全 文 ：· · 中国马铃薯，第29卷，第1期，2015
病虫防治
Molecular Detection for Fusarium sambucinum on Potato
GAO Yunfei1, MIN Fanxiang1, WANG Wenzhong1, YANG Shuai1, WEI Qi1 , LU Dianqiu1*, GUO Mei1, LU Tao2
( 1. Virus-free Seedling Research Institute, Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences, Harbin, Heilongjiang 150086, China;
2. Heilongjiang Economic Crop Technical Guidance Station，Harbin, Heilongjiang 150090, China )
Abstract: F. sambucinum is the main pathogenic bacterium bringing about potato dry rot and causes economic losses to
some extent in Heilongjiang Province. Tests were made to the ITS sequence of Fusarium spp., Phytophthora infestans,
Alternaria solani and Rhizoctonia solani using the primer LDJ1, and 560 bp specific fragment was amplified only from Fusarium
spp.. Comparative analysis of BLAST was conducted on ITS sequence of F. sambucinum, F. avenaceum, and F. solani var.
coeruleum, and the specific primer L2 was designed. The target band amplified was 278 bp. The sensitivity of PCR detection
system based on this primer was 50 pg/μL for the target gene.
Key Words: potato；ITS；PCR；F. sambucinum；molecular detection
马铃薯接骨木镰刀菌的分子检测
高云飞 1，闵凡祥 1，王文重 1，杨 帅 1，魏 琪 1，吕典秋 1*，郭 梅 1，吕 涛 2
（ 1. 黑龙江省农业科学院植物脱毒苗木研究所，黑龙江 哈尔滨 150086；2. 黑龙江省经济作物技术指导站，黑龙江 哈尔滨 150090 )
收稿日期：2014-03-01
基金项目：科技部国际科技合作计划项目（2010DFA32810）；科技部“十二五”农村领域国家科技计划研究课题（2012BAD06B02）；哈尔
滨市科技攻关计划项目（2010AA6CN071）；现代农业产业技术体系专项资金资助（CARS-10-P14）；黑龙江省农业科技创新工程。
作者简介：高云飞（1984-），男，助理研究员，主要从事马铃薯真菌病害研究。
*通信作者（Corresponding author）：吕典秋，博士，研究员，主要从事马铃薯栽培生理和生物技术研究，E-mail: small_potatoes@126.com。
中图分类号：S532 文献标识码：B 文章编号：1672－3635（2015）01-0028-05
摘 要：接骨木镰刀菌是马铃薯干腐病的主要致病菌，给黑龙江省马铃薯造成了一定的经济损失。采用马铃薯
干腐病引物LDJ1对马铃薯干腐病、马铃薯晚疫病、马铃薯早疫病、马铃薯黑痣病的致病菌的 ITS序列进行测定，只
有马铃薯干腐病菌扩增出560 bp特异性片段。再分别对接骨木镰刀菌、燕麦镰刀菌和茄病镰孢变种的 ITS序列进行
BLAST比对分析，针对接骨木镰刀菌设计了特异引物L2，扩增特异性产物为278 bp，该引物所建立的PCR检测体系
可检测DNA含量在50 pg/μL以上的目的基因。
关键词：马铃薯；ITS；PCR；接骨木镰刀菌；分子检测
马铃薯干腐病是由镰刀菌（Fusarium spp．）引
