全 文 ：土连翘体外抑制黄嘌呤氧化酶活性研究
杨增明 ,杨树娟
(昆明贝叶傣医药研究所 ,云南 昆明 650217)
　　摘要　目的:研究土连翘体外抑制黄嘌呤氧化酶(XOD)活性。方法:采用高效液相色谱法检测酶反应生成尿
酸的量 , 以甲醇-20 mmol/LK2HPO4缓冲液(pH7.5)(1∶99)为流动相 ,检测波长 290 nm。测定了土连翘及其不同
部位对牛奶和鼠肝来源的 XOD活性的抑制作用。结果:牛奶来源 XOD反应检测方法的重复性试验 RSD为
2.97%,平均加样回收率 101.77%, RSD为 2.87%;鼠肝来源 XOD的重复性试验 RSD为 3.72%, 回收率 98.23%,
RSD为 3.26%。土连翘抑制牛奶 XOD活性 IC50为生药浓度 1.569 mg/mL,除水溶部位对牛奶 XOD没有抑制活性
外 , 各部位对 2种来源 XOD均有抑制活性 , 但活性高低不同 , 同一部位对 2种来源 XOD的抑制活性有显著差异。
结论:该检测方法快速 、简便 、专属性强 、准确 、重复性好。土连翘能显著抑制 XOD活性 , 系多成分起作用。
关键词　土连翘;黄嘌呤氧化酶;活性;抑制
中图分类号:R285.5　　文献标识码:A　　文章编号:1001-4454(2010)06-0964-04
收稿日期:2009-06-29作者简介:杨增明(1965-),男,高级工程师 ,硕士 ,主要从事新药研发。
　　药材土连翘为金丝桃科植物西南金丝桃(Hpe-
ricumhenryiLevl.etVan.)的干燥地上部分〔1〕 ,又名
芒种花 、刘寄奴等 ,为傣族 、白族等云南少数民族习
用药材 ,具有清热利湿 ,活血通经 ,利尿通淋等功能 。
用于经闭不通 ,产后淤血 ,小便不利 ,跌打损伤 ,金疮
出血 ,水火烫伤 ,痈肿等 。民间亦常用于治疗鼻咽
癌 、喉癌 、肺癌 、咽喉疼痛 、腮腺炎 、风火牙痛 、口腔
炎 、血崩 、尿道炎 、疮痈 、跌打 、风湿 、疝气等 〔2〕。
黄嘌呤氧化酶(XianthineOxidase, XOD)是体内
核酸代谢中一种重要的酶 ,它催化黄嘌呤和次黄嘌
呤的氧化生成尿酸 ,并产生活性氧 ,包括 O-·2 、· OH、
H2O2 等。尿酸浓度过 高会导致高尿酸血症
(HUA),也是痛风发作的主要原因 。活性氧涉及到
炎症 、癌症和衰老等病理过程 ,在缺血-再灌注损伤 、
内皮及心肌损伤 、氧化应激相关疾病和心血管疾病
尤其是心力衰竭等疾病中发挥着重要作用 。黄嘌呤
氧化酶抑制剂(XOI),特别是中草药来源的 XOI,在
这些领域都有着广阔的应用前景〔3, 4〕。笔者在筛选
中草药来源的天然 XOI工作中 ,发现土连翘具有较
高的活性 ,现报道如下 。
1　材料与仪器
1.1　实验动物　SPF级 ICR小鼠 ,体质量(23±1)
g,购自昆明医学院实验动物中心 ,生产许可证号:
SCXK(滇)2005-0008。
1.2　药物与试剂　土连翘 ,购自菊花村药材市场 ,
经鉴定为金丝桃科植物西南金丝桃(Hpericumhenryi
Levl.etVan.);尿酸对照品(Sigma, U2625, HPLC纯
度 99.0%);黄嘌呤(上海瀚鸿化工科技有限公司 ,
批号 20071202, HPLC纯度 99.8%);别嘌醇(江苏
康希 制 药 有 限 公 司 , 批 号 H20080101, 含 量
98.1%);黄嘌呤氧化 酶 (Sigma, X4376, 批号:
126K3776,来源:牛奶);甲醇为色谱纯 ,其他试剂均
