全 文 ：网络出版时间:2011 － 10 － 25 12:16 网络出版地址:http:/ /www． cnki． net /kcms /detail /34． 1086． R． 20111025． 1216． 020． html
接骨木多糖对大鼠胰岛细胞增殖及胰岛素分泌的影响
宋琳亮，傅江南
(暨南大学医学院，广东 广州 510632)
doi:10． 3969 / j． issn． 1001 － 1978． 2011． 11． 028
文献标识码:A 文章编号:1001 － 1978(2011)11 － 1593 － 04
中国图书分类号:R-332;R284. 1;R322. 57;R347. 8;R587. 022
摘要:目的 探讨接骨木多糖对体外培养大鼠胰岛 β细胞株
INS-1E细胞增殖和胰岛素分泌的影响。方法 采用 CCK-8
方法检测接骨木多糖对大鼠胰岛细胞活性影响以及对四氧
嘧啶损伤后细胞活性的影响;采用 ELISA法检测接骨木多糖
联合四氧嘧啶对大鼠胰岛细胞分泌胰岛素功能的影响。结
果 接骨木多糖可以明显促进大鼠胰岛细胞增殖(P ＜
0. 05) ，并降低四氧嘧啶诱导的大鼠胰岛细胞损伤(P ＜
0. 05)、增加胰岛素分泌(P ＜ 0. 05)。结论 接骨木多糖对
四氧嘧啶诱导的大鼠胰岛细胞损伤具有保护作用。
关键词:接骨木;多糖;细胞增殖;胰岛素;分泌;大鼠
收稿日期:2011 － 06 － 22，修回日期:2011 － 07 － 25
基金项目:广东省科技计划资助项目(No 2009B011300011)
作者简介:宋琳亮(1979 －) ，女，博士，讲师，研究方向:生物大分子
结构与功能，通讯作者，E-mail:linliangsong@ 163． com
忍冬科接骨木属 Sambucus Linn． 植物约 20 余
种，多个国家都有将该属植物用作草药的记载［1 － 2］，
疗效包括抗癌［3］、消炎［4］、利尿［5］及促进骨折愈
合［6］等等。接骨木多糖(Sambucus polysaccharides，
SP)是从接骨木茎中分离提取的活性成分，动物实
验结果表明，接骨木多糖对于链脲菌素致糖尿病大
鼠模型具有明显的降糖作用，同时血浆内高密度脂
蛋白水平明显升高［7］。本研究将进一步采用体外
培养研究接骨木多糖对胰岛细胞活性的影响及对四
氧嘧啶致胰岛细胞损伤的作用，以及接骨木多糖对
胰岛细胞分泌胰岛素功能的影响进行研究。
1 材料与方法
1． 1 细胞 INS-1E细胞由暨南大学实验动物管理
中心馈赠。
1． 2 主要试剂和仪器 RPMI 1640、DMEM 培养基
均购自 Gibco BRL 公司;新生牛血清购自 Hyclone
公司;CCK-8 细胞计数试剂盒购自日本 Dojindo;大
鼠胰岛素检测试剂盒购自 Mercodia 公司;其他试剂
均购自 Sigma。Bio-Tek ELX 800 酶标仪(美国) ;
REVCO CO2 培养箱(美国)。
1． 3 接骨木多糖的制备 接骨木多糖提取自接骨
木茎，提取流程简述为接骨木茎粉碎烘干—乙醚脱
脂—热水浸提—抽滤—乙醇沉淀—离心分离—水溶
解—脱蛋白脱色—旋转蒸发浓缩—DEAE Sepharose
Fast Flow 层析—穿过液冻干。
1． 4 胰岛细胞的培养 INS-1E 细胞在 RPMI 1640
培养液、5% 的 CO2 培养箱中培养，培养液中包含 1
mmol·L －1丙酮酸钠、5. 6 mmol·L －1萄萄糖、10%
胎牛血清(FBS)、10 mmol·L －1 HEPES、2 mmol·
L －1 L-谷氨酰胺、50 μmol·L －1 β-巯基乙醇、100 U
·ml －1青霉素和 100 mg·L －1链霉素。接种密度为
6 × 108·L －1，每 2 天更换 1 次培养基。
1． 5 胰岛细胞活性检测 培养液中接骨木多糖浓
度分别为 50、100、200、400、800 mg·L －1，在培养箱
内培养，每天检测细胞活性，持续 5 d。每孔加入 10
μl CCK-8 试剂，置细胞培养箱继续培养 4 h 后取出，
用酶标仪测定 450 nm吸光度，参比波长 530 nm。
细胞存活率 /% = (实验组 OD值 / 对照组 OD值) × 100%
1． 6 接骨木多糖对四氧嘧啶致胰岛细胞损伤的影
