全 文 ：(和)形态法粗略观察不同添加量的空白血清对培养细胞的影
响 , 以确定正式实验时的血清添加量 [ 5] 。本实验中通过 M TT法
考察含有不同体积空白兔血清的培养液对培养细胞活性的影
响。结果发现 , 用含有 10%和 30%空白兔血清的培养液进行
H epG2细胞培养时细胞不能正常生长 , 与正常培养的细胞比
较 , 细胞的活性受到显著影响 , 故选取培养液体积的 20%作为
兔血清的加入量。
3. 2　番荔枝种子内酯提取物对人肝癌细胞株 H epG2的作用　
番荔枝(Annona squam osa Linn. )为热带地区著名水果 , 在中医
书籍中少有记载。在印度 , 番荔枝的种子 、叶子 、果实用作杀虫
剂 、毒鱼药和堕胎药。 《中国植物志》称其根可用治赤痢 、精神
抑郁 、脊髓骨病;果实可治恶疮肿痛 , 补脾。从番荔枝科植物中
提取有效成分抗肿瘤是当前世界范围内的研究热点。研究表
明 , 番荔枝科植物及其化学成分具有很好的抗肿瘤作用 , 其抗
肿瘤机理不同于现有的抗癌药物 , 系作用于线粒体干扰能量代
谢 , 而且无致突变性 , 并且对多药抗药性 (MDR)的肿瘤细胞有
显著的杀伤作用。其有效抗癌成分包括黄酮类 、生物碱类 、二萜
类 、苯乙烯内酯类 、多氧环己烯类 、番荔枝内酯类化合物等。本
实验选用番荔枝种子乙醇提取物的二氯甲烷部位 (即番荔枝总
内酯部位)制备含药血清进行试验 ,从 M TT比色试验结果看:
(1)低 、高剂量组含药血清作用于 H epG2细胞的抑制率呈现出
明显的时间和剂量依赖性 ,高剂量组的抑制率显著高于低剂量
组。 (2)含药血清作用 48h时 , 抑制率与药物的剂量呈正相关。
(3)含药血清作用 72h时 , 中剂量组的抑制率低于低 、高剂量
组 , 也低于本组 48h, 考虑可能是血药浓度与灌胃剂量或药效与
血药浓度并非呈完全的线性关系所致。 (4)5 -FU组含药血清
对细胞基本没有抑制作用 , 可能与 5 - FU口服吸收不规则 、血
药浓度下降迅速有关。
3. 3　对血清药理学方法的评价　目前中药复方研究中血清药
理学的方法已成为体外实验的主要方法。本实验研究番荔枝
种子内酯提取物在体外对肿瘤细胞的作用 , 采用文献通法 [ 4]制
备番荔枝总内酯部位的含药血清 , 血清在加入实验体系之前 ,
经 56℃30m in灭活 , 0. 22μm 微孔滤膜过滤除菌 , 去除了血清中
的大部分杂质和补体成分的干扰。经细胞毒性实验筛选发现 ,
加入 20%体积的经离心 、灭活 、过滤处理后的兔空白血清对实
验体系中的细胞活性无明显影响 , 表明实验从很大程度上避免
了血清中活性物质对实验结果的影响。
参考文献
1　章永红 ,韩英 ,夏东 ,等.光叶番荔枝提取物抗肿瘤作用研究.南京中
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究.上海中医药大学学报 , 2004;18(1)∶52～ 53
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通报 , 1999;15(6)∶569 ～ 570
5　刘建文 ,主编.药理实验方法学:新技术与新方法.北京:化学工业出
版社 ,第 1版 , 2003∶259～ 260
鸡矢藤提取物对酵母膏致小鼠高尿酸血症的影响*
颜海燕 ,马　颖 ,刘　梅 ,周兰兰
(安徽医科大学药理学教研室 , 合肥　 230032)
　　摘　要　目的:探讨鸡矢藤提取物(EPS)对酵母膏致小鼠高尿酸血症的影响及其作用机制。方法:采用酵母膏造模法造
成小鼠高尿酸血症模型 ,检测 EPS对正常小鼠和高尿酸血症小鼠血清尿酸水平和肝脏黄嘌呤氧化酶活性的影响;进一步从体外研
究 EPS对黄嘌呤氧化酶的抑制作用。结果:EPS对正常小鼠血清尿酸水平无明显影响 , 但可显著降低高尿酸血症小鼠的血清尿酸
水平 , 并能显著抑制其肝脏黄嘌呤氧化酶的活性;体外实验 EPS对黄嘌呤氧化酶也有明显的抑制作用 , IC
