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接骨木茎总黄酮的提取及 DPPH自由基清除活性
李安林 , 熊双丽＊
(西南科技大学生命科学与工程学院 , 绵阳　621010)
　　摘　要:主要采用乙醇浸提法 , 以乙醇浓度 、 提取时间 、 提取温度和料液比四因素三水平正交设计试验
优化接骨木茎黄酮的提取工艺 , 并初步研究了它的类型和二苯代苦味肼基自由基清除活性。结果表明 , 影响
接骨木茎总黄酮提取率的因素大小依次为提取温度 >料液比 >提取时间 >乙醇浓度。黄酮的最佳提取工艺:
乙醇浓度 95%, 料液比为 1 ∶20, 提取时间为 1h时 , 提取温度为 80℃。在此条件下 , 黄酮提取率可达
1.37%。紫外 -可见吸收光谱扫描 , 硼氢化钠 、 乙酸镁和浓硫酸化学显色鉴定它属于二氢黄酮 , 它具有较强
的 DPPH自由基清除活性 , 黄酮浓度的增加 , 清除率愈高 , 半数抑制浓度 IC50为 23.81μg/mL。
关键词:接骨木;总黄酮;提取工艺;DPPH自由基
中图分类号:TS202.1　　　文献标识码:A　　　文章编号:1006-2513(2010)05-0113-04
Extractiontechnologyandfreeradicalscavengingproperties
offlavanonefromsambucuswiliamsihance
LIAn-lin, XIONGShuang-li＊
(SchoolofLifeScienceandEngineering, SouthwestUniversity
ofScienceandTechnology, Mianyang621010)
Abstract:ThisarticlemainlyusedalcoholtoextractflavanonefromsambucuswiliamsiHance, andadoptedfourfac-
torssuchasextractingtemperature, theratioofsolventtomaterial, extractingtime, alcoholconcentrationforoptimi-
zingextractingtechnologyoftotalflavanonebyorthogonaldesignL9(34), andalsoexploredthetypeandDPPHfree
radicalscavengingrateofit.Theresultsexhibitedthatthesequencesoffactorsinfluencingwasextractingtemperature>
theratioofsolventtomaterial>extractingtime>alcoholconcentration.Thebestextractingtechnologywasasfolows:
theconcentrationofalcoholwas95%, therationofmaterialtoalcoholwas1∶20, theextractingtimewas1h, andthe
temperaturewas80℃.Itbelongtoflavononeprovedbyultraviolet-visiblespectrumandchromogenicreactionsuchas
sodiumborohydride, magnesiumacetateandconcentratedsulfuricacid.TheDPPHfreeradicalscavengingactivitywas
dependentontheconcentrationofit, andIC50was23.81μg/mL.
Keywords:sambucuswiliamsihance;totalflavanone;extractingtechnology;freeradical
黄酮化合物 (flavoniods)是自然界尤其是植
物界分布较广泛的一大类天然酚性化合物 , 毒副
作用小 , 具有抗癌 、 抗肿瘤 、 抗氧化 、 抗菌 、 抗
病毒 、 防治心血管疾病 、 免疫活性等药理功
效 [ 1 -2] , 已逐步成为功能性食品 、 食品添加剂和
天然药物开发利用的热点。接骨木 (Sambucus
收稿日期: 2009-12-23　　　　　＊通讯作者
基金项目:西南科技大学博士基金项目 (06zx7122)。
作者简介:李安林 (1977-), 男 , 讲师 , 研究方向为食品营养与安全。
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wiliamsiHance)为忍冬科接骨木属落地灌木或
小乔木 , 其化学成分具有促进骨折愈合 、 抗骨质
疏松 、 抗氧化 、 降血脂 , 以及提高学习记忆等生
物活性 。我国民间广泛用于治疗风湿麻痹 、 跌打
损伤 、 骨折 、黄疸 、 荨麻疹和水肿 [ 3] , 目前对接
