1.56%i得到D315树脂吸附较强
的带负电荷较多的酸性糖ATPS6.20g,得率为
0.77%,总糖质量分数为85.5%,半乳糖醛酸质量
分数为33.02%,含微量葡萄糖醛酸。表明大孔阴离
子交换树脂D315可以按照荣多糖的电荷性质,对
茶叶多糖初步分离和纯化。
2.2茶多糖的基本理化性质:对茶多糖NTPS、
ATPS进行组分分析,发现均不含多酚、咖啡因,
NTPS含微量蛋白质,ATPS不含蛋白质。气相色谱
分析表明NTPS中性糖部分由L一鼠李糖、D阿拉伯
糖、D一甘露糖、D一葡萄糖、D一半乳糖组成,5种中性
糖的摩尔比为0.13:0.09l0.14;0.03t 1.0.
ATPS中性糖部分由L一鼠李糖、D一核糖、D一阿拉伯
糖、D一甘露糖、D一葡萄糖、D一半乳糖组成,6种中性
糖的摩尔比为0.76l 0.141 0.28l 0.061 0,05I
1.00;ATPS以酸性糖为主,其质量分数为33.02%
半乳糖醛酸。
2.3茶多糖的DEAESepharoseFF分离:经D315
分离的茶多糖NTPS经DEAESepharoseFF进一
步纯化,见图1,可见用缓冲液洗脱的中性糖质量分
数很高,收集,冻干得中性多糖样品NTPSl,相对于
NTPS的回收率为34.1%;NTPS采用0~0.6
mol/I.NaCI梯度洗脱,有两个较大的峰,收集管
121~142,冻干得NTPS2.相对于NTPS的回收率
为儿。7%;收集管144~146,冻干得NTPS3,相对
于NTPS的回收率为12.7%。NTPS采用NaCI梯
度洗脱酸性糖的回收率为24.4%。从图1还可看
出,NTPS2、NTPS3的NaCI洗脱浓度为0.15~0.3
mol/I。,表明NTPS中的酸性糖带负电荷较少。
DEAESepbaroseFF分离表明NTPS主要由中性
糖组成。
。;¨0
2Ⅲl
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}
(}6I)
1
“40暮