50
为 1. 00g /L。结论:EPS
可显著降低酵母膏致高尿酸血症小鼠的血清尿酸水平 ,其机制可能与抑制黄嘌呤氧化酶活性有关。
　　关键词　鸡矢藤;高尿酸血症;酵母膏;黄嘌呤氧化酶
　　痛风是嘌呤代谢紊乱所致的代谢性疾病 , 高尿酸血症为其
主要生化特征。排尿酸药物 、黄嘌呤氧化酶抑制剂等均可不同
程度地缓解高尿酸血症 ,控制痛风的病情发展。别嘌呤醇是目
前在临床上使用较多的黄嘌呤氧化酶抑制剂 , 但具有较为严重
的不良反应如肝炎 、超敏变态反应等 , 在一定程度上限制了其
安全使用。鸡矢藤提取物( Ex tracts o f Paederia scandens, EPS )
是从茜草科鸡矢藤属植物鸡矢藤中提取的一类有效成分 , 其主
要活性成份为鸡矢藤苷 、鸡矢藤次苷 、车叶草苷 、 r-谷甾醇及挥
发油等 ,本研究探讨鸡矢藤提取物对酵母膏致小鼠高尿酸血症
的影响及其可能的作用机理。
1　材料与方法
1. 1　试验药品　 EPS本教研室自制 , 棕黄色粉末;别嘌呤醇
(A llopurino l, AP), 上海信谊万象药业股份有限公司 , 批号:
061001,规格 100m g /粒 , 体内实验用时用蒸馏水配成所需浓度。
别嘌呤醇 (A llopurino l, AP), Sigm a公司产品 ,批号 046K0668, 供
115中药药理与临床 2007;23(5)
* 基金项目:安徽省优秀青年科技基金(06043095)
DOI牶牨牥牣牨牫牬牨牪牤j牣cnki牣zyy l牣牪牥牥牱牣牥牭牣牥牰牰
体外实验用。
1. 2　动物　昆明种小鼠 , 雄性 , 体重 25±2克 , 安徽医科大学
实验动物中心提供 , 动物合格证号:皖医实动准 01号。
1. 3　试剂　酵母膏 (Yeast ex trac t paste, YEP), 北京奥博星生
物技术有限公司 , 批号:20070301;黄嘌呤 (Xan thine, X) S igm a
公司产品 , 批号 096K5313;黄嘌呤氧化酶 (Xanthine ox idase,
XO) S igm a公司产品 , 批号 105K37851;氧嗪酸钾盐 (Po tassium
oxonate, OA)为 A ldrich Chem ica l Company产品 ,批号 17029KE ;
尿酸检测试剂盒 , 上海荣盛生物技术有限公司 , 批号 20061215。
1. 4　方法
1. 4. 1　EPS对正常小鼠的影响　小鼠 50只随机分组:生理盐
水组 、EPS组(6. 30、3. 15、 1. 57g /kg)及别嘌呤醇组 (40mg /kg)。
灌胃给药 , 每天一次 , 连续 14d。末次药后 1h从小鼠眼眶后静
脉丛采血 , 室温下自然凝血 1h,在 3500×g离心 10m in, 每份血
样取 200u l用于尿酸水平测定 ,采用磷钨酸还原法测定血清尿
酸 [ 2] , 具体方法参照试剂盒说明书。同时快速取其肝脏用于
XO活性的测定。
1. 4. 2　 EPS对酵母膏致高尿酸血症小鼠的影响　小鼠 60只
随机分 6组 , 用酵母膏为造模试剂建立高尿酸血症模型 [ 1] , 小
鼠灌胃(30g /kg d)连续 14天。造模后第 5d开始各用药组每
天灌胃给药一次 , 直至 14d。给药前 (0d)、3d、 7d、14d分别称量
动物体重一次。 14d给药后取血和肝脏组织进行尿酸和 XO活
性的测定。
1. 4. 3　 EPS对正常和酵母膏致高尿酸血症小鼠肝脏 XO活性
的测定　在 4℃快速取出小鼠肝脏 , 称重后加入 5倍体积的
4℃ 80mm o l /L磷酸盐缓冲液(pH 7. 4), 在冰浴中充分匀浆 , 并
在 4℃条件下 3000×g离心 10m in, 取上清液继续在 4℃条件下
10000×g离心 60m in,取上清液按照文献采用分光光度法测定
小鼠肝脏黄嘌呤氧化酶活性 [ 3] , 采用 Low ry方法测定上清液中