响 将细胞分为阴性对照组、四氧嘧啶组和多糖组，
培养 48 h 后，多糖组分别加入不同浓度的多糖溶
液，使其终浓度分别为 50、100、200、400、800 mg·
L －1，继续培养 4 h，四氧嘧啶组和多糖组分别加入四
氧嘧啶溶液，使其终浓度为 4 mmol·L －1，细胞继续
培养 20 h，然后如上检测细胞活性。
1． 7 接骨木多糖对胰岛细胞的促胰岛素分泌作用
对细胞进行分组:① 5. 6 mol·L －1葡萄糖 ± 多
糖;② 16. 7 mol·L －1葡萄糖 ± 多糖;③ 4 mmol·
L －1四氧嘧啶 + 2. 7 mol·L －1葡萄糖 ± 多糖;④ 4
mmol·L －1四氧嘧啶 + 16. 7 mol·L －1葡萄糖 ± 多
糖;多糖溶液浓度分别为 0、50、100、200、400、800 mg
·L －1。培养 24 h 后，用 Krebs-Ringer碳酸盐缓冲液
(KRBB:129 mmol·L －1 NaCl、4. 8 mmol·L －1 KCl、
1. 2 mmol·L －1 MgSO4、1. 2 mmol·L
－1 KH2PO4、2. 5
mmol· L －1 CaCl2、5 mmol· L
－1 NaHCO3、0. 1%
BSA和 10 mmol·L －1 HEPES，pH 7. 4)洗涤细胞，随
·3951·中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2011 Nov;27(11) :1593 ～ 6
后在 KRBB缓冲液中加入葡萄糖、丙酮酸钠或氯化
钾培养 30 min。收集上清液，于 － 20℃冻存。
再用 Hanks液洗涤 3 次，加入裂解液裂解细胞
(50 mmol·L －1 HEPES、0. 1% (V /V)Triton X-100、
1 mmol·L －1 PMSF、10 mmol·L －1 E-64、10 mmol·
L －1 pepstatin A、10 mmol·L －1 TLCK、100 mmol·
L －1 leueptin，pH 8. 0) ，收集，于 － 20℃冻存。用酶联
免疫试剂盒(Mercodia AB Sweden)450 nm检测胰岛
素浓度。
1． 8 统计学分析 文中进行数据统计的试验数据
重复均为 6 次。试验数据以 珋x ± s 表示。SPSS10. 0
软件进行统计分析，one-way ANOVA 和邓肯氏新复
极差检验进行组间数据的多重比较。
2 结果
2． 1 接骨木多糖对胰岛细胞活性的影响 检测接
骨木多糖处理后大鼠胰岛细胞增殖活性，结果发现
(Fig 1) ，在试验浓度范围(50 ～ 800 mg·L －1)内，处
理组细胞增殖率明显高于对照组(P ＜ 0. 05)。从接
骨木多糖处理后 d 1 ～ 5，100 mg·L －1浓度对大鼠胰
岛细胞增殖的促进作用最强，之后随着浓度增加，促
进作用减弱。
Fig 1 Effects of Sambucus polysaccharides treatment in different
concentrations on the cell viability in 5 days
* P ＜ 0. 05 vs control
2． 2 接骨木多糖对四氧嘧啶致胰岛细胞损伤的影
响 不同浓度接骨木多糖处理 4 h 后，在细胞培养
液中加入 4 mmol·L －1四氧嘧啶，诱导胰岛细胞损
伤。四氧嘧啶作用 20 h 后，用 CCK-8 法检测细胞活
性。如 Fig 2 所示，结果发现，与四氧嘧啶单独处理
组相比，不同浓度(50 ～ 800 mg·L －1)接骨木多糖
处理组都表现出了较高的细胞活性，其中 100、200
和 400 mg·L －1处理组的细胞活性明显高于四氧嘧
啶组(P ＜ 0. 05) ，随着处理浓度增加，细胞活性增
加，200 mg·L －1接骨木多糖浓度下的细胞活性最
高，之后随着处理浓度增加细胞活性降低。
Fig 2 Effects of Sambucus polysaccharides treatment in different
concentrations on the cell viability induced damage with alloxan
