全 文 ：pentylenetetrazol(PTZ)byabdominocentesis, thenthespasmgradesofepilepsywereobserved, miceweredecollatedinodertosepartate
hippocampus.Changesofsuperoxidedismutase(SOD)activitiesandmalondiadehyde(MDA)contentsweredetected.Results:AFBmK(L)
evidentlydecresedthespasmgradesofPTZ-inducedepilepticmice(P<0.01).AFBmK(M)andAFBmK(H)excessivelydecresedthe
spasmgradesofepilepticmice(P<0.001).AFBmK(L), AFBmK(M)andAFBmK(H)allexcessivelyincreasedtheactivitiesofSOD(P
<0.001)anddecresedthecontentsofMDA(P<0.001).Conclusion:AFBmKhadastrongtherapyefectonPTZ-inducedepilepticmice.
ThereasonmaybethatAFBmKincreasedtheactivitiesofSOD, sothatoxidationresistinglevelisenhanced, theceloveroxidationisde-
creasedinhippocampuscells, andtherapyepileptic.
Keywords　 ButhusmartensicKarsch;epilepsy;superoxidedismute;malondiadehyde
猫须草提取物对黄嘌呤氧化酶的抑制作用＊
赵雪梅 ,谭昌恒 1 ,张　辉 2 ,费洪荣 ,王桂玲 ,王　聪
(泰山医学院药学院 ,泰安　271016;1中国科学院上海药物研究所 ,上海　201203;
2科技部中国农村技术开发中心 ,北京　100045)
　　摘　要　目的:研究猫须草不同提取物对黄嘌呤氧化酶活性的抑制作用。方法:将猫须草 、黄柏粉碎后依次用石油醚 、乙酸乙
酯 、无水乙醇和蒸馏水提取制备不同提取物 , 以别嘌呤醇和黄柏作为阳性对照 ,用黄嘌呤氧化酶(XOD)试剂盒测定不同浓度猫须草
不同提取物 , 在 37℃反应 20分钟后对黄嘌呤氧化酶活性的抑制作用。结果:猫须草乙酸乙酯提取物是抑制黄嘌呤氧化酶活性的有
效部位 , 其 IC
50
为 0.881 μg/ml, 黄柏水提物对 XOD活性抑制的 IC
50
为 136.745 μg/ml。结论:猫须草中乙酸乙酯提取物是抑制黄嘌
呤氧化酶活性的有效部位。
　　关键词　猫须草;黄嘌呤氧化酶
　　猫须草(Clerodendranthusspicatus(Thunb.)C.Y.Wu)民
间用于治疗急慢性肾炎 , 膀胱炎 , 泌尿系结石有较长历史 [ 1] 。
黄嘌呤氧化酶(XianthineOxidase, 简称 XOD)是人体内产生尿
酸过程中的关键酶 , 同时也是治疗痛风的药物作用靶点 , 别嘌
呤醇对该酶的活性具有较强的抑制作用 , 黄嘌呤氧化酶抑制剂
作为一类抗痛风药物具有很好的发展前景 , 它通过抑制黄嘌呤
氧化酶的活性 , 减少黄嘌呤向尿酸的转化 , 从根本上减少体内
尿酸的生成 , 从而达到治疗痛风的作用。本实验通过测定体外
药物对黄嘌呤氧化酶活性的抑制作用为药理模型 , 考察了不同
溶剂 、不同剂量的猫须草提取物对黄嘌呤氧化酶活性的影响 ,
为进一步分离纯化猫须草治疗痛风的活性成分提供依据。
1　材料与方法
1.1　 试验药物　猫须草采自云南西双版纳 , 由中国科学院上
海药物研究所谭昌恒副研究员鉴定。黄柏(Phellodendronchins-
eseSchneid.)药材购自安徽亳州。别嘌呤醇(Alopurinol)购自
美国 Sigma公司。
　　称取猫须草 、黄柏各 50.0 g,粉碎成粗粉 , 依次用石油醚 、乙
酸乙酯 、无水乙醇进行回流提取 ,蒸馏水制备水煎剂 , 每种溶剂
连续提取 3次 , 过滤。分别合并三次滤液 ,用旋转蒸发仪浓缩回
收溶剂 , 样品挥干 ,称重 , 得到猫须草水提物 、无水乙醇提取物 、
乙酸乙酯提取物和石油醚提取物 , 得率分别为 17.22%、 0.