骨木药理作用研究得较多 , 而对其黄酮类化合物
的提取及自由基清除活性研究鲜见报道。本文主
要采用正交设计试验优化接骨木茎黄酮的提取工
艺 , 并初步研究了它的类型和 DPPH自由基清除
活性 , 为接骨木茎的综合开发利用提供理论依
据 。
1　材料与仪器
原料:接骨木茎购自吉林省吉林市;
化学试剂:卢丁对照品 , 南京替斯艾么中药
研究所;DPPH自由基 (二苯代苦味肼基自由基 ,
2, 2-diphenyl-1-picry-hydrazylradical), sig-
ma公司;甲醇 、 乙醇 、 丙酮 、 硝酸铝 、 氢氧化
钠 、亚硝酸钠均为分析纯试剂;
主要仪器设备:UNICO7200可见分光光度计
(尤尼柯上海仪器有限公司);TU-1900型双光
束紫外可见分光光度计 (北京普析有限责任公
司);粗脂肪测定仪 (上海新嘉电子有限公司)。
2　实验方法
2.1　接骨木黄酮提取液的制备及提取工艺
分别称取 1g接骨木茎粉末于滤纸包 , 并置于
索氏提取器中 , 根据单因素和正交设计试验控制
因子进行浸提 , 得到不同条件下的提取液 , 再测
定黄酮含量 , 并计算出黄酮提取率。
正交设计试验:在单因素预实验基础上 , 对
影响提取率有较大影响的因素 (乙醇浓度 、 提取
时间 、 提取温度 、料液比)采用 4因素 3水平正
交设计试验 L9(34)正交表 (见表 1)。
表 1　正交试验的因子与水平
A(乙醇
浓度 , %)
B(料液比 ,
g/mL)
C(提取时
间 , h)
D(提取
温度 , ℃)
75% 1∶20 1 60
85% 1∶30 2 70
95% 1∶40 3 80
2.2　总黄酮提取率分析
标准曲线的绘制[ 4] :精密称取在 120℃恒温
干燥至恒重 , 并于干燥器内冷却至室温的芦丁标
准品 9.3mg, 加少量 30%乙醇水溶液 , 水浴微热
使其溶解 , 冷至室温 , 再用 30%乙醇定溶至
50mL容量瓶中 , 摇匀 , 配成浓度为 0.19mg/mL
的芦丁标准溶液 , 待用 。精密吸取标准芦丁对照
品 溶 液 0.00、 1.00、 2.00、 3.00、 4.00、
5.00mL, 分别置于 20mL具塞试管中 , 用去离子
水补加至 5mL, 然后分别加入 30%乙醇水溶液至
5mL, 摇匀后 , 各加 5%亚硝酸钠水溶液 0.3mL,
摇匀 , 静置 5min, 再加 10%硝酸铝水溶液
0.3mL, 摇匀后 , 静置 6min, 加入 4% NaOH溶
液 2.0mL, 摇匀 , 最后再加 2.5mL30%乙醇水溶
液。摇匀 , 放置 15min后 , 以第一管试剂溶液作
空白 , 于 510nm处分别测定其吸光度 , 以芦丁含
量为横坐标 , 吸光度为纵坐标绘制标准曲线 , 以
浓度对吸光度进行回归 , 计算回归方程:Y=
0.7953x+0.0063 (R2 =0.9991, Y=吸光值 , X
=芦丁质量 /mg)。
总黄酮提取率的计算:取 1mL浸提液于
15mL具塞试管中 , 其余操作项同 2.2, 测定其在
510nm处的吸光值 , 根据回归方程计算总黄酮类
化合物的提取率 (Y)。 Y(%) =A×V/10
式中 A为被测液中总黄酮质量 (mg), V为
浸提液体积 (mL)。
2.3　紫外可见吸收光谱
将一定浓度的黄酮提取液 , 用乙醇作参比
液 , 在 190 ～ 600nm波长范围内进行扫描 , 得到
紫外吸收光谱图。
2.4　接骨木黄酮的鉴定 [ 5]
向 1mL黄酮提取液中加入等量 2%硼氢化钠
甲醇溶液 1min后 , 加入数滴浓硫酸 , 根据颜色变
化判断黄酮总类;于滤纸上滴入 3滴黄酮提取液
后喷上 1%乙酸镁甲醇溶液 , 再在 55℃烘箱中烘
干后于 254nm紫外灯下观察荧光颜色;向 1mL黄
酮提取液中直接滴加浓硫酸 , 观察颜色变化。
2.5　接骨木茎黄酮清除 DPPH自由基活性的测
定 [ 5]
DPPH自由基是一种稳定的以氮为中心的质
子自由基 , 其乙醇溶液呈紫色 , 并在 517nm处有
强烈吸收 , 在有自由基清除剂存在时 , 自由基清
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除剂提供一个电子与 DPPH的孤对电子配对 , 而
使其褪色 , 褪色程度与其接受的电子呈定量关
系 , 在 517nm处的吸光度变小 , 其变化程度与自
由基清除程度呈线形关系 , 即吸光度越小 , 自由
基清除剂的清除自由基能力越强。分别测定不同
浓度的接骨木茎黄酮提取液加入 DPPH自由基后 ,
随时间延长的吸光值的变化情况 , 研究黄酮自由
基清除效率与时间的动力学关系 , 并由此选择反
应时间 , 并按以下公式计算黄酮对 DPPH自由基
的清除率。
K=[ 1-(Ai-Aj)/Ac] ×100%
式中 , K为接骨木茎黄酮对 DPPH自由基的
清除率;Ai为加试样反应后 DPPH溶液吸光度;
Aj为不加 DPPH, 只加试样的溶液的吸光度;Ac
为不加试样 , 加 DPPH的溶液的吸光度。以样品