起的一种真菌病害，可以导致薯块高度腐烂，是
马铃薯贮藏的主要病害之一[1]。在窖藏过程中，由
于窖温湿度适宜，干腐病会大面积发生，往往会
导致“烂窖”，一般年份损失率约 15%~35%，重灾
年高达 50%左右，已经给中国马铃薯产业造成了
巨大的经济损失[2]。目前，马铃薯的干腐病已经成
为影响黑龙江省马铃薯储藏和商品品质的重大病
害，导致其商品薯率大幅下降，严重影响其经济
和食用价值。不同国家报道的病原菌的优势种有
所不同，但报道接骨木镰刀菌（F. sambucinum）为
主要病原的文献较多 [3-5]。据研究，它也是黑龙江
省马铃薯干腐病主要致病菌之一[6]。依据镰刀菌的
rDNA区域保守序列设计特异性引物对马铃薯干腐
病主要病原菌进行了分子鉴定，并在此基础上进
行常规 PCR检测体系的建立，从而确立一套马铃
薯干腐病的快速、灵敏、准确的分子检测体系，
这些研究成果对于黑龙江省马铃薯真菌病害检测
28
· ·
水平的提高具有重要的实践指导意义。
1 材料与方法
1.1 供试菌株
本试验所用菌株（表1）均由农业部脱毒马铃薯
种薯质量监督检验测试中心（哈尔滨）提供，马铃薯
块茎样品2012年来自于重庆地区。
1.2 主要试剂和仪器
DNA提取主要药品：液氮、酚、氯仿、异戊
醇、无水乙醇、β-琉基乙醇、EDTA。
PCR及电泳所用药品：TaKaRa公司的 Premix
Taq，琼脂糖 Agarose购自 Spain，TaKaRa公司的
10x Loading Bufer、DNA Marker-DL2000。
主要仪器：PCR仪（TaKaRa公司），德国Sigma
高速冷冻离心机，金属水浴锅，北京六一仪器厂
DYY-8C型稳压稳流电泳仪、水平电泳槽，凝胶成
像系统Alpha Innotech。
1.3 主要方法
改良的SDS具体方法：
将单孢培养物接种于PDA培养基上，培养 7 d
以上，用接种针挑去菌丝。取50 mg菌丝在液氮中
研磨成粉末状，转入 1.5 mL离心管中。加 750 μL
DNA 抽提液 (1 mol/L Tris-HCl pH 8.0， 0.5 mol/L
EDTA，pH 8.0， l0% SDS，0.7313 g NaCl)，20 μL
β-巯基乙醇，充分混匀，68℃恒温金属浴 60 min。
加入 750 μL酚􀏑氯仿􀏑异戊醇（25􀏑24􀏑1），震荡混
匀，4℃， 13 000 r/min离心15 min。取上清，再加
入等体积的氯仿􀏑异戊醇（24􀏑1），轻轻颠倒均匀，
13 000 r/min，4℃离心15 min。取上清，加入-20℃
中存放的异丙醇，其体积是上清液的 2.5倍，放置
沉淀2 h以上。然后在13 000 r/min离心15 min，后弃
上清，留取沉淀物，再用70%的酒精洗涤沉淀3次，
将沉淀物晾干，晾干后加入100 μL无菌水溶解沉
淀。
常规PCR鉴定：
在 ITS区采用特异检测马铃薯镰刀菌干腐病引
物，扩增片段长度560 bp[7]。
利用Primer 5.0软件设计一对接骨木镰刀菌特
异性扩增引物，拟扩增片段长度278 bp。
以上两对引物均由上海生工合成。
反应体系：
Premix 12.5 μL
Forward Primer LDJ1 1.0 μL
Reverse Primer LDJ1 1.0 μL
DNA模板 1.0 μL
ddH2O补足至 25 μL
引物LDJ1反应条件：
预变性94℃ 90 s（变性94℃ 35 s，退火56℃ 30 s，
延伸72℃ 60 s）变性至延伸共35个循环，最后一次
延伸 72℃ 5 min，PCR 扩增产物 4℃冰箱保存备用
或送测序公司进行测序。
引物L2反应条件：
预变性94℃ 90 s（变性94℃ 35 s，退火59℃ 30 s，
延伸72℃ 60 s）变性至延伸共35个循环，最后一次
延伸72℃ 5min，PCR扩增产物4℃冰箱保存。
电泳检测：
PCR扩增产物用1.0%浓度的琼脂糖凝胶在1×TAE
下电泳，利用凝胶成像仪在紫外光下检测并拍照。
2 结果与分析
2.1 引物LDJ1特异性鉴定
由图1可知，在马铃薯干腐病的DNA特异性检
测中，镰刀菌引物扩增出特异性条带560 bp，而没
有其他马铃薯病害非特异性条带出现。
2.2 引物L2特异性检测
由图2可知，在接骨木镰刀菌的DNA特异性检测
中，唯有接骨木镰刀菌扩增出特异性条带278 bp，而
Forward Primer LDJ1: 5’-GTAAAAGTCGTAACAAGGTC-3’
