全 文 ：Vol. 31 No.3
Sep. 2013
第 31卷 第 3期
2013年 9月
经 济 林 研 究
Nonwood Forest Research
收稿日期：2013-08-13
基金项目：国家林业公益性行业科研专项“榉树优良种源选择及快速繁育技术研究”（200904011）；广西优良用材林资源培育重点实验室自
主课题“榉木种源遗传多样性及器官发生技术研究”（12B0301）；广西青年基金项目“榉树小尺度遗传结构：基于广西雅长自然保护区群
体的 SSR研究”（2013GXNSFBA019093）。
作者简介：张日清（1959—），男，湖南醴陵人。教授，博士，博士研究生导师，主要从事经济林栽培育种和林业生物技术应用等方面的教
学与科研工作。E-mail：hanszhangriqing@yahoo.com.cn。
榉树 Zelkova schneideriana属于榆科榉属，落
叶大乔木，国家二级保护植物，分布于我国淮河流域、
秦岭以南的长江中下游地区。榉树材质优良，是生
产各类高档家具和工艺品的上等木材，同时榉树也
是深受人们喜爱的传统色叶园林风景树种 [1-3]。
由于榉树用途广泛，现阶段已被过度采伐，
因此目前榉树资源非常紧缺。植物组培技术是对
植物进行繁育与保育的一种重要技术手段。特别
是利用芽器官的以芽繁芽技术是当前组培工厂化
育苗的常用技术手段，被广泛应用于桉树、香蕉
等苗木的大规模繁育 [4-5]。
榉树的芽器官繁殖技术，前人已经有了大量
的研究报告。金晓玲 [6-7]经研究发现，榉树组织诱
导和继代培养中，生根的最适培养基为WPM培养
榉树组培芽继代增殖的影响因素
张日清 1a，刘海龙 1a,2，汪灵丹 1a，金晓玲 1b
（1.中南林业科技大学 a.林学院；b.风景园林学院，湖南 长沙 410004；2.广西壮族自治区林业科学研究院，
广西 南宁 530002）
摘 要：为获得健壮的榉树组培继代芽，采用以芽繁芽的方式对榉树离体芽进行扩繁，研究不同因素对榉树无
菌芽继代增殖效果的影响。结果表明：BA对芽的增殖倍数有显著影响，木质化程度较高的腋芽丛生芽采用添加
BA 4.0 mg/L、KT 2.0 mg/L、NAA 0.5 mg/L的WPM培养基可获得较高的增殖率。为避免芽体愈伤化，木质化程
度较低的其它 3种来源的无菌芽在继代培养的前期，应在不添加 BA的培养基上培养。附加 2.0 g/L PVP的培养
基能有效抑制组培继代芽的褐化。
关键词：榉树；继代培养；增殖；褐化；愈伤化
中图分类号：S687 文献标志码：A 文章编号：1003—8981(2013)03—0054—05
Factors infl uencing multiplication of tissue culture shoots
in Zelkova schneideriana
ZHANG Ri-qing1a, LIU Hai-long1a,2, WANG Ling-dan1a, JIN Xiao-ling1b
(1.a. College of Forestry; b. College of Landscape Architecture, Central South University of Forestry & Technology,
Changsha 410004, Hunan, China; 2. Guangxi Zhuang Autonomous Region Forestry Research Institute, Nanning 530002,
Guangxi, China)
Abstract: To obtain robust subcultured shoots in Zelkova schneideriana, shoots in vitro were propagated by bud
proliferation, and the factors influencing shoots in vitro multiplication were studied. The results show that BA has a
significant effect on proliferation multiples of Z. schneideriana shoots. The highly lignified shoot can reach a high
proliferation coeffi cient in WPM supplemented with BA 4.0 mg/L, KT 2.0 mg/L and NAA 0.5 mg/L. To avoid bud callus
formation, the low lignifi ed shoots from other three sources should be cultured in medium without BA during the earlier
stage. The medium with 2.0 g/L PVP can effectively inhibit browning of subculture bud.