为分析纯 。
1.3　主要仪器　高效液相色谱系统:Agilent1100
高效液相色谱仪;G1311A四元泵带真空脱气机;
G1314A紫外检测器;G1316A柱温箱;AgilentChem-
station工作站 ,版本号 B.01.01C;0603手动进样器 。
2　方法与结果
2.1　供试品溶液的制备
2.1.1 　药材供试品溶液的制备:精密称定药材粗
粉约 1g,置 50 mL锥形瓶中 ,精密加入 50%乙醇 50
mL,称量质量 ,超声提取 30min,自然冷却后用 50%
乙醇补足减失的质量 ,混匀 ,滤过 ,精密量取续滤液
适量 ,蒸干 ,加 50 mmol/LTris-HCl缓冲液(pH8.0,
含 0.1‰ EDTA)溶解并稀释制成所需浓度的溶液 ,
滤过 ,取续滤液 ,即得。
2.1.2 　其他供试品溶液的制备:精密称取供试品
适量;或精密量取提取液适量 ,蒸干 ,加 50 mmol/L
Tris-HCl缓冲液(pH8.0,含 0.1‰ EDTA)使溶解并
稀释制成所需浓度的溶液 ,即得。
2.2　牛奶黄嘌呤氧化酶活性检测
2.2.1　色谱条件:ZORBAXSB-C18(4.6×250mm,
5 μm)色谱柱;甲醇-20 mmol/LK2HPO4 缓冲液
(H3PO4调 pH至 7.5)(1∶99)为流动相;检测波长
290 nm;柱温 25℃;流速 0.5mL/min。
2.2.2 　对照品溶液等相关溶液的制备:分别精密
称取尿酸对照品 、黄嘌呤氧化酶 、黄嘌呤 、别嘌醇各
适量 ,分别加 50 mmol/LTris-HCl缓冲液(pH8.0,
·964· JournalofChineseMedicinalMaterials　　第 33卷第 6期 2010年 6月DOI :10.13863/j.issn1001-4454.2010.06.043
含 0.1‰ EDTA)使溶解并稀释制成每 1 mL含 10
μg、0.5U、0.4 mg、4 μg的尿酸对照品溶液 、黄嘌
呤氧化酶溶液 、黄嘌呤底物溶液 、别嘌醇溶液 ,即
得 。
2.2.3　反应过程:量取黄嘌呤底物溶液 250 μL,
置 1.5mL离心管中 ,加入供试品溶液(或别嘌醇溶
液 ,或缓冲液)600 μL,混匀 , 37 ℃预热 15 min,加入
黄嘌呤氧化酶溶液 100μL,混匀 , 37 ℃反应 20min,
加入 4mol/LHCl溶液 25μL,混匀 , 5min后 ,加入 4
mol/LNaOH溶液 25 μL,混匀 ,滤过 ,即得供试品反
应液 、别嘌醇反应液和空白反应液。
2.2.4　测定法:分别精密吸取尿酸对照品溶液和
上述反应液各 10 μL,注入液相色谱仪 ,测定 ,计算 ,
即得。
2.2.5　抑制率计算:抑制率按下式计算。
抑制率(%)=(1-供试品反应液尿酸色谱峰面积空白反应液尿酸色谱峰面积 )×100%
2.3　鼠肝黄嘌呤氧化酶活性检测
2.3.1　鼠肝匀浆液的制备:取 ICR小鼠 2只 ,颈锥
脱臼处死 ,取出肝脏 ,分别称量质量 ,加入 5倍量预
冷至 2 ℃的 80 mmol/L焦磷酸钠 -磷酸缓冲液(pH
7.4),冰水浴中匀浆 ,合并匀浆液 , 4 000 r/min冷冻
离心 15 min,分取澄清液 ,立即用 0.45 μm微孔滤
膜滤过 ,分装 ,即得。 2 ～ 4 ℃下保存 , 3 h内使用。
2.3.2　反应过程:量取黄嘌呤底物溶液 250 μL,
置 1.5mL离心管中 ,加入供试品溶液(或别嘌醇溶
液 ,或缓冲液)400 μL,加入 20 mmol/L氯嗪酸钾溶