Reverse Primer LDJ1: 5’-AAGTTCAGCGGGTATTC-3’
Forward Primer L2: 5’-CGCCAGAGGACCCAAACT-3’
Reverse Primer L2: 5’-GCCGCCAGAAGGGCAGAGC-3’
菌株
Fungi strain
茄病镰孢变种F. solani var. coeruleum
接骨木镰刀菌F. sambucinum
燕麦镰刀菌F. avenaceum
晚疫病菌Phytophthora infestans
黑痣病菌Rhizoctonia solani
早疫病菌Alternaria solani
采集地点
Site
克山
呼兰
讷河
呼兰
民主
民主
采集年份
Year
2007
2007
2007
2011
2011
2011
表1 供试菌株采集信息
Table 1 Information of Fungi strains collected
马铃薯接骨木镰刀菌的分子检测——高云飞，闵凡祥，王文重，等 29
· · 中国马铃薯，第29卷，第1期，2015
M：DL2000；1：马铃薯块茎对照； 2：水对照；3~4：马铃薯干腐病菌；5~6：马铃薯黑痣病菌；7~8：马铃薯早疫病菌；9~10：马铃薯晚疫病菌。
M：DL2000；1: potato tuber；2：water；3-4：Fusarium；5-6：Rhizoctonia solani；7-8：Alternaria solani；9-10：Phytophthora infestans.
图1 特异性鉴定
Figure 1 Specific identification
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
560 bp
M 1 2 3 4
278 bp
M：DL2000； 1：阴性对照； 2：接骨木镰刀菌；3：燕麦镰刀菌；4：茄病镰孢变种。
M：DL2000；1: negative control; 2: F. sambucinum; 3: F. avenaceum ; 4: F. solani var. coeruleum.
图2 接骨木镰刀菌特异性鉴定
Figure 2 Specific identification of F. sambucinum
其他镰刀菌没有扩增出特异性条带。
2.3 引物L2灵敏度检测
由图3可以看出，引物对镰刀菌DNA的检测灵
敏度随着DNA浓度的降低而降低，在50 pg/μl时达
到最低，此后无目的条带出现，因此，针对该引物
所建立的PCR检测体系可检测含量在50 pg/μl以上
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
278 bp
M：DL2000 Marker；1：阴性对照；2~13：250 ng/μL，100 ng/μL，50 ng/μL，10ng/μL，l ng/μL，100 pg/μL，50 pg/μL，10 pg/μL，1 pg/μL，
100 fg/μL，10 fg/μL，1fg/μL。
M: DL2000; 1: negative control; 2-13: 250 ng/μL, 100 ng/μL, 50 ng/μL, 10ng/μL, l ng/μL, 100 pg/μL, 50 pg/μL, 10 pg/μL, 1 pg/μL, 100 fg/μL,
10 fg/μL, and 1fg/μL.
图3 引物L2的灵敏度鉴定
Figure 3 Sensitivity of the primer L2
30
· ·
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
1～10：有干腐病症状的薯块；11~18：无干腐病症状的薯块。
1-10：Dry rot potato；11-18：Healthy potato.
图4 马铃薯块茎DNA的提取
Figure 4 Extraction of DNA from potato tuber
M -CK 11 14 15 16 17 +CK
560 bp
M：DL2000 Marker；-CK：阴性对照；+CK：阳性对照；11，14~17：无发病症状薯块的DNA的扩增产物。
M: DL2000 Marker; -CK: negative control; +CK: positive control; 11, 14-17: healthy potato template DNA.