69%、1.85%、0.92%, 黄柏为 14.09%、7.67%、2.97%、5.07%。
提取样品低温 、避光保存 , 备用。
1.2　试剂　黄嘌呤氧化酶(XOD)测定试剂盒购自南京建成
生物工程研究所第一分所;黄嘌呤氧化酶(32.12 U/ml)。
1.3　方法　
1.3.1　黄嘌呤氧化酶活力测定(A值的测定)　 XOD可催化
次黄嘌呤生成黄嘌呤 ,与此同时产生超氧阴离子自由基 ,当有电
子受体及显色剂存在的情况下 ,生成紫色化合物 , 根据后者在一
定时间内生成量的多少可以显示出酶的活力。实验操作参照黄
嘌呤氧化酶(XOD)测定试剂盒说明书。实验时测定管中加入
25μl的 XOD(0.0161U/25μl)溶液和 25 μlPBS(pH=7.50)缓
冲液 ,空白管加入 50 μlPBS缓冲溶液。两管中平行加入试剂
一至试剂四 ,混匀后 37℃水浴 20 min, 取出后加入试剂五(终止
液)混匀 , 530 nm处测定两管吸光度。为增加实验的准确性 , 本
操作平行进行 3次 , A值为测定管吸光度平均值减去空白管吸
光度平均值 , A值的大小反映酶活力的强弱。
1.3.2 　样品对酶活力的影响(B值的测定)　实验操作参照
黄嘌呤氧化酶(XOD)试剂盒说明书。测定管中依次加入 25 μl
XOD和 25μl不同浓度的样品溶液;对照空白管中加入 25 μl
PBS缓冲溶液和与测定管相同浓度的样品溶液。每个操作平行
进行 3次。 B值为测定管吸光度平均值减去空白管吸光度平均
值。B值反映加入抑制剂后酶活力的大小。
1.3.3 　XOD活性抑制百分率及半数抑制浓度(IC50)的计算
　以公式(1-B/A)×100%[ 4]计算不同浓度别嘌呤醇及 8种提
取物对 XOD活性抑制百分率。酶促反应体系中的药物浓度 C
45中药药理与临床 2009;25(3)
＊ 基金项目:山东省医药卫生计划面上项目(2007HW027);国家自然科学基金资助项目(30600780)
=C0 ×I/K× 25/2320。C0为原始样品溶液浓度 , K为稀释
倍数 , 25(μl)为反应体系中加入的样品溶液体积 , 2320(μl)为
反应体系总体积。采用 IC50计算器软件对不同浓度时对应的
XOD的活性抑制百分率进行数据处理 ,分别得到别嘌呤醇及两
种药用植物 8种不同提取物的半数抑制浓度 ,即 IC50。
2　结果
2.1　不同浓度的别嘌呤醇及黄柏提取物对 XOD活性的抑制
作用 　由表 1可知:不同浓度的别嘌呤醇及 4种黄柏提取物随
浓度增加 , 其对黄嘌呤氧化酶活性的抑制作用也增强。别嘌呤
醇溶液的 IC50是 4.935×10 -2 μg/ml;黄柏中水提物的 IC50最小
(IC
50
= 136.745 μg/ml), 对黄嘌呤氧化酶的活性抑制作用最
强 , 其次为石油醚提取部位(IC50 = 287.779 μg/ml), 黄柏中无
水乙醇提取物和乙酸乙酯提取物对黄嘌呤氧化酶活性的抑制
作用相当 , IC50分别为 332.692 μg/ml和 334.275 μg/ml。可见
黄柏水提物是对黄嘌呤氧化酶活性有抑制作用的有效部位。
2.2　猫须草提取物对 XOD活性的抑制作用　由表 1可知:4
种猫须草提取物随浓度增加对黄嘌呤氧化酶活性的抑制作用
也增强。乙酸乙酯提取物的 IC50最小 , 其 IC50为 0.881 μg/ml,
对黄嘌呤氧化酶活性的抑制作用最强;无水乙醇提取物对 XOD
的活性抑制作用次之(IC50 = 4.022 μg/ml), 石油醚提取物的