液 100 μL,混匀 , 37℃预热 15 min,加入鼠肝匀浆液
200μL,混匀 , 37 ℃反应 20 min,加入 4 mol/LHCl
溶液 25 μL,混匀 , 5 min后 ,加入 4 mol/LNaOH溶
液 25μL,混匀 ,滤过 ,即得反应液 。
2.4　检测方法研究及验证
2.4.1 　提取溶剂选择:取土连翘药材 , 按照
“ 2.1.1”项下的方法 ,分别以水 、50%乙醇 、乙醇 、甲
醇作为提取溶剂 ,依法制备每 1 mL含药材 4.0 mg
的供试品溶液 ,再照 “2.2”项下的方法 ,依法测定各
提取物的抑制活性 ,结果如表 1所示 , 50%乙醇提取
物的抑制活性最高 , 故选择 50%乙醇作为提取溶
剂。
　表 1 提取溶剂选择试验表(n=2)
提取溶剂 水 50%乙醇 乙醇 甲醇
抑制率(%) 20.98 64.91 52.51 58.33
2.4.2 　专属性试验:照 “ 2.2.3”项下的方法 ,以缓
冲液替代黄嘌呤氧化酶溶液;或按 “ 2.3.2”项下的
方法 ,以缓冲液替代黄嘌呤底物溶液 ,依法反应 、检
测 ,结果见图 1 C、D,结果表明 ,没有与尿酸色谱峰
保留时间相近的色谱峰 ,方法具有专属性。
2.4.3 　线性关系:取 1、5、10、50、100 μg/mL的尿
酸对照品溶液 ,分别各进样检测 2次 ,以尿酸浓度为
横坐标 ,峰面积为纵坐标 ,绘制标准曲线 ,得回归方
程 A=123.3144 C + 42.3840, 相关系数 r=
0.9997。尿酸浓度在 1 ～ 100 μg/mL范围内有良好
的线性关系。
2.4.4 　重复性试验:照 “ 2.1.1”项下的方法 ,取同
一批药材 6份 , 分别制备供试品溶液 ,浓度为每 1
mL含 3mg药材 ,或 4.5 mg药材 ,照 “2.2”或 “ 2.3”
项下的方法 ,依法反应 、检测 ,分别计算抑制率 ,结果
土连翘抑制牛奶 XOD活性反应 、检测方法重复性试
验的 RSD为 2.97%(n=6),鼠肝来源 XOD的 RSD
为 3.72%(n=6)。
2.4.5 　准确度试验:照 “ 2.2.3”或 “ 2.3.2”项下的
方法 ,以 20、40、60 μg/mL尿酸溶液替代黄嘌呤底
物溶液 , 分别依法反应 、检测各 3次 , 结果 , 牛奶
XOD反应 、检测方法的平均回收率为 101.77%,
RSD为 2.87%(n=9);鼠肝 XOD的平均回收率为
98.23%, RSD为 3.26%(n=9)。
2.5　IC50测定　照 “2.1.1”项下的方法 ,制备不同
浓度的供试品溶液 ,依法反应 、检测 。结果如表 2所
示 ,色谱图见图 1A、B。根据抑制曲线 ,土连翘体外
抑制牛奶 XOD活性 IC50为 1.569 mg/mL(反应液终
浓度)。
　表 2　　　　土连翘抑制牛奶 XOD活性
IC50测定结果(n=2)
终浓度 /(mg/mL) 2.4 1.8 1.2 0.6
抑制率 /% 64.91 54.72 41.64 25.87
图 1　土连翘抑制黄嘌呤氧化酶活性检测 HPLC色谱图
A.尿酸对照品　B.牛奶 XOD反应液　C.未加 XOD的反应液　D.鼠肝匀浆液
·965·JournalofChineseMedicinalMaterials　　第 33卷第 6期 2010年 6月
2.6　土连翘不同部位对 XOD活性的抑制作用　
取土连翘药材粗粉 50 g, 平均分成 4份 , 分别加