图5 引物LDJ1对无病症的薯块的检测应用
Figure 5 Detection application of healthy tuber by primer LDJ1
M -CK -CK +CK +CK 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
560 bp
M：DL2000 Marker；-CK：阴性对照；+CK：阳性对照；1~10：有发病症状薯块的DNA的扩增产物。
M: DL2000 Marker; -CK：negative control; +CK: positive control; 1-10: dry rot potato template DNA.
图6 引物LDJ1对有病症的薯块的检测应用
Figure 6 Detection application of diseased tuber by primer LDJ1
的目的基因。
2.4 镰刀菌的PCR检测应用
采用改良的 SDS法从马铃薯块茎中提取总
DNA，在经过晾干后溶解在无菌水中，用 1%的琼
脂糖凝胶电泳进行 DNA的检验。从图 4中看出
DNA除了 12、13、18号样品未满足PCR分离基因
的要求，其余样品均能够满足要求，可以用于进
一步的试验。
采用镰刀菌rDNA-ITS特异引物LDJ1对马铃薯块
茎进行PCR检测，其中5个样品为无发病症状薯块的
DNA，扩增结果如图5所示。另外有10个样品为有发
病症状薯块的DNA，扩增结果如图6所示。
马铃薯接骨木镰刀菌的分子检测——高云飞，闵凡祥，王文重，等 31
· · 中国马铃薯，第29卷，第1期，2015
M -CK +CK 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 14 15 16 17
278 bp
M：DL2000 Marker；-CK：阴性对照；+CK：阳性对照；1~11，14~17：薯块的DNA的扩增产物。
M: DL2000 Marker; -CK: negative control; +CK: positive control; 1-11, 14-17: potato template DNA.
图7 引物L2对薯块的检测应用
Figure 7 Detection application of tuber by primer L2
从图 5和图 6可以看出，对于没有发病薯块
也可以扩增出 560 bp的特异性片段，这表明在这
些薯块中已经有镰刀菌的侵染，特异引物在马铃
薯块茎进行检测时，对于具有干腐病症状的块茎
都可以扩增出大小为 560 bp的特异性条带，由此
结果可以看出，以此特异性引物为基础的 PCR检
测方法，可以直接用于检测发病组织中的镰刀
菌。
2.5 接骨木镰刀菌的PCR检测应用
从图7可看出，特异引物L2在对马铃薯块茎进行
检测时，对15个薯块的DNA进行扩增，结果表明有8
号和16号2个薯块的DNA中可以扩增出大小为278 bp
的特异性条带，这表明接骨木镰刀菌为此次检测的部
分薯块的致病菌，由以上结果看出，此特异性引物为
基础的PCR检测方法，可以直接用于检测发病组织中
的接骨木镰刀菌。
3 讨 论
现在对镰刀菌的鉴定还是以形态学为主要手
段，但是由于其有一定的局限性，受培养环境等
因素影响。形态学鉴别既费时费力又程序繁琐，
而且菌株状态易于发生变化，培养物状态也具有
多样性，说明镰刀菌鉴定检测的工作复杂性，而
且不宜从发病初期的植株或块茎中分离鉴定出镰
刀菌，耗时长，难以做到对病害的早期检测。因
此，建立快速、准确的马铃薯真菌病害检测技术
具有重要的实际意义。
随着近几年的发展，分子生物学鉴定分类也迅速
发展，对ITS序列的研究不仅能解决许多形态学分类
研究中的疑难问题，而且在对植物病原菌的检测和鉴
定上起到了事半功倍的效果。利用ITS序列设计特异
性引物来鉴定镰刀菌种以在小麦、棉花、玉米等作物
上有成功例子，但国内鲜有报道[8-10]。本研究采用了
改良的SDS方法，提取效果与张宝俊等[11]、韩峰等[12]
报道相一致，进行扩增时也验证 LDJ1所建立的
PCR检测体系可检测含量在 1 pg/μL以上的目的基
因的可行性。特异性引物L2可对接骨木镰刀菌进
行检测，在L2所建立PCR检测体系可检测含量在
50 pg/μL以上的目的基因，可初步用于窖藏马铃薯
接骨木镰刀菌干腐病的检测。同时满足后续研究
的进行，进一步完善马铃薯镰刀菌检测鉴定技术
的研究工作，为马铃薯干腐病早期检测奠定理论
基础。本研究使用了接骨木镰刀菌、燕麦镰刀菌