蛋白含量 [ 4] 。
1. 4. 4　鸡矢藤提取物在体外对 XO活性的影响 [ 5, 6] 　 用蒸馏
水配制 EPS、AP、X、XO分别为 8g /L、 9m g /L、 0. 15mmo l /L、 0. 1u /
mL,待用。取 X 1m l加磷酸盐缓冲液 (pH =7. 6)适量 , 在
295nm , 室温下测定光密度值。然后加人 XO 0. 1m l,振荡 5 m in,
在上述条件下测定光密度值 ,两者之差即为 A值。 在含 X 1m l
的各试管中分别加人 EPS及 AP , 然后各试管中加人磷酸盐缓
冲液(pH =7. 6)适量 , 使 EPS终浓度分别为 0. 40、 0. 80、 1. 60g /
L, AP浓度为 2. 4m g /L,置 295 nm 处测定光密度值。之后 , 在
每一试管中加人 XO 0. 1m l, 振荡 5 m in后在 295 nm处测定光密
度值 , 以加 XO后的光密度值 -未加 XO的光密度值为 B值。
XO活性用抑制百分率表示 , 公式为(1一 B /A)×100%。以
EPS (或 AP)浓度为横坐标 ,以相应 XO抑制百分率为纵坐标进
行线性回归 , 计算 XO抑制百分率为 50%时的药物浓度 , 即为
IC50。
2　结果
2. 1　 EPS对正常小鼠血清尿酸水平和肝脏黄嘌呤氧化酶活性
的影响 　与生理盐水组比较 , EPS各剂量可不同程度地降低正
常小鼠的血清尿酸水平 ,但无统计学差异。别嘌呤醇可以降低
正常小鼠血清尿酸水平 , 并有显著差异。与生理盐水组比较 ,
EPS各剂量对正常小鼠肝脏 XO活性无明显影响 , 别嘌呤醇可
显著抑制该酶活性 ,结果见表 1。
　　Tab 1　 E ffect o f EPS on the serum ur ic acid level and l iver xan-
thine oxidase activ ity o f norma lm ouse (–x±s, n=10)
G roup
Dose
(g /kg)
S erum uric acid
(mg /d l)
XO
(nm ol /m in /m g p r)
NS 3. 92±0. 87 4. 43±1. 06
AP 0. 04 2. 60±0. 46** 3. 43±0. 66*
EPS 6. 30 3. 53±0. 84 4. 39±0. 69
EPS 3. 15 3. 65±0. 28 4. 55±0. 81
EPS 1. 57 3. 73±0. 74 4. 35±1. 56
　　* P<0. 05, **P<0. 01 com pare w ithNS
2. 2　 EPS对酵母膏致高尿酸血症小鼠体重的影响　重复测量
资料方差分析 , F=179. 78, P<0. 01。相同时段内的多组间比较
采用单因素方差分析 , 0d、3d、7d各组之间比较无明显差异 , 14d
各组之间有明显差异。与生理盐水组比较 , 模型组小鼠的体重
无明显的变化;与模型组相比 , 别嘌呤醇组小鼠的体重显著下降
(P<0. 05)。同时在实验过程中观察到 ,别嘌呤醇组小鼠出现
体毛欠光泽 ,精神欠佳 , 其余各组皮毛白而润泽 ,活动自如 , 反应
灵敏 ,一般状态较好 , 结果见图 1。
　　F ig 1　 Effect o f EPS on body weight of hyperuricem ia m ouse in-
duced by yeast　　　* P<0. 05 com pare w ithM odel
2. 3　 EPS对酵母膏致高尿酸血症小鼠血清尿酸水平和肝脏黄
嘌呤氧化酶活性的影响　与生理盐水组比较 ,模型组血清尿酸
水平显著升高。与模型组相比 , EPS 6. 30、 3. 15、1. 57g /kg均可
显著降低高尿酸血症小鼠血清尿酸水平。别嘌呤醇亦可显著降
低高尿酸血症小鼠血清尿酸水平。与生理盐水组比较 , 模型组
XO浓度值有所升高 , 但无显著性差别。与模型组比较 , EPS 6.