50%乙醇超声提取 3次 ,每次加溶剂 125 mL,超声
30 min,合并提取液 ,减压浓缩至 100 mL,依次用氯
仿 、乙酸乙酯 、正丁醇萃取 ,得萃取液 ,取样依法制备
供试品溶液 、反应 、检测 ,结果见表 3。剩余萃取液
减压浓缩 、真空干燥 ,分别得氯仿部位 0.3624 g、乙
酸乙酯部位 1.5049 g、正丁醇部位 2.1702 g和水溶
部位 1.7593g,以药材计 ,各部位收率见表 3。结果
表明 ,土连翘 50%乙醇提取物对牛奶 XOD活性和
鼠肝 XOD活性的抑制基本一致 ,除水溶部位对牛奶
XOD无抑制活性外 ,各部位对 2种来源 XOD均有
抑制活性 ,但活性高低不同 ,对总抑制活性的贡献也
不同 ,同一部位对 2种来源 XOD的抑制活性有明显
差异 。氯仿部位和乙酸乙酯部位对鼠肝 XOD的抑制
活性比对牛奶 XOD强 ,正丁醇部位则相反 ,就牛奶
XOD,氯仿部位的抑制活性较其他部位强 , 4种单体
成分的混合样品的抑制活性只占总活性的 20 ～ 30%。
　　表 3 土连翘不同提取物对 XOD活性的抑制作用(n=2)
供试品 50%乙醇提取物 氯仿部位 乙酸乙酯部位 正丁醇部位 水溶部位 混合对照品 别嘌醇
提取物收率(%) 11.59 0.72 3.01 4.34 3.52 - -
反应液终浓度(μg/mL) 208.80 13.04 54.18 78.13 63.34 ＊ 2.4
生药含量(mg/mL) 1.8 1.8 1.8 1.8 1.8 1.8 -
抑制牛奶 XOD活性(抑制率 , %) 52.98 9.73 17.62 25.23 0 10.15 56.68
抑制鼠肝 XOD活性(抑制率 , %) 50.88 17.68 26.75 10.83 8.57 14.86＊ 73.21＊
51 μg/mL(终浓度)溶液抑制牛奶 XOD活性(抑制率 , %) - 57.92 16.27 18.22 0 - -
　　注:＊分别含金丝桃苷 、芦丁 、槲皮素 、槲皮苷 0.146、0.214、 0.205、0.714μg/mL(经 HPLC检测 ,土连翘药材中 ,金丝桃苷 、芦丁 、槲皮素 、槲
皮苷含量分别为 81.31、 119.10、114.16、340.93μg/g。金丝桃苷 、槲皮素和槲皮苷主要存在于乙酸乙酯部位 ,芦丁在乙酸乙酯部位和正丁醇部
位中都有)
3　讨论
在 pH7.5的流动相中 ,尿酸在 291 nm波长处
有最大吸收 ,而黄嘌呤在 290 nm的吸收较弱 ,阴性
在此波长下无干扰 ,故较难选择 290nm作为检测波
长 。
以 pH7.5的缓冲液系统作为流动相 ,有利于碱
溶性化合物尿酸的溶解 ,并能抑制其离子化 ,系统中
含微量甲醇 ,有利于保护色谱柱 ,适当降低流速 、温
度 ,出峰时间相对延长 ,分离度提高。
　　XOI抑制 XOD活性检测 ,多采用紫外分光光度
法测定酶反应生成尿酸的量 〔5-11〕来计算抑制活性 ,
在 290 ～ 295 nm波长处测定 ,在此波长处 ,黄嘌呤 、
供试品溶液和酶溶液 /肝匀浆液等均有一定吸收值 ,
空白试验不能完全排除这种干扰 ,文献也均未进行
方法学验证 , 结果差异较大。本文参照文献方
法 〔12, 13〕 ,首次建立了中草药来源黄嘌呤氧化酶抑制
剂活性 HPLC检测方法 ,并进行了系统全面的方法
学验证 ,结果表明 ,该方法简便 、快速 、专属性强 、准
确 、可靠 ,重复性较好 ,可供筛选 XOI时应用 。笔者
采用此方法检测了土连翘 、越橘叶 、山茶 、金沸草 、土
