全 文 ：No.7.2008
纤维素酶对黑大豆和葛根异黄酮
糖苷不同组分的水解活性
李 丹 1,2,李晓磊 1*,谭 克 1
(1.长春大学吉林省农产品加工生物技术重点实验室,长春 130022;
2.国家大豆深加工技术研究推广中心,长春 130022)
摘要:异黄酮主要以糖苷的分子形式存在于黑大豆和葛根中,但是其具有生物活性的部分主要是苷元。
为了建立一种体外生物转化异黄酮糖苷为异黄酮苷元的新方法,采用70%乙醇提取黑大豆和葛根异黄
酮,用高效液相色谱分析了纤维素酶水解前后两粗提物的异黄酮组成。结果表明:纤维素酶对于不同种
类的异黄酮糖苷具有不同的水解专一性、基团专一性和键专一性,能完全水解大豆苷和染料木苷为大豆
素和染料木素,而不能水解丙二酰基染料木苷、丙二酰基大豆苷和葛根素。
关键词:异黄酮;黑大豆;葛根;纤维素酶.
中图分类号:TS21 文献标志码:A 文章编号:1005-9989(2008)07-0026-04
Specifichydrolysisofisoflavoneglycosidesof
blacksoybeanandkudzuusingcelulase
LIDan1,2,LIXiao-lei1*,TANKe1
(1.JinlinKeyLabofBiotechnologyforAgriculturalProductsProcessingin
ChangchunUniversity,Changchun130022;
2.NationalR&DCenterforSoybeanProcessingTechnology,Changchun130022)
Abstract:Isoflavonesoccuredinblacksoybeanandkudzuaremainlyasglycosides.However,theirbioactivities
lieintheaglycones.Celulasewasusedtoconvertisoflavoneglycosidesextractedfromblacksoybeanandkudzu
with70% ethanolintotheaglyconesinthisstudy.Thecompositionsofisoflavoneextractbeforeandafter
celulasetreatmentwereanalyzedbyHPLC.Theresultsshowedthatdaidzinandgenistincouldbecompletely
hydrolyzedintodaidzeinandgenisteinbycelulase.Butthehydrolysisofmalonyldaidzin,malonylgenistinand
puerarincouldnotbefound.
Keywords:isoflavone;blacksoybean;kudzu;celulase
异黄酮是一种天然植物雌激素,能够缓解妇女
更年期综合症。现代医学已经证实,增加大豆异黄
酮的摄入量,可以有效地降低乳腺癌和前列腺癌的
发生率,改善骨质疏松,预防心脑血管疾病[1]。
黑大豆和葛根是两种经济价值较高的作物,在
世界一些地区被广泛栽培和利用。异黄酮类化合物
是黑大豆和葛根中主要的生物活性成分,可以作为
功能性食品或膳食补充剂[2],目前已经有工业化产品
开发。
异黄酮虽然具有多种分子结构形式,但生物活
性主要在于其苷元部分。近年来,有关异黄酮生理
功能的许多研究都是直接以异黄酮苷元作为测试原
料的。已有的研究也表明,黑大豆和葛根中的异黄
酮也主要以糖苷形式存在。所以,采用体外制备苷
收稿日期:2007-12-31 *通讯作者
基金项目:国家科技成果重点推广计划项目 (2003EC000127);吉林省科技发展计划项目(20050125)。
作者简介:李丹(1972—),男,内蒙古赤峰人,副教授,主要从事生物技术和功能性食品的研究工作。
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DOI:10.13684/j.cnki.spkj.2008.07.005
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元形式的异黄酮,是提高生物利用度的有效方法[3]。
异黄酮糖苷在一定的酸性或碱性条件下,糖苷
键可被水解断裂[4],分解为异黄酮苷元和葡萄糖,但
碱性条件水解所得异黄酮苷元很不稳定,容易降解;
酸解法对设备的防腐蚀性要求较高,而且治污成本