30、3. 15、 1. 57g /kg均可显著抑制模型小鼠肝脏 XO活性 ,别嘌
呤醇亦可显著抑制该酶活性 , 结果见表 2。
　　Tab 2　 E ffect o f EPS on the serum ur ic acid level and l iver xan-
thine ox idase activity o f hyperuricem iam ouse induced by yeast(–x ±s, n
=10)
G roup
D ose
(g /kg)
Se rum uric a cid
(mg /dl)
XO
(nmo l /m in mg pr)
Inhibition
(%)
NS 3. 81±0. 17** 3. 75±0. 53
YEP +NS 30 4. 96±0. 45 4. 16±0. 23
YEP +AP 30+0. 04 3. 08±0. 25** 2. 32±0. 75** 44. 23
YEP +EPS 30+6. 30 3. 81±0. 31** 2. 56±0. 29** 38. 46
YEP +EPS 30+3. 15 4. 02±0. 29** 2. 85±0. 52** 31. 49
YEP +EPS 30+1. 57 4. 26±0. 26* 3. 06±0. 55* 26. 44
　　* P<0. 05, ** P<0. 01 comparew ithM ode l
2. 4　 EPS在体外对黄嘌呤氧化酶活性的影响　实验结果显示
116 中药药理与临床 2007;23(5)
EPS 1. 60、0. 80、 0. 40m g /m l对黄嘌呤氧化酶有显著的抑制作
用 , Linew eave r- Burk作图提示其为黄嘌呤氧化酶抑制剂 , 可以
显著抑制尿酸的生成 ,并呈一定的量效关系 , 结果见图 2。以抑
制剂浓度对抑制率作图得 EPS的半数抑制剂量( IC50)为 1. 00
g /L,结果见图 3。
　　F ig 2　 Linew eaver - Burk curv e of inhib itory effect of EPS on
xanthine ox idase
　　F ig 3　 D ose - effect relationsh ip of inh ibition effect of EPS on xan-
th ine ox idase
3 　讨论
　　酵母含有丰富的蛋白质 、核苷酸 、B族维生素等 , 在体内充
分水解能产生含氮的有机碱 (包括嘌呤碱类 、嘧啶碱类 )和磷
酸 , 当大剂量的酵母进入体内后 , 能干扰机体正常的嘌呤代谢 ,
致嘌呤代谢紊乱 , 其主要表现为黄嘌呤氧化酶活性增加 , 加速
了尿酸的生成 , 从而产生大量尿酸 ,参照文献 [ 1] , 本实验采用酵
母膏 30g /kg d灌胃连续 2wk,小鼠血清尿酸显著升高 , 与文献
相符 ,说明造模是成功的。
本实验结果显示 , EPS对正常小鼠血清尿酸水平无明显影
响 ,但可显著降低酵母膏致高尿酸血症小鼠的血清尿酸水平并
恢复至正常水平 ,且具有良好量效关系;而别嘌呤醇对正常小
鼠和高尿酸血症小鼠的尿酸水平均可显著降低 , 说明 EPS的作
用可能不同于别嘌呤醇 ,它只降低高尿酸血症小鼠的血清尿酸
水平。实验同时观察到 EPS对高尿酸血症小鼠的体重无明显
影响 ,而别嘌呤醇可明显降低小鼠的体重 , 对动物一般状态影
响较大 ,表明 EPS对动物的一般状态无明显影响。
黄嘌呤氧化酶在尿酸生成过程中发挥着重要作用 , 非嘌呤
类前体物质在体内经过一系列的转化生成嘌呤类核苷酸 ,继续
分解生成次黄嘌呤和黄嘌呤 , 最终经过黄嘌呤氧化酶的连续氧
化而生成尿酸。因此 ,黄嘌呤氧化酶是调控尿酸生成的最终环
节 ,在高尿酸血症的发病中占有重要的地位。本实验结果显示 ,
EPS体内用药对正常小鼠肝脏黄嘌呤氧化酶的活性无明显影
响 ,但可明显抑制高尿酸血症小鼠肝脏黄嘌呤氧化酶的活性。
EPS体外实验结果显示 , EPS可以抑制黄嘌呤氧化酶活性 , 并呈
一定的量效关系 , L ineweaver - Burk作图可以看出 EPS对黄嘌
呤氧化酶的抑制呈混合型抑制作用。本实验结果表明 EPS的
降尿酸作用很可能与其抑制黄嘌呤氧化酶的活性有关 , 但具体
机制还有待于进一步深入研究。
参考文献
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The Effect ofExtracts ofPaeder ia scandens on mouse hyperuricem ia induced by yeast
Yan H a iyan, M a Y ing, L iu M e i, Zhou Lan lan
(Departm ent of Pharm aco logy, Anhu iMedica lUnive rsity, H efe i　 230032)
　　Objec tive:To study the effec t of Ex tracts o f Paederia scandens(EPS) on m ouse hyperuricem ia induced by yeast and its mechanism s.