IC
50
为 19.042 μg/ml, 水提部位对 XOD活性的抑制效果最差
(IC50 =113.099 μg/mL), 可见猫须草中乙酸乙酯提取物是抑
制黄嘌呤氧化酶活性的有效部位。
2.3　猫须草及黄柏不同提取物对 XOD活性的 IC50比较　 IC50
是抑制率为 50%的药物浓度 ,是一个重要的参考指标 , IC
50
值越
小 ,说明药物的药效越强;IC50差异越大 , 两个药的药效差异也
就越大。从实验结果可以反映出 ,猫须草及黄柏 8种提取物中 ,
猫须草各提取部位的 IC50值均小于黄柏各提取部位的 IC50值 ,
说明猫须草对 XOD的活性抑制效果好于黄柏的效果。其中猫
须草乙酸乙酯提取物的 IC50数值上大于别嘌呤醇 , 但进一步分
离后有可能得到效果好于或接近于别嘌呤醇的活性成分。
　　表 1　不同浓度的别嘌呤醇及提取物对 XOD活性的抑制作用
样品名称 不同浓度样品及其对 XOD的抑制率
1 2 3 4 5
IC50
(μg/ml)
别嘌呤醇 浓度(μg/ml) 0.016 0.032 0.065 0.259 0.517 4.935×10-2
抑制率(%) 0.230 0.508 0.595 0.746 0.860
黄柏水提物 浓度(μg/ml) 50.512 202.047 565.733 727.371 808.190 136.745
抑制率(%) 0.400 0.519 0.584 0.620 0.864
黄柏无水乙醇提取物 浓度(μg/ml) 87.487 174.973 699.892 1399.785 2799.569 332.692
抑制率(%) 0.277 0.478 0.533 0.626 0.882
黄柏乙酸乙酯提取物 浓度(μg/ml) 135.911 272.821 543.642 1630.927 2174.569 334.280
抑制率(%) 0.398 0.450 0.552 0.720 0.903
黄柏石油醚提取物 浓度(μg/ml) 81.829 327.317 458.244 654.634 1309.267 287.779
抑制率(%) 0.262 0.403 0.600 0.714 0.868
猫须草水提物 浓度(μg/ml) 49.030 98.060 196.121 294.181 392.241 113.099
抑制率(%) 0.271 0.396 0.543 0.864 0.964
猫须草无水乙醇提取物 浓度(μg/ml) 0.711 1.423 5.691 182.112 364.224 4.022
抑制率(%) 0.282 0.469 0.516 0.769 0.913
猫须草乙酸乙酯提取物 浓度(μg/ml) 0.106 0.213 3.405 54.486 217.942 0.881
抑制率(%) 0.340 0.486 0.577 0.676 0.826
猫须草石油醚提取物 浓度(μg/ml) 4.622 18.487 36.975 73.949 295.797 19.042
抑制率(%) 0.331 0.396 0.585 0.652 0.962
3　讨论
　　本实验通过观察猫须草提取物对黄嘌呤氧化酶的抑制作
用 , 结果显示猫须草乙酸乙酯提取物的 IC50值较低 , 有较强抑制
黄嘌呤氧化酶活性的作用 , 具体何种有效成分在起作用 , 其具
体作用机制还有待进一步研究。曾有报告 [ 2]肾茶地上部位的
水溶性成分主要含有咖啡酸 、迷迭香酸等 , 迷迭香酸 、咖啡酸是