Key words: Zelkova schneideriana; subculture; multiplication; browning; callus formation
DOI:10.14067/j.cnki.1003-8981.2013.03.034
55第 31卷 经 济 林 研 究
基。实生苗幼嫩茎段在WPM＋ BA1.0 mg/L培养
基上直接形成丛生芽。汪灵丹等 [8]研究发现，榉
树最佳增殖培养基是WPM＋ 4.0 BA mg/L，最大
增殖系数为 15。
榉树组培继代增殖技术是榉树芽器官繁殖技
术的关键，得到大量健康的丛生芽是实现榉树组
培工厂化育苗的前提。笔者在前人研究的基础上，
研究影响榉树组培继代芽增殖效果及生长状况的
几种因子，以期获得更多更健壮的组培继代增殖
芽进入生根培养阶段。
1 材料与方法
1.1 试验材料
转入继代增殖培养的材料共有 4种来源。第
1种：以榉树幼嫩茎段为外植体，经过初代诱导腋
芽培养后，取试管腋芽丛生芽中的单个芽为试验
材料（见图 1）。第 2种：榉树幼嫩的顶芽经过消
毒后存活，从初代培养基转入继代增殖培养阶段（见
图 2）。第 3种：榉树幼嫩茎段，经过初代诱导腋
芽培养后，取试管腋芽单芽为试验材料（见图 3）。
第 4种：对榉树种子进行无菌播种，发芽后直接剪
取萌发芽转入继代增殖培养阶段 [9]（见图 4）。
图 1 试管腋芽丛生芽
Fig. 1 In vitro clustered shoots from axillary bud
图 2 幼嫩的顶芽
Fig. 2 A tender terminal bud
图 3 试管腋芽单芽
Fig. 3 A shoot in vitro from axillary bud
图 4 无菌播种的萌发芽
Fig. 4 A bud obtained through aseptic seeding
1.2 继代增殖培养的试验方案
1.2.1 基本培养基及植物激素对继代增殖效果的
影响
为了更准确详细地研究榉树继代培养的增殖
问题，采用 4因素 3水平 L9(34)正交设计方案进
行试验设计（见表 1）。取大小一致的无菌芽苗，
苗高约 1.0 cm，每组接种 10瓶，每瓶接种 1株，
每个处理重复 2次。基本培养基设置 3个水平：
A1（MS）、A2（WPM）、A3（改良MS）。NAA
设置 3个水平：B1（0 mg/L）、B2（0.5 mg/L）、
B3（1.0 mg/L）。KT设置 3个水平：C1（0 mg/L）、
C2（1.0 mg/L）、C3（2.0 mg/L）。BA设置 3个水平：
D1（0 mg/L）、D2（1.0 mg/L）、D3（4.0 mg/L）。
1.2.2 抗氧化剂和吸附剂抑制褐化的效果
对比活性炭（AC）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、
抗坏血酸（Vc）三者在榉树继代增殖培养过程中
56 第 3期张日清，等：榉树组培芽继代增殖的影响因素
的抗褐化能力的强弱以及对生长的影响。AC 2.0
g/L，PVP 2.0 g/L，Vc 15 mg/L，每个处理 15瓶，
留 15瓶作为空白对照。培养基选用WPM＋ BA
1.0 mg/L，培养基中添加琼脂 4.0 g/L，蔗糖 30 g/L，
pH值调至 5.8。
1.2.3 材料来源对继代增殖效果的影响
针对榉树继代增殖培养过程中，芽体愈伤化
现象严重这一问题，对比 4种来源材料的愈伤产
生情况，研究不同材料的适宜增殖方法。
2　结果与分析
2.1 基本培养基及植物激素对继代芽增殖效果的
影响
将第 1种来源的材料，即诱导萌发的腋芽丛生
芽，自基部切离，接种到继代培养基上，每处理接
种 10瓶，每瓶接种 1株，每处理重复 2次。培养
35 d后，调查统计芽增殖及生长情况，结果见表 2。
采用直观分析法，对芽增殖倍数这个指标进
行分析。影响增殖倍数的指标从主到次为：BA
（极差 3.90）、KT（极差 1.10）、NAA（极差
0.67）、基本培养基（极差 0.63）。方差分析结
果显示：4个因素中因素 D（BA）达到显著水平