也高。而采用微生物对异黄酮糖苷的水解,主要是
发酵豆制品的生产[5]。
酶水解法条件温和,异黄酮苷元不易变性,是
目前比较有前景的方法。陈莲等[6]采用β-葡萄糖苷酶
(β-glucosidase,Sigma-AldrichCorporate)水解脱脂大
豆粕中的异黄酮,从而增加了豆粕中染料木素含量。
XIEL等[7]将双葡萄糖苷酶(diglycosidase,AmanoEnz-
ymeInc.)加入大豆粕或大豆提取物中,证实几乎所有
的大豆苷和染料木苷糖苷形式的异黄酮都被转化为
相应苷元形式的异黄酮。但是由于 β-葡萄糖苷酶和
双葡萄糖苷酶工业化产品较少,目前用于制备异黄
酮苷元的成本较高。
本研究采用较为温和的提取和浓缩方法,从黑
大豆和葛根中得到两种糖苷型异黄酮粗提物。利用
较为廉价纤维素酶的 β-葡萄糖苷键外切酶活性,测
试了其对几种糖苷的水解效果,以明确纤维素酶的
专一性水解作用,建立一种体外生物酶法转化异黄
酮糖苷为苷元的新方法。
1 材料与方法
1.1 材料
裕昌黑大豆:吉林省长春欧亚集团股份有限公
司;野生葛根粉:湖北省十堰竹山武当山珍葛根开
发有限公司。
纤维素酶(酶活力15kU/g):江苏省无锡市雪梅酶
制剂科技有限公司;染料木苷(genistin)标准品:美国密
苏里州圣路易斯 Sigma-Aldrich公司;甲醇:色谱纯
试剂,美国马萨诸塞州沃尔瑟姆热电飞世尔科学有
限公司;二次蒸馏水为自制;其他均为国产分析纯
试剂。
1.2 样品的制备
采用小型万能粉碎机河北黄骅(齐家务科学仪器
厂)将收获成熟的整粒黑大豆磨成粗粉。分别取 100
g黑大豆和葛根粉,各加入1000mL70%(v/v)的乙醇,
在室温下搅拌提取 12h后,用滤纸过滤。将得到滤
液采用旋转蒸发仪(RE-52A型,上海亚荣生化仪器厂)
在 85℃、真空度 0.08MPa的条件下,浓缩去除乙
醇,再以 0.45μm孔径的微孔滤膜(聚四氟乙烯,浙
江海宁丰源过滤设备有限公司)过滤,所得滤液用于
酶解反应底物和高效液相色谱分析。
1.3 酶促反应
将固体纤维素酶溶解于pH5.050mmol/L的Tris-
HCl缓冲液,配制成 0.045U/mL的酶溶液。取 0.4
mL加入到 0.4mL异黄酮溶液中,充分混合,于 50
℃反应30min后,用0.45μm孔径的微孔滤膜过滤,
立即测定反应液体的异黄酮含量。
1.4 异黄酮含量的测定
采用高效液相色谱仪(DionexSummitHPLC,美
国戴安公司)测定酶解前后的异黄酮组分[8]。色谱条件
为:紫外检测器波长 254nm;色谱柱,WatersNova-
PakC18(4μm,150mm×3.9mm,美国沃特世公司);
流动相,A:甲醇/水/甲酸(20/80/0.1);B:甲醇/水/甲
酸(80/20/0.1);洗脱梯度0min,100%A;0~30min内,
B由 0线性增加到 100%,流速 0.8mL/min;柱温 25
℃;进样体积 10μL。所有样品均用 0.45μm孔径
的微孔滤膜过滤后,上机进样。采用液质联用定性
样品色谱图中所有异黄酮组分峰,采用染料木苷摩
尔数与峰面积标准曲线定量各组分的浓度。
1.5 数据统计分析
采用 MicrosoftExcel2003软件进行数据分析,
异黄酮含量表示为3次重复实验结果的平均值加减标
准误差。
2 结果与讨论
2.1 黑大豆和葛根提取物中的异黄酮成分
目前已发现12种大豆异黄酮[9],包括3种苷元结
构:染料木素(genistein,金雀异黄素、三羟异黄酮)、
大豆黄素(daidzein,二羟异黄酮、黄豆苷元)、黄豆黄
素(glicitein);其余为糖苷结构:有 3种葡萄糖苷,3
种丙二酰基葡萄糖苷,3种乙酰基葡萄糖苷。后二种
结构不稳定,在高温、酸碱和溶剂的作用下,易失去
乙酰或丙二酰基,而转变为结构相对稳定的葡萄糖
苷类异黄酮。也有人认为,天然大豆异黄酮糖苷仅包
括丙二酰基葡萄糖苷和葡萄糖苷这两种形式,而没
有乙酰基葡萄糖苷类型的异黄酮。在提取异黄酮的
过程中,一些提取条件会使葡萄糖苷类型的异黄酮
发生降解,而产生天然大豆中本身并不存在的乙酰
基葡萄糖苷类型的异黄酮[10]。
本研究为了测试纤维素酶对几种异黄酮糖苷的
水解作用,对原料采用 70%乙醇室温搅拌提取,小
于85℃的温度浓缩,以尽量不破坏几种天然存在的
异黄酮糖苷。
图 1的结果表明:本实验所得到的黑大豆异黄
酮提取物中,异黄酮主要以糖苷的形式存在,染料木
苷和大豆苷是含量最多的组分,其次为丙二酰基染