黄嘌呤氧化酶的竞争性抑制剂 [ 3] 。肾茶中含有 14个黄酮类化
合物 [ 4] 。 Cos等 [ 5]提出黄酮类化合物作为一类天然产物具有各
种生理和药理活性 , 并总结了其作为黄嘌呤氧化酶抑制剂的构
效关系。
　　杨澄等 [ 6]以小鼠血清尿酸水平和肝脏黄嘌呤氧化酶活性
为指标 , 评价黄柏生品和盐制品抗痛风作用 , 结果发现黄柏生
品和盐制品均可降低高尿酸血症小鼠血清尿酸水平 , 抑制小鼠
肝脏黄嘌呤氧化酶活性 ,具有抗痛风作用。 故本实验选用黄柏
作为中药阳性对照 ,并用系统溶剂法提取黄柏制备极性不同的
各提取物 , 通过 IC50的比较 , 发现黄柏中水提物的 IC50最小 , 具
有较强的直接抑制黄嘌呤氧化酶活性的作用。有文献报导黄柏
中水提物具有较强的清除氧自由基的作用 [ 7] 。由于在人体内
黄嘌呤和次黄嘌呤都能在黄嘌呤氧化酶的催化下生成尿酸和
超氧离子 ,所以本实验和已有研究证明黄柏水提物对黄嘌呤氧
化酶活性具有直接和间接的抑制作用 , 为进一步分离纯化药效
物质提供参考。
参考文献
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46 中药药理与临床 2009;25(3)
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4　李月婷 ,黄荣桂 ,郑兴中.肾茶的研究进展.中国中西医结合杂志,
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sificationofflavonoidsasinhibitorsofxanthineoxidaseandsuperoxidescav-
engers.JNatProd, 1998;61(1)∶ 71～ 76
6　杨澄 ,朱继孝 ,王颖 ,等.盐制对黄柏抗痛风作用的影响.中国中药杂
志, 2005;30(2)∶ 145 ～ 147
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作用.中国中药杂志 , 2001;26(4)∶245～ 247
血清药理学方法研究千里光抗大肠埃希菌的作用机制＊
张文平 1 ,刘波兰 2 ,李小花 1 ,王小丽 1 ,黄　真 1 ,张瑞其 1
(1病原生物学教研室 , 2组织胚胎学教研室　赣南医学院 ,赣州　341000)
　　摘　要　目的:应用血清药理学方法研究千里光抗大肠埃希菌的作用及其机制。方法:从千里光中分离出黄酮类化合物 , 然
后通过给小鼠灌胃制备千里光水浸液的含药血清和黄酮类化合物的含药血清。用扫描电镜观察各含药血清对大肠埃希菌超微结
构的影响 , 用同位素前体参入试验观察各含药血清对大肠埃希菌生物合成的影响。结果:与阴性对照血清相比 , 2种含药血清作用
后的大肠埃希菌 , 其形态和超微结构均发生明显的变化 , 表现为菌体表面粗糙 ,部分菌体出现缢痕 , 并在缢痕处缢缩或断裂等变化;
DNA、RNA、蛋白质和肽聚糖合成也受到明显的抑制。结论:千里光的抗大肠埃希菌作用机制可能是通过抑制细菌的 DNA、RNA、蛋
白质和肽聚糖的合成有关 ,其作用的有效成份可能是黄酮类化合物。
　　关键词　千里光;大肠埃希菌;扫描电镜;同位素参入;血清药理学
　　千里光(SenecioscandensBuch-Ham)系菊科千里光属植物 ,
性凉味苦 , 具有清热解毒 、消炎凉血 、明目止痛 、去腐生肌之功
效 , 民间广泛用于治疗各种炎症和皮肤病。其化学成分主要有