（F＝ 32.819＞ F0.05＝ 19.000）。均值（k）表明，
最优组合为 A2B2C3D3，即WPM＋ NAA 0.5 mg/L
＋ KT 2.0 mg/L＋ BA 4.0 mg/L培养基，但本试验
中不含该组合，因为正交试验是一种均一性试验
设计，不可能含所有处理组合 [10-11]。但根据表 1仍
可选出较好的处理组合 A1B3C3D3，即MS＋ NAA
1.0 mg/L＋ KT2.0 mg/L＋ BA 4.0 mg/L，也可达
较好的增殖效果，增殖率为 5.5。
采用直观分析法，对芽长这个指标进行分
析。影响芽长的指标从主到次为：NAA（极差
0.867）、KT（极差 0.733）、基本培养基（极差
0.466）、BA（极差 0.400）。方差分析结果显示：
4个因素均未达到显著水平。均值（k）表明，最
优组合为 A2B3C3D1，即WPM＋ NAA 1.0 mg/L＋
KT 2.0 mg/L培养基，榉树继代芽可以达到较好的
抽长效果。
2.2　抗氧化剂和吸附剂抑制褐化的效果
在培养基中加入抗氧化剂或活性炭，对防止
某些植物培养物的褐变具有一定的效果。3种抗氧
化剂和吸附剂抑制继代芽褐变的效果见表 3。结果
表明，2.0 g/L PVP具有良好的抑制继代芽褐变的
作用，加入该物质后，继代芽几乎无褐化现象发生。
即使偶尔出现少量褐化，也只发生在叶片，对芽
体生长无明显损害。15 mg/L Vc对继代芽褐化无
明显抑制作用。而添加 2.0 g/L AC，也对继代芽的
褐化无抑制作用（见图 5），芽体在添加活性炭的
培养基中褐化，继代芽在添加活性炭的培养基中
前期生长健康，叶片颜色转为深绿色，但培养 15 d
后继代芽会出现明显玻璃化的现象（见图 6）。
表 1　 继代增殖试验设计方案L9(34)
Table 1 The orthogonal test L9(34) plan of multiplication
of subculture buds mg·L-1
处理号
Treatment No.
基本培养基
Basic medium（A）
NAA
（B）
KT
（C）
BA
（D）
1 MS 0 0 0
2 MS 0.5 1.0 1.0
3 MS 1.0 2.0 4.0
4 WPM 0 1.0 4.0
5 WPM 0.5 2.0 0
6 WPM 1.0 0 1.0
7 改良MS 0 2.0 1.0
8 改良MS 0.5 0 4.0
9 改良MS 1.0 1.0 0
表 3 抗氧化剂和吸附剂的防褐化效果†
Table 3 Inhibition effect of antioxidants or adsorbents on browning
抗氧化剂或吸附剂
Antioxidants or dsorbents
质量浓度
Mass concentration
接种总数
Number of inoculated buds /个
褐化数
Number of browning buds /个
褐化率
Browning rate /%
褐化度
Browning degree
PVP 2.0 g/L 15 1 6.7 ＋
AC 2.0 g/L 15 15 100.0 ＋＋＋
Vc 15 mg/L 15 14 93.3 ＋＋
† “＋”为轻微褐化，“＋＋”为中度褐化，“＋＋＋”为严重褐化。褐变度的调查以同一处理绝大部分接种材料的表现来界定 [10]。
“+” stands for slight browning, “++” stands for medium brown, and “+++” stands for serious browning. Browning degree of the buds was defi ned
according to performance of most materials investigated[10].
表 2　培养35 d时芽平均增殖倍数和芽长
Table 2 Bud proliferation coefficient and length after 35 days
处理号
Treatment No.