料木苷和丙二酰基大豆苷。各组分的浓度计算结果
见表1。
图 2的结果表明:本实验所得到的葛根异黄酮
提取物中,主要成分是葛根素,除此以外还检测到少
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图2 葛根提取物异黄酮高效液相色谱图
注:7.196min,葛根素;8.736min,大豆苷;11.085min,染
料木苷;16.641min,大豆素。
图1 黑大豆提取物异黄酮高效液相色谱图
注:8.707min,大豆苷;11.078min,染料木苷;13.122min,
丙二酰基大豆苷;15.098min,丙二酰基染料木苷。
min
表2 纤维素酶水解前后葛根提取物中异黄酮的变化
种类 酶解前/(μmol/L) 酶解后/(μmol/L)
葛根素 463.7141±10.8291 447.2779±5.8174
大豆苷 66.6003±2.1493 -
染料木苷 15.9506±0.4186 -
大豆素 29.2860±2.1344 120.1537±6.1093
总量 575.5511±7.5672 567.4316±10.6337
表1 纤维素酶水解前后黑大豆提取物中异黄酮的变化
种类 酶解前/(μmol/L) 酶解后/(μmol/L)
大豆苷 476.0417±11.6692 -
染料木苷 397.4749±6.3886 -
丙二酰基大豆苷 124.5565±3.7337 121.6485±6.1941
丙二酰基染料木苷 176.2807±18.9428195.0726±24.6464
大豆素 - 348.1381±7.6213
染料木素 - 262.0309±4.6465
总量 1174.3538±20.8761926.8901±27.3680
注:*values=(means±SD)(n=3)。
量的大豆苷、染料木苷和大豆素。各组分的浓度计算
结果见表2。
2.2 纤维素酶对不同种类大豆异黄酮糖苷的水解
效果
纤维素酶(celulase)是指能水解纤维素β-1,4葡萄
糖苷键,使纤维素变成纤维二糖和葡萄糖的一组酶总
称,它不是单一酶,而是起协同作用多组分酶系。
纤维素酶由葡聚糖内切酶(EC3.2.1.4,也称 Cx酶)、
葡聚糖外切酶(EC3.2.1.91,也称C1酶)、β-葡萄糖苷
酶(EC2.1.21,也称CB酶或纤维二糖酶)3个主要成分
组成的诱导型复合酶系[11]。C1酶和Cx酶主要溶解纤
维素,CB酶主要将纤维二糖、纤维三糖转化为葡萄
糖,当3个主要成分的活性比例适当时,就能协同作
用完成对纤维素降解。
黑大豆异黄酮糖苷分子中,葡萄糖残基和丙二
酰葡萄糖残基是以β-1,7(C-O-C)糖苷键与苷元相联的。
对比图1,在图3中大豆苷和染料木苷的色谱峰完全
消失,大豆素和染料木素的色谱峰明显提高了,而丙
二酰基染料木苷和丙二酰基大豆苷的色谱峰几乎没
有发生变化。表明纤维素酶可以将大豆苷和染料木苷
分子中与葡萄糖残基相联的 β-1,7糖苷键完全水解,
从而使之转变为大豆素和染料木素。而对于丙二酰
基染料木苷和丙二酰基大豆苷,由于葡萄糖残基的
第 6位碳上的羟基被丙二酰基所修饰,所以纤维素
酶不能水解这种 β-1,7糖苷键,表现出酶的基团水
解专一性。
表 1为黑大豆异黄酮水解前后含量的具体计算
图3 纤维素酶水解后黑大豆提取物异黄酮高效液相色谱图
注:13.231min,丙二酰基大豆苷;15.196min,丙二酰基染料木苷;16.692min,大豆素;19.083min,染料木素。
注:*values=(means±SD)(n=3)。
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根异黄酮糖苷的水解机制。本研究结果表明:对于含
有β-1,7(C-O-C)糖苷键的异黄酮,当葡萄糖的第6位
碳的羟基氢(R3=H)未被取代的情况下,纤维素酶可以
水解异黄酮糖苷,而生成葡萄糖和苷元大豆素或染料
木素;而当葡萄糖的第 6位碳的羟基氢被丙二酰基
(R3=COCH2COOH)取代的情况下,纤维素酶不能水解
被修饰葡萄糖残基还原端所形成的β糖苷键。说明纤
维素酶能够识别 β-葡萄糖苷键还原端葡萄糖残基的
第 6位碳的羟基,其 β-葡萄糖苷酶活性能否发挥取
决于糖苷葡萄糖残基是否被修饰。对于含有β-1,8(C-
C)糖苷键的葛根异黄酮,纤维素酶不具有打开这类化
学键的能力,所以不能水解下葡萄糖残基。
3 结论
纤维素酶的 β-葡萄糖苷键外切酶活性能够水解