黄酮及其甙类 、鞣质 、生物碱等。现代药理实验表明 [ 1, 2]千里光
及其含药血清对大肠埃希菌等多种细菌均有较强的抗菌作用 ,
黄酮类化合物可能是千里光的主要抗菌有效成分。为了进一
步研究千里光的抗菌机制 , 本文采用血清药理学方法 , 以常见
的大肠埃希菌为研究对象 , 结合电镜技术 、同位素参入技术等
观察了千里光及其黄酮类化合物对受试菌超微结构以及 DNA、
RNA、蛋白质和肽聚糖等生物合成的影响。
1　材料与方法
1.1　试验药物　千里光购于赣南医学院第一附属医院中药
房 , 水煎并浓缩至生药 1g/ml;千里光总黄酮为本实验室提
取 [ 3] , 经我院天然药物化学教研室鉴定 ,总黄酮含量 >60%。
1.2　菌株　大肠埃希菌(ATCC25922)购于北京生物制品鉴定
所。取储藏菌少许接种于 MH琼脂平板 , 35℃培养 24 h使菌种
活化。次日取一接种环活化菌接种于 1 mlMH肉汤培养基中 ,
35℃培养 6 ～ 8 h,再取菌液 0.1 ml, 加入液体培养基至 100 ml,
稀释 1 000倍 , 调配菌液浓度为 5×105CFU/ml, 备用。
1.3　动物 　 BALB/c近交系小鼠 ,雌雄兼用 , 体重 20±2g,由
江西省实验动物中心提供。
1.4　试剂 　 同位素标记前体:3H-TdR(浓度:3.7×1010 Bq/L,
放射比强度:1.1×1015 Bqomo1);3H-UdR(浓度:3.7×1010 Bq/
L,放射比强度:6.7×1014 Bq/mo1);3H-亮氨酸(浓度:1.9×1010
Bq/L,放射比强度:2.2×1015 Bq/mo1);3H-葡糖胺(浓度:3.7
×1010 Bq/L,放射比强度:1.7 ×1015 Bq/mo1)均购于中国科学
院上海核技术开发公司。
1.5　方法
1.5.1　含药血清的制备 [ 2]　将小鼠随机分成 3组:千里光水
煎液含药血清组 、千里光总黄酮含药血清组和生理盐水阴性对
照血清组。分别灌胃给予千里光水煎剂(40g/kg)、千里光总黄
酮(200mg/ kg)和生理盐水 , 2次 /d, 共 5次 ,末次给药后 2h, 分
离血清 ,制备相应的含药血清。
1.5.2　含药血清体外抑菌试验 　将稀释 1000倍的菌液各取
0.1 rn1分别加入含药血清各稀释管中 , 置 35℃ 培养箱中培养
18～ 24h,观察各管的变化。如试管出现混浊 , 表明有菌生长 , 含
药血清无抑菌作用;如试管澄清 , 则表明无菌生长 , 含药血清有
抑菌作用 ,以含药量低而肉眼看不见细菌生长的那一管的含药
量为药物对该菌种的最低抑菌浓度(MIC),实验重复 3次。
1.5.3　 同位素前体参入试验 [ 4]　 三种受试血清均以 1 MIC
药物浓度作用于对数生长期的试验菌 , 均以 3H-TdR、3H-
UdR、3H-亮氨酸和 3H-葡糖胺 (终末浓度为均为 1.9 ×104 Bq/
Ll)进行同位素前体参入试验。在无菌的 96孔细胞培养板孔中
依次加入 90.0μl的药物(空白对照组用生理盐水代替药物),
100μl的菌液及 10μl的同位素前体物质 , 每个药物浓度均设三
个平行孔 ,然后置 35℃振荡培养 30min。用多头细胞收集仪收
集 ,将样品吸附在 49型玻纤滤纸上 , 烘干后于液体闪烁计数器
(BeckmanLS-5000TA)上进行 β 计数 , 测出每分脉冲数(cpm),
47中药药理与临床 2009;25(3)
＊ 基金项目:江西省教育厅科学技术项目 NO:2006-253