* P ＜ 0. 05 vs control;#P ＜ 0. 05 vs alloxan
2． 3 接骨木多糖对胰岛细胞促胰岛素分泌作用的
影响 在处理组培养液中加入不同浓度的接骨木多
糖，培养 24 h后，再分别用低浓度葡萄糖和高浓度
葡萄糖刺激大鼠胰岛细胞分泌胰岛素，检测胰岛素
浓度。结果发现在 5. 6 mmol·L －1低糖条件下，与
对照组相比 50 mg·L －1接骨木多糖对胰岛素分泌
没有明显影响，而其它 4 个浓度(100、200、400、800
mg·L －1)处理都明显降低了胰岛素释放量。而在
16. 7 mmol·L －1高糖条件下，50 mg·L －1接骨木多
糖对胰岛素分泌没有明显影响，但其它 4 个浓度
(100，200，400，800 mg·L －1)处理都明显增加了胰
岛素释放量，200 mg·L －1和 400 mg·L －1两个处理
组胰岛素释放最高(Tab 1)。
Tab 1 Influence of Sambucus polysaccharides
on insulin secretion in INS-1E cells(珋x ± s，n = 6)
Group
Dose /
mg·L －1
Insulin secretion at different concentration
glucose /mU·g － 1 Pro
5． 6 mmol·L －1 glucose 16． 7 mmol·L －1 glucose
Control 12． 49 ± 0． 38 50． 63 ± 2． 35
SP 50 12． 59 ± 0． 31 51． 55 ± 2． 49
100 11． 95 ± 0． 36* 59． 01 ± 2． 95*
200 10． 88 ± 0． 41* 67． 99 ± 2． 09*
400 11． 16 ± 0． 29* 66． 31 ± 4． 03*
800 11． 04 ± 0． 14* 60． 78 ± 2． 88*
* P ＜ 0. 05 vs contorl
·4951· 中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2011 Nov;27(11)
Tab 2 Influence of Sambucus polysaccharides on
insulin secretion in alloxan damaged INS-1E cells(珋x ± s，n = 6)
Group
Insulin secretion at different
concentration glucose /mU·g － 1 Pro
5． 6 mmol·L －1
glucose
16． 7 mmol·L －1
glucose
Control 9． 64 ± 0． 14 45． 50 ± 2． 98
4 mmol·L －1 alloxan 5． 81 ± 0． 13* 25． 44 ± 2． 37*
50 mg·L －1 SP + 4 mmol·L －1 alloxan 5． 99 ± 0． 09* # 26． 71 ± 1． 69*
100 mg·L －1 SP + 4 mmol·L －1 alloxan 6． 94 ± 0． 10* # 28． 22 ± 1． 91* #
200 mg·L －1 SP + 4 mmol·L －1 alloxan 7． 34 ± 0． 19* # 32． 76 ± 2． 40* #
400 mg·L －1 SP + 4 mmol·L －1 alloxan 7． 57 ± 0． 11* # 31． 74 ± 1． 43* #
800 mg·L －1 SP + 4 mmol·L －1 alloxan 7． 00 ± 0． 20* # 30． 95 ± 1． 39* #
* P ＜0. 05 vs control;#P ＜0. 05 vs alloxan
再用四氧嘧啶诱导胰岛细胞损伤后，进行低糖
和高糖刺激，检测各组胰岛素浓度。发现不论是高
糖诱导组还是低糖诱导组，接骨木多糖预处理后胰
岛素分泌量都高于四氧嘧啶组。
3 讨论
本研究分析了不同浓度接骨木多糖对胰岛细胞
细胞活性和胰岛素释放的影响。结果表明，接骨木
多糖可以促进 INS-1E胰岛细胞增殖，并且该促进作