芽增殖倍数
Proliferation coeffi cient
芽长
Bud length /cm
1 0 0
2 3.5 1.2
3 5.5 2.0
4 5.3 1.3
5 2.4 1.7
6 3.2 1.6
7 3.7 1.4
8 5.1 1.3
9 1.8 1.7
57第 31卷 经 济 林 研 究
2.3 材料来源对继代芽增殖效果的影响
第 1种来源的材料（即试管腋芽丛生芽），
由于在初代培养时能吸收来自母株茎段的大量营
养，因此生长健壮，木质化程度较高。这类材料
可使用WPM＋ NAA 0.5 mg/L＋ KT 2.0 mg/L＋
BA 4.0 mg/L培养基，获得高的增殖系数。
第 2种来源的材料（即幼嫩的顶芽），该材
料直接来自母株，大多数顶芽由于过于细嫩，在
消毒时易被杀死，因此得到这类芽的几率较小，
这类芽在添加 BA的培养基上极易出现愈伤化，愈
伤化能导致整个芽体被包埋而死亡（见图 7）。因
而，这类芽不适宜在添加 BA的培养基上培养，使
用 KT代替 BA，虽然增殖系数降低，但避免了愈
伤化现象的发生，保证了继代芽的健康生长。
第 3种来源的材料（即试管腋芽单芽）和第 4
种来源的材料（即无菌播种的萌发芽）同第2种材料，
芽较细弱，使用 KT代替 BA，能取得较好的继代
培养效果，芽健壮（见图 8）。第 2种、第 3种和
第 4种来源的材料经过数代继代增殖培养后，芽体
木质化程度逐渐增强，可转入添加 BA的培养基中。
图 5 芽体褐化
Fig. 5 Bud browning
图 6 芽体玻璃化
Fig. 6 Bud vitrifi cation
图 7 顶芽愈伤化
Fig. 7 Terminal bud with callus formation
图 8 无菌播种的萌发芽产生增殖芽
Fig. 8 Prolifi ration bud from plantlet after aseptic seeding
3　结论与讨论
活性炭是吸附性较强的无机吸附剂，但它并
没有选择性，在吸附酚类物质的同时，也把培养
基中的营养物质吸附掉，短时间内对培养物没有
影响，时间长了外植体就因缺少营养而枯死 [12]。
前人分析凡是能够钝化多酚氧化酶（PPO）、过氧
化物酶（POD）等酶系统活性的抗氧化剂，理论
上都具有阻碍或防止外植体褐变的作用 [13]。但某
些抗氧化剂（如 Vc）不耐高温。而 PVP是酚类物
质的专一吸附剂 [14-15]，且耐高温，选择 PVP作为
防止褐变物质从理论上是可行的。本试验中选用了
PVP控制榉树组培继代芽褐变，取得了显著效果。
前人已经对榉树组培做过大量研究。但大多
数研究者并没有提到愈伤化的现象。笔者通过研
究发现，榉树组培继代增殖过程中的愈伤化严重
危害榉树组培继代芽的健康生长。KT可以在前几
代继代培养过程中暂时替代 BA，不产生愈伤的同
时，取得一定的增殖效果。但其作用并不稳定，即
58 第 3期张日清，等：榉树组培芽继代增殖的影响因素
有时可以取得 3倍甚至 4倍的增殖效果，有时又不
发生增殖。因而KT的增殖效果在稳定性上较BA差，
在后期继代培养过程中 KT不能完全代替 BA。
观察发现：木质化程度高的继代芽在继代增
殖过程中不易产生愈伤。因此通过各种途径提高
组培继代芽的木质化程度至关重要。基本培养基、
光照、温度、琼脂等都是优化的对象，如果能迅
速提高组培继代芽的木质化程度，则能避免愈伤
的产生，从而大幅度提高榉树继代增殖的效率。
后续的研究中发现，用 IBA替代 NAA或者直
接去掉培养基中的生长素，可以减缓愈伤组织的
产生，而对榉树组培继代培养的增殖倍数等重要
参数不产生明显影响。因而后期的继代增殖培养
基中只采用 BA和 KT的组合作为生长调节物质。
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[本文编校：闻 丽 ]