木香等云南傣族等少数民族习用中草药 ,结果土连
翘具有较强的抑制活性 ,具有进一步研究价值 ,土连
翘不同部位抑制活性检测结果再次表明 ,中药是多
成分 、多靶点发挥作用 。
黄嘌呤氧化酶抑制剂别嘌呤醇作为临床上唯一
一种抑制尿酸生成的化学药物 , 已近 40年 ,直至
2008年 5月 、2009年 2月 ,欧盟和美国才分别批准
非布索坦(febuxostat,商品名 Uloric)上市 〔14〕 , 但其
疗效和安全性尚不令人满意 〔15〕。故研究者们一直
对黄嘌呤氧化酶及其抑制剂具有浓厚的兴趣 ,特别
是寻找高效低毒的中草药来源 XOI,更是研究的热
点 ,检测方法的建立 ,为进一步从中草药 、民族药中
广泛筛选高活性样本 ,深入研究其有效部位 、有效成
分及作用机制奠定了良好的基础 。
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跌打消肿贴的过敏性及急性毒性试验研究
林静吟 1 ,冯小映1 ,陈玉兴 2
(1.广州市越秀区正骨医院 ,广东 广州 510045;2.广东省中医研究所 ,广东 广州 510045)
　　摘要　目的:观察跌打消肿贴对动物皮肤产生的急性毒性反应及过敏性反应。方法:观察跌打消肿贴对新西
兰兔完整皮肤和破损皮肤短期接触因吸收作用而产生的急性毒性反应 ,及动物皮肤在重复接触跌打消肿贴后所产
生的变态反应在皮肤上的表现。结果:实验结果显示家兔皮肤用药 20 g/kg未见明显毒性作用 ,此剂量为临床用药
剂量(20g/d)的 60倍;同时在过敏性试验过程中 ,未发现实验动物有哮喘 、站立不稳或者休克等其他全身性过敏性
反应 , 以及药物组豚鼠皮肤与对照组皮肤镜下组织结构基本一致。结论:试验表明未发现跌打消肿贴对新西兰兔
皮肤有明显的急性毒性作用;而豚鼠过敏性试验 , 未发现跌打消肿贴对豚鼠皮肤有明显的致敏作用。
关键词　跌打消肿贴;急性毒性试验;过敏性试验
中图分类号:R285.5　　文献标识码:A　　文章编号:1001-4454(2010)06-0967-04
收稿日期:2009-10-09
　　“跌打消肿贴 ”是以我院长期临床应用传统膏
药 “跌打消肿膏”为基础改进而成 ,它是新型的透皮
增效剂型膏药 ,由药粉袋和含有增效剂的溶剂组成 。
该制剂含药量大 ,透皮性强 ,疗效持久 ,有效成分直
接透入肌肤 ,进入病变组织 ,具有清热解毒 ,活血化
瘀 ,消肿止痛的作用 ,主要用于各种跌打损伤 、陈旧
性扭伤 、挫伤 、关节脱位 、肿痛等 。
为了更好的了解 “跌打消肿贴 ”对皮肤的刺激
性和过敏性反应 ,本文通过观察动物皮肤在重复接
触跌打消肿贴后所产生的变态反应在皮肤上的表现
以及对新西兰兔完整皮肤和破损皮肤短期接触因吸
收作用而产生的毒性反应 ,为跌打消肿贴的临床应
用提供实验研究依据。
1　急性毒性试验 〔1, 2〕
1.1　材料与仪器
1.1.1 　供试品:跌打消肿贴(含增效剂)由本院制
剂室提供 ,批号:20090104。
1.1.2 　实验动物:新西兰兔 , 雌雄各半 , 体质量
2.0 kg左右 ,实验设施许可证号为 SCXK(粤)2008-
0002,动物合格证号为 0055268,由广东省医学实验
动物中心提供 ,本实验设施使用许可证号为 SYXK
(粤)2005-0059。
1.2　方法
1.2.1　药物准备:跌打消肿贴为临床制剂 ,药贴面
·967·JournalofChineseMedicinalMaterials　　第 33卷第 6期 2010年 6月