M ethods:A m ouse hype ruricem ia m ice w as estab lished by using yeast and the e ffec t of EPS on the serum uric ac id leve l and liver xanth ine
ox idase ac tivity o f no rm al and hyperu ricem iam ice was observed. The inhib ition e ffec t o f EPS on xan thine oxidase in v itrow as furthe r studied.
R esu lts:EPS has no effect on serun uric ac id of no rm al m ice but cou ld reduce the leve l of serum uric acid and significantly inhibit the liver
117中药药理与临床 2007;23(5)
xanthine ox idase in hyperuricem ian m ice. It shows tha t EPS could inhib it the xan thine ox idase in vitro( IC50 is 1. 00g /L). Conclusion:EPS
could reduce the leve l of serum uric acid in hype ruricem ia m ice and the effect is re la ted to its inh ib ition o f xanth ine oxidase.
　　K ey words　 Ex trac ts o f Paederia scandens;hyperu ricem ia;yeast;xanthine ox idase
金银花水提物对双歧杆菌 、乳杆菌生长的影响
冉域辰 1 ,黎海芪 2 ,刘明芳 3
(1四川省妇幼保健院儿保科 ,成都 　610031;重庆医科大学 2附属儿童医院儿保科 , 3医学检验系 ,重庆 　
400014)
　　摘　要　目的:探讨金银花水提物对双歧杆菌 、乳杆菌体外生长的作用。方法:制备金银花水提物浓度为 50%、25%、12.
5%、6. 25%、3. 125%、2%、1. 0625%的 BL肉汤和 MRS液体培养基;取两歧双歧杆菌 B if1101和保加利亚乳杆菌标准株悬液在药物
培养液中生长后接种到平板 ,作平板菌落计数;不同培养时间点测定稀释 10倍后含不同浓度金银花水提物的细菌培养液和对照组
细菌培养液的吸光度 (A)值 , 计算各培养基吸光度增加值( A);测定细菌培养液 20h 、24h时的 pH值。结果:当金银花水提物浓度
<6. 25%时 ,则显著高于对照组;金银花水提物浓度 >6. 25%,则显著低于对照组;乳杆菌培养液和双歧杆菌培养液 20h、24h的 A
分别在金银花水提物浓度≤6. 25%和≤3. 125%时高于对照组;金银花水提物浓度 <6. 25%时 , 则 pH值显著低于对照组;而金银花
水提物浓度 >6. 25%时则相反。结论:低浓度金银花水提物可以促进双歧杆菌 、乳酸杆菌在体外的生长。高浓度金银花水提物则抑
制双歧杆菌 、乳酸杆菌在体外的生长。
　　关键词　金银花;双歧杆菌;乳杆菌
　　双歧杆菌和乳杆菌是胃肠道正常微生物区系中的重要有
益菌并与宿主终生伴随 ,发挥营养 、免疫调节 、生物屏障 、维持肠
道菌群平衡等重要作用 [ 1] 。临床上应用双歧杆菌 、乳杆菌可以
调节 [ 2, 3]机体免疫 、辅助治疗或预防严重感染 、多种胃肠道炎症
和过敏性疾病。已有研究发现 [ 4, 5]许多中药和植物含有促进双
歧杆菌 、乳杆菌生长的成分。现代微生态学研究表明 [ 6]含有多
糖类的中药多具有双歧因子(bifidus factor, BF)样作用 , 可促进
双歧杆菌 、乳杆菌的生长。金银花提取物含有葡萄糖 、鼠李糖 、
木糖 、阿拉伯糖等多糖类物质 [ 7] , 本文在体外进行了金银花水
提物对双歧杆菌 、乳杆菌生长作用的研究。
1　材料
1. 1　试验药物　金银花购自贵州省中药材公司 ,经重庆医科大
学药学系生药教研室鉴定为黄褐毛忍冬。取生药 300g制成
300m l流浸膏 ,定为 100%浓度。
1. 2　试验菌种　两歧双歧杆菌 B if1101 (Bifidobacterium b ifi-
um)、保加利亚乳酸杆菌(Lactobac illus bulgraticus)由重庆医科
大学检验系临床微生物学教研室提供。
1. 3　方法　
1. 3. 1　药物液体培养基制备　将 BL肉汤和 M RS液体培养液
稀释为金银花水提物浓度为 50%、 25%、 12. 5%、 6. 25%、 3.