用与浓度相关，在试验浓度范围内，100 mg·L －1浓
度对大鼠胰岛细胞增殖的促进作用最强。四氧嘧啶
对胰岛 β 细胞具有特殊的破坏作用，可以中止胰岛
素分泌。本实验中，我们用四氧嘧啶处理接骨木多
糖处理后的胰岛细胞，发现四氧嘧啶对胰岛细胞活
性具有明显的抑制作用，可以损伤胰岛细胞，而接骨
木多糖处理在一定程度上可以减轻这一损伤，其中
以 200 mg·L －1的作用效果最佳。
胰岛细胞可分泌胰岛素，胰岛素分泌降低表明
胰岛细胞功能受损。研究结果发现，接骨木多糖可
以抑制低糖诱导的胰岛素分泌，促进高糖诱导胰岛
细胞分泌胰岛素。对于四氧嘧啶诱导的胰岛细胞损
伤、胰岛素分泌减少，接骨木多糖也表现出了明显的
抑制作用。这一结果与王丹蕊等［7］得到的动物实
验结果相一致，表明接骨木多糖是通过调节胰岛细
胞的胰岛素分泌功能达到降糖作用的。
接骨木多糖的具体作用机制需要深入研究，并
对接骨木多糖结构进行测定和解析。
参考文献:
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Effects of Sambucus polysaccharides on rat
cell proliferation and insulin secretion
SONG Lin-liang，FU Jiang-nan
(Medical School，Jinan University，Guangzhou 510632，China)
Abstract:Aim To detect the effects of Sambucus
polysaccharides on the cell proliferation and insulin se-
cretion with cultured INS-1E β-cells． Methods Cell
viability of rat INS-1E β-cells was measured by CCK-8
after treatment with Sambucus polysaccharides in 5
days and after treatment with Sambucus polysaccha-
rides and alloxan;the concentrations of insulin were
detected after co -treatment with Sambucus polysaccha-
·5951·中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2011 Nov;27(11)
rides and alloxan using rat insulin ELISA kit． Conclu-
sion Sambucus polysaccharides can increase the pro-
liferation of rat INS-1E β-cells significantly，reverse
the damage on the function of INS-1E β-cells induced
by AXN，and increase the insulin excretion．
Key words:Sambucus;polysaccharides;proliferation;
insulin;secretion;rat
网络出版时间:2011 － 10 － 25 12:50 网络出版地址:http:/ /www． cnki． net /kcms /detail /34． 1086． R． 20111025． 1250． 021． html
褪黑素对大鼠急性酒精性肝损伤的作用
洪汝涛，陈世林，阮海玲，梅 俏，许建明
(安徽医科大学第一附属医院消化内科，安徽省消化病重点实验室，安徽 合肥 230022)
doi:10． 3969 / j． issn． 1001 － 1978． 2011． 11． 029
文献标识码:A 文章编号:1001 － 1978(2011)11 － 1596 － 04
中国图书分类号:R-332;R322． 47;R575． 022;R977． 1
摘要:目的 探讨褪黑素对大鼠急性酒精性肝损伤的作用及