大豆苷和染料木苷葡萄糖残基所形成的 β-1,7(C-O-
C)糖苷键,生成大豆素和染料木素。纤维素酶不能水
解丙二酰基染料木苷和丙二酰基大豆苷分子中被丙二
酰基所修饰的葡萄糖残基还原端所形成的 β-1,7
(C-O-C)糖苷键,表现出基团专一性。纤维素酶也不能
水解葛根素的β-1,8(C-C)糖苷键,表现出键的专一性。
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图5 纤维素酶对黑大豆和葛根异黄酮糖苷的专一性水解作用
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A
u
结果。丙二酰基染料木苷和丙二酰基大豆苷的浓度
在酶解前后虽然略有变化,但基本在误差范围内。由
于异黄酮苷元的水溶性比相应的苷还要小,会在酶
解以后的样品过滤步骤损失,这可能是异黄酮总浓
度略有下降的原因。
葛根异黄酮糖苷分子中,含量最多的葛根素上
的葡萄糖残基是以 β-1,8(C-C)糖苷键与苷元相联的。
对比图2,在图4中大豆苷和染料木苷的色谱峰完全
消失,大豆素的色谱峰明显提高了,而葛根素的色谱
峰几乎没有发生变化。染料木素的溶解度小,产生量
比较少,在本实验的条件下,在色谱图中没有出现明
显的峰。
表 2为葛根异黄酮水解前后含量的具体计算结
果。葛根素的浓度在酶解前后虽然略有变化,但也基
本在误差范围内。
图 5说明了纤维素酶对黑大豆异黄酮糖苷和葛
图4 纤维素酶水解后葛根提取物异黄酮高效液相色谱图
注:7.263min,葛根素;16.692min,大豆素。
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糖苷酶的特性与应用
马歌丽,魏泉增
(郑州轻工业学院食品与生物工程学院,郑州 450002)
摘要:介绍了糖苷酶的作用机制,综述了糖苷水解酶在催化寡糖合成、烷基糖苷和芳香醇合成以及
生物大分子糖基化中的应用,还介绍糖苷酶的生物法制备。
关键词:糖苷水解酶;糖苷合成酶;应用
中图分类号:Q556.2;TS032 文献标志码:B 文章编号:1005-9989(2008)07-0030-04
Thecharacteristicandapplicationofglycosidase
MAGe-li,WEIQuan-zeng
(ColegeofFoodandBiologyEngineering,ZhengzhouInstituteofLightIndustry,
Zhengzhou,450002)
Abstract:Inthisrevive,theprincipiumoftheglycosidaswasintroducedandtheapplicationoftheglycoside
wassummarizedinenzymaticglycosylationofoligosaccharides,aryloralkylalcoholsandbiomacromolecules.
Furthermore,thebiologicalpreparationofglocosidasewasreviwed.
Keywords:glycosylhydrolase;glycosynthases;application
糖苷酶(Glycosidase)又称为糖基水解酶,是一大
类催化糖苷键水解的酶,这种酶在酸存在的条件下,
能催化由半缩醛羟基与醇羟基反应而形成的糖苷键
的断裂。在国际酶学命名方法中,糖苷酶归位序号
为EC3.2.1。目前已知的糖苷酶有2500多种,根据序
列相似性可以分为 100多个族。由于它们是真正意
义上的水解酶,因而不需要任何辅酶或辅因子。糖
苷酶在催化糖苷反应时,如果水分子的氧原子进攻
受体葡萄糖上的异头碳,即发生水解反应,但如果
是葡萄糖羟基上的氧原子进攻受体葡萄糖上的异头
碳,即发生转糖基反应。
由于糖苷酶有转糖基活性,因而可用于糖苷类
化合物的合成。随着分子生物学的发展,人们发现寡
糖在很多重要的生理过程中起着重要作用,像表面抗
原的识别、生物信号的传导等[1]。有文献[2]称某些寡糖
多聚体对乳腺癌和前列腺癌有明显的抑制作用,某些
抗癌药物的活性也与糖基有关,9种疾病(都是常
染色体隐性遗传病)与糖基化有关。目前获得糖苷化
收稿日期:2007-11-07
作者简介:马歌丽(1963—),女,河南漯河人,硕士,副教授,主要从事食品与生物工程的研究工作。
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