和茄病镰孢变种等这三种菌，数量有限，有待于
后续研究完善。
[ 参 考 文 献 ]
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Characterization of Biological Properties of Pathogen of Potato Black Scurf
WANG Wenhui, LUO Degong, WEI Zhouquan*
( Dingxi Plant Protection and Quarantine Station, Dingxi, Gansu 743000, China )
Abstract: The potato black scurf is a soil-borne fungal disease, which happens in all of the areas of Dingxi. It is one
of the main factors influencing potato quantity and quality. This research was to characterize biological properties of the
pathogen causing potato black scurf in terms of temperature, illumination, carbon source, nitrogen source and pH value.
The mycelium grew the fastest at 25℃ and the slowest at 35℃ under dark conditions. When cultured for 1 d at 25℃ ,
treated with UV for 2 h, and then kept under light for 4 d at room temperature, the mycelium grew the fastest, while the
mycelium grew the slowest when kept under darkness for 4 d. The mycelium growth was affected by different sources of
carbon and nitrogen. Starch was the best carbon source and urea was the best nitrogen source for the mycelium growth.
The mycelium grew fastest when pH was set at 7.0.
Key Words: potato black scurf; mycelium; biological property
马铃薯黑痣病菌生物学特性测定
王文慧，骆得功，魏周全*
（甘肃省定西市植保植检站，甘肃 定西 743000 )
中图分类号：S532 文献标识码：B 文章编号：1672－3635（2015）01-0033-04
摘 要：马铃薯黑痣病是土传真菌性病害，在定西市马铃薯种植区均有发生，目前已成为影响马铃薯产量和品
质的主要因素之一。本研究对马铃薯黑痣病菌从温度、光照、碳源、氮源以及pH方面进行了生物学特性的测定。结
果表明：该病原菌菌丝在无光25℃条件下生长最快,在无光35℃条件下生长最慢；室温条件下培养1 d后用紫外线照
射处理2 h，然后室温持续光照培养4 d的菌丝生长速率最大，持续黑暗培养4 d的菌丝生长速率最慢；不同碳氮源对
该菌菌丝生长均有影响，碳源为淀粉的培养基上菌丝生长最快、氮源为尿素的培养基上菌丝生长最快；培养基pH中
性时菌丝生长速率最大。
关键词：马铃薯黑痣病；菌丝；生物学特性
马铃薯黑痣病菌生物学特性测定——王文慧，骆得功，魏周全
收稿日期：2014-05-20
基金项目：甘肃省星火项目（1205NCXJ219）。
作者简介：王文慧（1989-），女，助理农艺师，主要从事植保技术研究与开发。
*通信作者（Corresponding author）：魏周全，高级农艺师，主要从事植保技术研究与开发，E-mail: weizhouquan@126.com。
􀤃􀤃􀤃􀤃􀤃􀤃􀤃􀤃􀤃􀤃􀤃􀤃􀤃􀤃􀤃􀤃􀤃􀤃􀤃􀤃􀤃􀤃􀤃􀤃􀤃􀤃􀤃􀤃􀤃􀤃􀤃􀤃􀤃􀤃􀤃􀤃􀤃􀤃􀤃􀤃􀤃􀤃􀤃􀤃􀤃􀤃􀤃􀤃􀤃􀤃􀤃􀤃􀤃􀤃􀤃􀤃􀤃􀤃􀤃􀤃
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