机制。方法 采用乙醇灌胃法建立大鼠急性酒精性肝损伤
模型，生化法检测血清 ALT、AST 活性和肝匀浆 SOD 活性、
MDA含量，HE 染色观察肝脏病理形态学改变，免疫组化法
检测肝组织中 TNF-α和 IL-1β 表达。结果 褪黑素干预组
血清 ALT、AST活性明显低于模型组(分别为 P ＜ 0. 05，P ＜
0. 01) ;褪黑素干预组肝匀浆 MDA 水平较模型组明显下降
(P ＜ 0. 05) ，SOD活性较模型组明显升高(P ＜ 0. 05) ;光镜下
显示褪黑素干预组肝脏病理损伤有所减轻;褪黑素干预组肝
组织中 TNF-α和 IL-1β表达较模型组明显减弱(分别为 P ＜
0. 05 ，P ＜ 0. 01)。结论 褪黑素对大鼠酒精所致急性肝损
伤具有改善作用，其作用机制可能与抗氧化，以及减少 TNF-
α和 IL-1β的生成有关。
关键词:褪黑素;酒精性;肝损伤;氧化应激;肿瘤坏死因子-
α;白细胞介素-1β
褪黑素(melatonin，MT)是松果体分泌的激素之
一，体内许多组织器官和肿瘤组织［1］都有 MT 受体
分布，MT以受体依赖或非依赖的方式发挥广泛的
生物学作用。近年来发现褪黑素是一种高效的自由
基清除剂，其对急慢性肝损伤的保护作用国内外已
有研究和报道［2 － 5］。但 MT对急性酒精性肝病的防
治未见报道。本研究以急性酒精性肝损伤大鼠为模
收稿日期:2011 － 06 － 30，修回日期:2011 － 09 － 01
基金项目:安徽省高等学校 省 级 自 然 科 学 研 究 项 目 (No
2005KJ396ZC)
作者简介:洪汝涛(1961 －) ，男，博士，主任医师，副教授，硕士生导
师，研究方向:酒精性肝病;Tel:0551-2922262，2923216，
E-mail:hongrutaoah@ yahoo． com． cn;
许建明(1953 －) ，男，博士，教授，博士生导师，研究方向:
慢性肝病;Tel:0551-2922039，E-mail:xjm1017 @ yahoo．
com． cn
型，观察 MT对急性酒精性肝损伤的作用，并初步探
讨其可能的作用机制。
1 材料与方法
1． 1 动物 清洁级 SD♂大鼠 24 只，购自安徽省实
验动物中心，体质量(200 ± 20)g，标准环境适应性
饲养 1 周，给予正常饮食。
1． 2 主要药物、试剂 褪黑素系美国 Sigma 公司产
品，临用前以无水乙醇溶解，再加生理盐水稀释至所
需浓度(无水乙醇含量≤1%)。乙醇(分析纯)购自
上海中试化工总公司，使用前用蒸馏水配成 60%的
体积分数。MDA、SOD 检测试剂盒、考马斯亮蓝蛋
白测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。兔
抗鼠 TNF-α多克隆抗体、羊抗兔 IgG 二抗试剂盒、
DAB显色剂均购自武汉博士德生物工程有限公司，
兔抗鼠 IL-1β多克隆抗体购自北京博奥森生物技术
有限公司，内源性生物素阻断试剂盒购自福州迈新
生物技术开发公司。
1． 3 动物分组及处理 24 只♂ SD 大鼠随机分为
3 组:正常对照组、模型、对照组、褪黑素组，每组 8
只。各组每日灌胃前禁食 6 h，除正常组等量生理盐
水灌胃外，其余两组均乙醇灌胃 5 g·kg －1，每日 1
次，连续 5 d。褪黑素组在乙醇灌胃 1 h后再给予褪
黑素 50 mg·kg －1灌胃，在末次乙醇灌胃并禁食 6 h
后将全部大鼠以 3%戊巴比妥钠(1 ml·kg －1)麻醉
并处死，腹主动脉取血，并取出肝脏。血标本离心后
取上清，－ 20℃冷冻以备生化检测。取新鲜肝右叶
1 g，加入 9 倍体积生理盐水，于冰浴中制成 10%(1
∶ 9，W/V)肝匀浆，4℃ 1 420 × g 离心 15 min，取上
清 － 20℃冷冻以备检测 SOD 活性、MDA 含量。在
左肝叶同一部位，取一小块肝组织，用 10%中性甲
醛固定以备病理及免疫组化检查。
1． 4 大鼠血清转氨酶活性测定 采用瑞士 Roche
Modular DPP全自动生化分析仪测定大鼠血清谷丙
·6951· 中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2011 Nov;27(11) :1596 ～ 9