浓度对清除率作图 , 根据拟合方程求出清除率为
50%时所需要样品的浓度 , 即半数抑制浓度 IC50。
3　结果与分析
3.1　接骨木茎黄酮的提取工艺优化
表 2说明影响黄酮提取量依次为:提取温度
>料液比 >提取时间 >乙醇浓度 (即 D>B>C>
A), 可见影响黄酮提取量最大的因素是提取温
度 , 其次是剂量比。根据实验结果 , 第 8号试验
(A3B2C1D3)所提取黄酮量最高 , 为 1.37%。因
此接骨木茎中黄酮提取的最佳工艺水平是
A3B2C1D3。
表 2　L9(34)正交试验
试验号 水平组合 A B C D 提取率 (%)
1 A1B1C1D1 75% 1∶20 1 60 0.31
2 A1B2C2D2 75% 1∶30 2 70 0.46
3 A1B3C3D3 75% 1∶40 3 80 0.97
4 A2B1C2D3 85% 1∶20 2 80 1.07
5 A2B2C3D1 85% 1∶30 3 60 0.60
6 A2B3C1D2 85% 1∶40 1 70 0.35
7 A3B1C3D2 95% 1∶20 3 70 0.59
8 A3B2C1D3 95% 1∶30 1 80 1.37
9 A3B3C2D1 95% 1∶40 2 60 0.47
K1 1.73 1.67 2.02 1.38
K2 1.74 2.43 1.70 1.40
K3 2.43 1.79 2.17 3.11
K 0.70 0.76 0.47 1.73
考虑到料液比为 1 ∶30时 , 浸提液体积较大 ,
后续的浓缩工作量大 , 所以又在乙醇浓度 95%、
提取时间 1h和温度 80℃的条件下 , 改变料液比 ,
即分别为 1∶20和 1 ∶30时做 8次重复试验 , 提
取率没有显著差异 , 所以从实际工作和生产成本
考虑最佳提取方案为 A3B2C1D3, 即提取接骨木
最佳提取条件为乙醇提取浓度为 95%, 剂量比为
1 ∶20, 提取时间为 1h, 提取温度为 80℃。
3.2　接骨木茎黄酮提取液的紫外可见吸收光谱
黄酮类化合物是一大类天然产物 , 广泛存在
于植物界 , 是许多中草药的有效成分 。在自然界
中最常见的是黄酮和黄酮醇 , 其它包括双氢黄
(醇)、 异黄酮 、 双黄酮 、 黄烷醇 、 查尔酮 、 橙
酮 、 花色苷及新黄酮类等 [ 6] 。大多数黄酮类化合
物在甲醇中的紫外吸收光谱由两个主要收带组
成 , 即吸收Ⅰ带 (300 ～ 400nm)和 Ⅱ带 (240 ～
280nm)。图 1发现 , 400nm以上都没有吸收峰 ,
说明无花色苷类和花色素类物质。从紫外光谱可
见在 270nm～ 290nm之间存在吸收峰 , 320 ～
350nm之间存在一个肩峰 , 说明该化合物更可能
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为二氢黄酮类物质。
表 3　总黄酮的显色反应
化学反应类别 显色变化
硼氢化钠 紫红色
乙酸镁 蓝色荧光
浓硫酸 紫红色
图 1　接骨木茎黄酮的的紫外可见吸收光谱
为进一步黄酮化合物类别 , 分别用不同化学
试剂进行显色反应。如表 2所示 , 硼氢化钠 -硫
酸显色后呈紫红色 , 说明该物质为二氢黄酮 , 结
合硫酸显色后呈紫红色 , 乙酸镁处理后呈现蓝色
荧光 , 紫外光谱中的两个吸收带 , 进一步证明该
类物质为二氢黄酮。
3.3　接骨木茎总黄酮清除 DPPH自由基活性
从图 2中可以看出 , 不加样品的 DPPH自由
基随着时间的增长其吸光度没有变化 , 说明它是
一种稳定的自由基 , 而加入不同浓度接骨木茎黄
酮的 DPPH自由基的吸光度随着时间的增长而逐
图 2　不同浓度黄酮清除 DPPH自由基的反应曲线
渐降低。同时 , 不同浓度样品的吸光值随时间延
长而呈现下降趋势 , 但是在 35min以后几乎都不
再有变化 , 说明反应已经达到平衡 , 所以在测定
自由基清除效果时 , 选择时间为 35min。
图 3　总黄酮对 DPPH自由基的影响
从图 3可以看出 , 接骨木茎总黄酮对 DPPH
自由基较强的清除作用 , 且随着总黄酮浓度的增
加 , 清除率愈高 , IC50为 23.81μg/mL。
4　结论
影响接骨木茎总黄酮提取率的因素大小依次
为提取温度 >料液比 >提取时间 >乙醇浓度 。黄
酮的最佳提取工艺:乙醇浓度 95%, 料液比为 1
∶20, 提取时间为 1h时。在此条件下提取率为
1.37%。紫外光谱和化学方法证明该类物质属于
二氢黄酮 , 它具有较强的 DPPH自由基清除活性 ,
黄酮浓度的增加 , 清除率愈高 , IC50为 23.81μg/
mL。我们下一步将继续研究其羟化位置和生物活
性 , 以最大程度地综合利用接骨木茎 。
参考文献:
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[ 6] KR, 马卡姆.黄酮类化合物结构鉴定技术 [ M] .北京:
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