125%、 2%、1. 0625%的药物液体培养基 ,分别调 pH值至 7. 22、
6. 25、5m l /管分装 , 每一浓度 12管 , 同时以 5 m l /管无金银花水
提物的 BL肉汤和 MRS液体培养液各 12管( pH值分别调至 7.
22、6. 25)作为对照组 。
1. 3. 2　菌液制备　两歧双歧杆菌 Bif1101和保加利亚乳杆菌
经庖肉基复活后 ,各取一定的纯菌液分别接种于 5m l BL肉汤和
5m lMRS液体培养基中 , 37℃ 48小时厌氧培养后 ,无菌生理盐
水水洗 3次(2500rpm ×5m in), 用麦氏比浊管调整菌液浓度为 6
×108个 /m l,经纯菌检查证实为无污染的纯细菌悬液。
1. 3. 3　实验指标
　　平板菌落计数　取含不同浓度金银花水提物的药液培养
基和对照管 ,分别加入制备好的双歧杆菌 、乳杆菌悬液 0. 1 m l
厌氧培养 24小时。分别从管中取培养液 0. 1m l, 用大便稀释液
将其依次进行 10倍稀释至 10-7 , 每管选取 3个稀释度 , 厌氧培
养 48小时后作平板菌落计数 。细菌的活菌数用对数表示为
Log10CFU, 活菌数 = Log10[平均菌落数 (滴 )×50(滴)×稀释
倍数 ] 。
　　吸光度(absorbency, A)　双歧杆菌组和乳杆菌组分别在
波长 610nm、560nm处测定刚接种好菌液的不同浓度金银花水
提物的药液培养基和对照组培养基 , 稀释 10倍后的 A值即 A
0h。取同样的双歧杆菌 、乳杆菌细菌悬液按 0. 1 m l /管接种至不
同浓度的 BL肉汤 、MRS液体培养基 , 厌氧培养 20h 、 24h, 测定
各管培养液稀释 10倍的 A值即 A 20h、A 24h,求出各培养基在
0 - 20h、0 - 24h的 A增加值( A值 ), 即 A 20h=A 20h-A 0h,
A 24h=A 24h-A 0h。令 E=A样品-A对照 ,当 E﹥ 0, 提示对
细菌有增殖;若 E≤0, 提示对细菌无增殖 [ 4] 。
　　 pH值　含不同浓度金银花水提物的药液培养基和对照组
培养基各 12管 ,分别加入制备好的双歧杆菌 、乳杆菌细菌悬液
0. 1 m l, 厌氧培养 24 小时 , 于 20h、 24h时测定培养液的 pH
值 [ 8] 。
2　结 果
2. 1　双歧杆菌 、乳杆菌平板菌落计数　金银花水提物浓度为
6. 25%, 双歧杆菌 、乳杆菌菌落计数与对照组无显著差别;金银
花水提物浓度 >6. 25%, 双歧杆菌 、乳杆菌菌落计数降低;金银
118 中药药理与临床 2007;23(5)