f1 20卺

0 50 10(I 150 200 250
收集管号
田l NTPS经DEAESepharoseFF的洗脱曲线
Fig·lElationofNTPSbyDEAESepharoseFF
ATPS经DEAESepharoseFF进一步纯化,见
图2,可见用缓冲液洗脱的酸性糖质量分数很低,收
集,冻干得ATPSl。相对于ATPS的回收率为
2.9%;ATPS采用o~0.6mol/LNaCl梯度洗脱,
出现3个较大的峰和一个小峰,收集管80~107,冻
万方数据
·1456· 中草药Chinese’YradifionaIandHerbalDrugs第36卷第10期2005年10月
干得酸性多糖样品ATPS2,相对于ATPS的回收率
为17.9%;收集管110~134,冻干得酸性多糖样品
ATPS3,相对于ATPS的回收率为17.3%刈女集管
137~16l,冻干得酸性多糖样品ATPS4,相对于
ATPS的回收率为21.2%;收集管174~ 88,冻于
得酸性多糖样品ATPS5,相对于ATPS的回收率为
3.3%。对于ATPS,NaCI梯度洗脱得到的酸性糖的
回收率为59.7%。从图2还可看出.ATPS2、ATPs3
和ATPS4的NaCl洗脱浓度分布在0.15~o.45
mol/I.,表明ATPS中的酸性糖带负电荷比NTPS
中的酸性糖多。ATPS的DEAESepharoseFF分离
表明ATPS主要由酸性糖组成。
300
目2
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寸1.00
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图2
Fig.2
50 100 50 200
收集管弓
04
O2
ATPS经DEAESepharoseFF的洗脱曲线
ElationofATPSbyDEAESepharoseFF
紫外扫描结果显示,ATPS在220nnl处有一突
起的峰,在260、280nm处无吸收峰,表明不含蛋自
质,NTPS在260ilm处有一小峰,280nm处无吸收
峰,可能含有核酸。
2.4 茶多糖的相对分子质量:对荼多糖N’FPS、
ATPS及从中分离出来的主要产物NTPSl、
ATPS2、ATPs3、ATPS4采用凝胶渗透色谱进行相
对分子质量分析,结果表明:NTPS相对分子质量分
布在26718和5986,NTPSI相对分子质量分布在
21025。ATPS相对分子质量分布为20601和5131,
ATPS2相对分子质量分布为4430,ATPS3相对分
子质量为13387和7011,ATPS4相对分子质量为
16320。可见,NTPS和A1IPS均小于3×104。实验
发现两种多糖的溶解性均较好,粘黏度不大。
2.5茶多糖对四氧嘧啶致糖尿病小鼠的降血糖作
用:由表1可以看出,在所设的两个剂量200和400
mg/(kg·d)中,连续给药NTPS、ATPS12d,第12
天给药5.0、11.0h均较模型对照组血糖水平明显
降低,NTPS在400mg/(kg-d)更显著,呈现量效
关系;ATPS则相反,这可能与剂量高,多糖溶解性
降低,剂量低,药效减弱有关。
衰1 茶多糖对四氲嘧啶致精尿病小鼠血糖的影响(i士F,”崔10)
Table1 Effectof eapolysaceharidesonMoodglucoseofalloxaninduceddtabetlcmi e(;士s.n一10)
与模型对照组比较:*P<0005**P*P<00 5**P(札01YsDMgroup
2.6茶多糖对四氧嘧啶小鼠质量的影响:如图3所
示,小鼠经四氧嘧啶造模后,质量较造模前下降显著
(P<0.05),造模后ig茶多糖NTPS、ATPS,质量又
开始回升,N’FPS给药后呈现一直平缓的上升趋势,
而ATPS则表现出给药后前3d先下降紧接着质量
又七升的趋势,到12d,基本上与NTPS组小鼠质
量接近,暗示着两种茶多糖的降血糖机制不一样。
3结论
用弱碱性的大}L阴离子交换树脂D315分离出
两种带不同电荷的茶多糖NTPS、ATPS,均含有工一
鼠李糖、D一核糖、D一阿拉伯糖、D一甘露糖、D一葡萄
糖、D一半乳糖。NI’PS以中性糖为主,含质量分数为
国3 NTPS和ATPS对四氟嘧啶糖尿病小鼠
质量的影响
Fig.3EfkclsofNTPSandATISOnbodyweight
ofalloxan—dependentmice
6.82%半乳糖醛酸,中性糖部分又主要由半乳糖组
■loE\世鹱百主
万方数据
中草药ChineseTraditionMandHerbalDrugs第。6卷第T0期2005年Io月·1457-
成{ATPS以酸性糖为主.含质量分数为33.02%半
乳糖醛酸,中性糖部分主要由鼠李糖、阿拉伯糖和半
乳糖组成。两种茶多糖相对分子质量均小于3×
104,溶解性较好,黏度不大。动物实验表明,NTPS、
一a.TPS都能抑制四氧嘧赃糖尿病小鼠血糖的升高,
具有降血糖功能,但两者表现出的剂量效应,给药后
的质量变化均不相同,这可能与两者的单糖组成.已
糖醛酸质量分数及其形成的空间结构、电荷效应不
同有关,关于其降血糖的机制、多糖的构效靶点还得
进一步研究。NTPS、ATPS的进一步分离和纯化、
结构鉴定,多糖的构效荧系的探讨正在进行中。
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当归补血汤中组分的变化及归属分析
王亚丽“2,粱逸曾”,李博岩1,胡 芸1,胡黔楠。
(1.中南大学中药现代化研究中心,湖南长沙410083;2.甘肃中医学院科研中心,甘肃兰州730000)
摘要:目的利用HPI。C—DAD提供的色谱和光谱信息,对相同实验条件下提取的当归补血汤及其单味药当归、
黄蓖的色谱指纹图谱流出组分进行对比分析,实现了当归补血汤与其单昧药中各组分的归属分析。方法结合光
谱相关色谱方法,比较了复方与组成该复方的单味药中各组分的异同.实现了对组分的归属分析。结果 当归补血
汤色谱指纹图谱中的18个色谱峰,10个组分来源于当归+11个组分来源{二黄芪,其中5个组分为当归和黄甍的共
有组分·2个组分为新物质。结论率方法方便、快捷,可对中药复方及组成该复方的单昧药成分的色谱指纹图谱进
行快速比较分析。并为复方药理药效的比较研究奠定了基础。
关键词:中药色谱指纹图谱;当归补血汤;光谱相关色谱;归属分析
中冒分类号;R284.1 文献标识码:A 文章编号:02532870(2005)10—1457一04
Relativeadscriptionofcomponentsbetweencomplexandsingleh rb
inDangguiB xueD coction
WANGYali’一,LIANGYi—zeng2,LIBoyan7.HUYun7,HUQian—NaN。
(1·ResearchCenterofModernizationofCh neseHerbalMedicines·CentralSou hUniversity,Changsha410083,China
基收稿日期盒项目::2国00家5自01然1科2学基金重点赘助项日(20235020,2。175036)-甘肃省攻关课题fGs022A43138)

堂翥熊乎勰誉”T。eh成(07坩31剃)882呕284学院1F‘a冀黜甏蒜黔麓黑虢要罂l:兰黟6析化3-ne学和t中药现代化的教学及科研工作
万方数据
茶叶中多糖的分离及降血糖活性的研究
作者: 王元凤, 金征宇, WANG Yuan-feng, JIN Zheng-yu
作者单位: 江南大学食品学院,江苏,无锡,214036
刊名: 中草药
英文刊名: CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年,卷(期): 2005,36(10)
被引用次数: 12次

参考文献(13条)
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引证文献(15条)
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5.余志.石玉涛.倪德江 酶法修饰绿茶多糖对免疫低下模型小鼠免疫活性的影响[期刊论文]-茶叶科学 2010(z1)
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11.马森 大红袍茶降血糖作用研究[期刊论文]-安徽农业科学 2011(2)
12.余志.石玉涛.倪德江 酶法修饰绿茶多糖对免疫低下模型小鼠免疫活性的影响[期刊论文]-茶叶科学 2010(z1)
13.丁红秀.高荫榆.晁红娟.夏冬华 毛竹叶柄多糖降血糖作用研究[期刊论文]-食品科学 2007(12)
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